MicroRNA-31-3p靶向調控Sema4C表達對宮頸癌順鉑耐藥性的作用及其機制研究*

張華章，黎婧，劉智慧

[華中科技大學同濟醫學院附屬武漢兒童醫院（武漢市婦幼保健院）婦一科，湖北 武漢 430019]

宮頸癌是排第4 位的女性常見癌癥，也是女性第二癌癥致死原因，女性中發病率僅次于乳腺癌[1]。臨床上，手術、放射治療和化學藥物治療（以下簡稱化療）已被廣泛用于提高宮頸癌患者的生存率。但由于原發性和繼發性化療耐藥的產生，晚期宮頸癌患者的5 年生存率仍然很低。深入研究宮頸癌患者化療耐藥發生、發展的機制，有利于提高預后水平。大量研究表明，microRNA（miRNA）在腫瘤細胞進展過程中發揮關鍵作用，如癌細胞生長、凋亡和轉移[2]。MicroRNA-31-3p（miR-31-3p）在多種癌癥組織中異常表達，如結腸癌[3]、口腔癌[4]和腦膠質瘤[5]。miR-31-3p 在宮頸癌中低表達，并且通過Mirbase 數據庫篩選發現Sema4C 是miR-31-3p 的靶基因。有研究證明，Sema4C 可調節宮頸癌上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）及對順鉑化療的敏感性，但其相關機制尚不清楚[6-7]。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人宮頸癌細胞系Hela、人正常宮頸細胞系、RPMI 1640 培養液、PCR 引物購自南京擎科生物科技有限公司，PCR 試劑盒（濟南諾維贊生物科技有限公司），miR-31-3p mimics（廣州銳博科技有限公司），Sema4C 過表達質粒（上海吉凱基因科技有限公司），LipofectamineTM3000 轉染試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司）、CCK-8試劑（日本東仁化學科技有限公司），抗Sema4C、GAPDH、山羊抗兔IgG HRP二級抗體購自美國Abcam公司，BCA蛋白質分析試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.2 主要儀器

細胞培養培養箱、實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRTPCR）儀（Step One Plus）、多功能酶標儀、低溫高速離心機、高速低溫離心機、-80℃冰箱購自美國Thermo Fisher Scientific 公司，電泳儀、轉膜儀購自北京六一儀器廠，化學發光檢測儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 將人宮頸癌細胞Hela 和人正常宮頸細胞放入RPMI 1640 培養液，內含10% FBS，100 IU/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，培養液放置于37℃、5%二氧化碳增濕培養箱中。

1.3.2 細胞轉染 取對數生長期Hela細胞均勻接種在6孔板中。將Opti-MEM培養基預混LipofectamineTM3000 試劑，分別轉染 m iR-31-3p mimics（miR-31-3p mimics 組）、空白質粒（對照組），以及在轉染miR-31-3p mimics 的基礎上過表達 Sema4C（miR-31-3p mimics＋Sema4C 組）10～15 min，繼續置于恒溫培養箱中靜置培養2～3 d，用于后續實驗。

1.3.3 qRT-PCR檢測miR-31-3p的表達 分離并純化Hela 細胞、人正常宮頸細胞總RNA，檢測RNA純度并逆轉錄成cDNA，按照PCR 試劑盒說明書進行qRT-PCR。反應體系：SYBER Green Mix 10 μL、正反向引物（10 μ mol/L）各 0 .5 μ L、cDNA 2 μL、H2O 2 μL。PCR 反應條件：95℃預變性 5 min，94℃變性45 s，62℃退火 4 5 s，72℃延伸 1 min，共 4 0 個循環，60℃繼續延伸 2 5 min。以U6為內參基因，2-ΔΔct法計算相對表達量。qRT-PCR引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 Western blotting 檢測Sema4C 蛋白的表達 收集Hela 細胞并在RIPA 緩沖液中溶解。使用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到硝化纖維素膜上。BSA 封閉后，用抗Sema4C 和GAPDH 的一抗孵育，山羊抗兔IgG HRP 的二抗（1∶2 000）處理條帶，并使用化學發光物質檢測條帶。

1.3.5 CCK-8 法檢測細胞吸光度 取對數生長期miR-31-3p mimics 組、對照組、miR-31-3p mimics+Sema4C 組Hela 細胞，消化分離并加入完全培養基重懸，制成細胞懸液，種植于96 孔板中，每孔約3 000個細胞。按比例配制 1 μ mol/L、2 μ mol/L、3 μmol/L、4 μmol/L、5 μmol/L、6 μmol/L 順鉑。取出兩組原有培養基，加入含相應濃度藥物的培養基，細胞在37℃、5%二氧化碳CO2培養箱內培養24 h。除去培養基，配制CCK-8 工作液，每孔加入100 μL CCK-8 溶液，細胞在培養箱內培養1～5 h。用酶標儀測定450 nm 處的吸光度，計算細胞生存率。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0 和Graphpad Prism 8.0統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hela細胞中miR-31-3p的表達

qRT-PCR結果表明，Hela細胞與人正常宮頸細胞miR-31-3p 相對表達量分別為（0.43±0.32）和（1.06±0.12），經t檢驗，差異有統計學意義（t=3.193，P=0.033），Hela細胞miR-31-3p低于人正常宮頸細胞。

2.2 miR-31-3p靶向調控Sema4C的表達

利用生物信息學方法預測miR-31-3p 可靶向結合Sema4C基因（見圖1）。qRT-PCR 結果表明，對照組、miR-31-3p mimics 組、miR-31-3p mimics+Sema4C組 miR-31-3p 相對表達量分別為（1.05±0.32）、（2.11±0.49）和（2.08±0.32），經方差分析，差異有統計學意義（F=12.280，P=0.001）。進一步兩兩比較結 果 ：miR-31-3p mimics 組 、miR-31-3p mimics+Sema4C 組 miR-31-3p 相對表達量高于對照組（P＜0.05）；miR-31-3p mimics 組 與 miR-31-3p mimics+Sema4C 組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 miR-31-3p靶向結合Sema4C基因

對 照 組 、miR-31-3p mimics 組 、miR-31-3p mimics+Sema4C 組Sema4C 蛋白相對表達量分別為（1.02±0.25）、（0.41±0.24）和（0.66±0.13），經方差分析，差異有統計學意義（F=10.296，P=0.002）。進一步兩兩比較結果：miR-31-3p mimics 組、miR-31-3p mimics+Sema4C 組Sema4C 蛋白相對表達量低于對照組（P＜0.05）； miR-31-3p mimics+Sema4C 組 高 于miR-31-3p mimics組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 Hela細胞中Sema4C蛋白的表達

2.3 不同濃度順鉑作用下各組Hela細胞生存率比較

CCK-8 法結果表明，不同濃度順鉑作用下，對照組、miR-31-3p mimics 組、miR-31-3p mimics+Sema4C組Hela 細胞生存率比較，經方差分析，差異均有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較：miR-31-3p mimics 組 H ela 細胞生存率低于對照組（P＜0.05）；2 μmol/L、3 μmol/L、4 μmol/L、5 μmol/L 順鉑作用下，miR-31-3p mimics+Sema4C 組 H ela 細胞生存率高于 m iR-31-3p mimics 組（P＜0.05），表明 m iR-31-3p調控Hela 細胞鉑類耐藥，過表達Sema4C 可抑制miR-31-3p 的作用。見表2。

表2 不同濃度順鉑作用下各組Hela細胞的生存率變化 （%，）

表2 不同濃度順鉑作用下各組Hela細胞的生存率變化 （%，）

組別對照組miR-31-3p mimics組miR-31-3p mimics+Sema4C組F 值P 值1 μmol/L順鉑100.00±0.00 100.00±0.00 100.00±0.00 2 μmol/L順鉑95.32±7.63 76.81±7.24 88.23±3.54 10.622 0.002 3 μmol/L順鉑83.58±7.63 66.89±4.38 76.25±3.45 11.755 0.001 4 μmol/L順鉑75.32±7.63 49.86±10.53 65.45±3.45 13.656 0.000 5 μmol/L順鉑63.25±7.24 32.18±2.58 38.23±6.54 39.961 0.000 6 μmol/L順鉑47.86±6.78 27.34±6.21 27.68±5.23 18.510 0.000

3 討論

有研究表明，宮頸癌的發生與人乳頭狀瘤病毒感染有關[8]。隨著宮頸癌組織的病理檢查和早期診斷的加強，已顯著降低了該病的發病率和病死率[9]，但宮頸癌仍然是威脅女性健康的第2 大因素。對晚期患者，宮頸癌耐藥的產生是限制患者預后的主要因素之一。目前已有大量關于宮頸癌的研究，但宮頸癌耐藥發生、發展的具體機制仍不清楚。

目前越來越多的證據表明，miRNA 在多種腫瘤和其他疾病的診斷、治療及預后中發揮重要作用[10-11]。例如，miR-146a-5p 在多種腫瘤中異常表達，并且miR-146a-5p 可能作為一種非侵入性生物標志物對多種腫瘤有靶向治療有用[12]。miR-31-3p編碼基因位于染色體9p21.3，參與多種腫瘤細胞的發生、發展。在腦膠質瘤中，miR-31-3p 扮演了重要角色，過表達miR-31-3p 可顯著降低MAD2L1 表達，并且通過生物信息學技術分析得出miR-31-3p 的靶基因涉及細胞增殖、轉錄及腫瘤等信號通路[5]。有研究證實，通過下調STAT3 的表達，miR-31-3p 還可抑制橫紋肌肉瘤細胞增殖和遷移[13]。在結腸癌中，miR-31-3p 表達水平可作為西妥昔單抗對RAS-WT mCRC 患者療效的預測性生物標志物[14]。同樣在結腸癌中，與miR-31-3p 高表達患者相比，在預處理活檢中miR-31-3p 低表達的患者有更高的總有效率，以及更高無進展生存率和總生存率[3]。

本研究結果表明，miR-31-3p 在宮頸癌細胞中低表達，與多種癌癥中的表達一致；上調miR-31-3p的表達可顯著提高宮頸癌細胞對順鉑的化療敏感性。本研究采用生物信息學技術預測了miR-31-3p可靶向調控Sema4C的表達，并進一步驗證miR-31-3p通過靶向調控Sema4C 的表達，影響宮頸癌細胞對順鉑的耐藥性。本研究不僅探究miR-31-3p 在宮頸癌順鉑化療中產生耐藥的機制，同時也證實Sema4C 表達的調控機制。

Sema4C 的高表達能顯著降低宮頸癌細胞對順鉑的化療敏感性[7]。更有研究證明，Sema4C 可促進宮頸癌細胞的侵襲和轉移[6]。Sema4C 參與多種腫瘤的發生、發展，也是許多miRNA 的靶點，包括miR-125b、miR-25-3p、miR-205、miR-138 及miR-31。Sema4C 參與EMT 介導的許多惡性腫瘤的化療耐藥，包括乳腺癌、宮頸癌、肝癌和肺癌。miR-125b 在乳腺癌、肺癌中的異常表達和miR-25-3p 在CC17 中的異常表達可顯著逆轉EMT 表型，并通過下調Sema4C表達調節疾病進展，完全緩解誘導的EMT。有研究證明，Sema4C 可通過p38-MAPK 影響卵巢癌細胞增殖[15]；在乳腺癌中，Sema4C 在與腫瘤相關的淋巴管內皮細胞中高表達，可介導腫瘤淋巴轉移，影響乳腺癌細胞增殖，還可以作為乳腺癌的重要標志物[16-17]；在結腸癌中，Sema4C 的過度表達導致大腸癌細胞的侵襲和遷移率升高[18]；在腦膠質瘤中，Sema4C 的表達受miR-138 靶向作用，并促進腦膠質瘤細胞侵襲和轉移[19]。這些結果都表明靶向Sema4C 可作為逆轉腫瘤化療耐藥的新途徑。

綜上所述，miR-31-3p 通過靶向調節Sema4C 的表達，調控宮頸癌細胞對順鉑的耐藥性。本研究為宮頸癌的治療提供了新的靶點和理論基礎。