小核仁RNA宿主基因5對骨髓間充質干細胞成骨分化和凋亡的影響*

蔣海濤，鄭紀偉，李芳，張愷，秦瑩，夏江瀾，孫晉虎

（徐州醫科大學口腔醫學院，江蘇 徐州 221018）

骨質疏松癥是一種代謝性和系統性的骨骼疾病，常見于老年人和絕經后婦女[1]。該病可累及頜骨，表現為頜骨骨量減少，微建筑骨結構破壞，骨脆性增加。研究表明，骨質疏松癥患者與牙周炎患者的附著喪失和牙槽骨骨丟失高度相關，因此認為改善骨質疏松是牙周炎防治的一個關鍵因素[2]。研究表明，骨質疏松癥對口腔種植體近中和遠中的邊緣骨丟失有顯著影響[3]，因此其也是種植體周圍炎的潛在影響因素。所以控制骨質疏松對臨床維持頜骨高度、改善種植修復條件、防治牙周病、提高患者生活質量具有重要意義。既往研究[4-5]表明，骨髓間充質干細胞的異常分化導致骨平衡紊亂，最終導致骨質疏松癥。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）功能紊亂目前已得到相當多的關注，越來越多的研究揭示了lncRNA 在包括骨質疏松癥在內的多種疾病中的作用越來越大[6-7]。小核仁RNA 宿主基因5（small nucleolar RNA host gene 5,SNHG5）是一個位于6q15染色體上，長度為524 nt 的lncRNA。已有研究發現SNHG5在惡性腫瘤中發揮作用[8-10]，而在成骨機制中的作用研究較少，有待進一步揭示。本研究試圖揭示SNHG5對骨髓間充質干細胞分化和凋亡的調控作用，有待其成為頜骨骨質疏松治療的全新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓間充質干細胞（hBMSCs）（中國賽業生物科技有限公司），α-Minimum Essential 培養基（美國HyClone 公司），胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清、鏈霉素、青霉素（美國Gibco 公司），β-甘油磷酸、地塞米松、抗壞血酸、茜素紅、4%多聚甲醛、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（美國Sigma 公司），TRIzol（美國 Invitrogen 公司），Prime Script RT Master Mix 試劑盒（日本TaKaRa 公司），SYBR Green 實時熒光定量PCR 預混液（日本Osaka 公司），OCN、OSX、COL1A1、GAPDH 一抗（英國Abcam 公司），堿性磷酸酶（ALP）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），原位凋亡檢測試劑盒（日本TaKaRa 公司），Caspase-3 活性檢測試劑盒（上海Best Bio 公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 細胞培養和成骨分化誘導 在α-Minimum Essential 培養基中加入10% 胎牛血清、鏈霉素100 mg/L、青霉素100 u/L，在37°C、5%二氧化碳培養箱中培養人骨髓間充質干細胞。每3 天或每4 天更換1 次培養基，當細胞達到80%～90%融合時，培養基中加入 1 0 mmol/L β-甘油磷酸、100 nmoL 地塞米松及200 μmol/L 抗壞血酸。成骨分化誘導14 d，每3 天更換成骨誘導培養基。

1.2.2 細胞轉染及分組 使用Lipofectamine 2000試劑盒進行細胞轉染，轉染前24 h 對細胞進行轉接，接種密度約為每孔1×105個細胞。轉染過程：吸去培養皿中的培養基，用PBS 或者無血清培養基清洗1 次，更換無血清培養基，準備轉染制備液（A 液：用 2 00 μL Opti-MEM 稀釋 4 μg 質粒；B 液：用 2 00 μL Opti-MEM 稀釋 1 0 μL Lipofectamine 2000），分別將A液、B 液輕輕混勻，靜置5 min，吸取B 液加入至A 液中，輕輕混勻，室溫靜置20 min，加入轉染試劑到每個孔的培養基中，6 h 后更換成完全培養基。繼續培養24 h 后觀察轉染效率。分組：轉染 短 發 夾 RNA（SH-SNHG5＃1，SH-SNHG5＃2，SH-SNHG5＃3）用于抑制SNHG5表達，轉染sh-RNA（sh-NC）作為陰性對照。轉染sh-NC 為對照組，轉染SH-SNHG5＃1 為實驗組。

1.2.3 Western blotting 檢測 OCN、OSX 及 COL1A1蛋白相對表達量 用裂解緩沖液獲得總蛋白后，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并電轉移到聚偏氟乙烯膜。隨后，將膜密封在5%脫脂牛奶中1 h，4°C 下用特異性一抗過夜，然后二抗孵育，并使用GE 增強化學發光法檢測系統進行測量。以GAPDH 作為對照，檢測成骨誘導前后及轉染后第14 天OCN、OSX 及COL1A1 蛋白相對表達量。

1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測SNHG5、OCN、OSX、COL1A1 mRNA 相對表達量 TRIzol 試劑提取hBMSCs 總RNA，根據說明書，使用Prime Script RT Master Mix 試劑盒進行逆轉錄。然后使用SYBR Green 實時熒光定量預混液在ABI Prism 7900HT 熒光定量PCR 儀中進行逆轉錄聚合酶鏈反應。反應體系：退火反應液14 μL，M-MLV酶緩沖液 4 μL，RNA 酶抑制劑 1 μL，M-MLV 逆轉錄酶1 μL；反應條件：42℃預變性60 min，95℃變性 5 min，4 ℃退火 5 min。qRT-PCR 擴增體系為：5×SYBR GreenI PCR 緩沖液10 μL，正向引物（10 pmol/μL）1 μL，反向引物（10 pmol/μL）1 μL，dNTPs（10 mmol/L）1 μL， T aq 酶（3 u/μL）1 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 31 μL；反應條件：93℃預變性3 min，93℃變性 3 0 s，55℃退火 4 5 s，72℃延伸 4 5 s，共40 個循環。采用2-ΔΔCt法計算成骨誘導前后SNHG5 和OCN mRNA 相對表達量，以及轉染后第14 天 O CN、 O SX、 C OL1A1 mRNA 相 對 表 達 量 。GAPDH 和U6 分別作為內參對照，每個實驗至少重復3 次。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 ALP 活性測定 對常規培養以及轉染后的各組hBMSCs 進行成骨分化誘導，隨后接種于24 孔板（1×105個細胞/孔）。去除培養基，用PBS 洗滌3 次，4% 多聚甲醛 固 定 3 0 min 后，再 次 清洗，每孔加入配制好的ALP 顯色劑避光染色30 min，PBS 沖洗后用倒置光學顯微鏡觀察。為了檢測ALP 活性的定量表達，先用PBS 清洗細胞，每孔加入 1 00 μL 1% 曲拉通X-100，置于冰上裂解30 min，混勻后收集細胞裂解液。離心10 min（4℃，12 000 r/min），取上清液即為待測液。根據ALP 活性檢測試劑盒說明書，待測液加入96 孔板，設置空白對照孔、標準品孔和待測液孔，按試劑盒說明書加入緩沖液和基質液，37℃避光孵育15 min 后，于酶標儀405 nm 波長處測定吸光度值。實驗重復3 次，最后根據ALP 酶活性定義，計算待測液ALP 活性。

1.2.6 茜素紅染色 hBMSCs 用4%多聚甲醛溶液固定，用2%茜素紅染色，吸去固定液，用1×PBS 沖洗細胞2 次，光學顯微鏡下觀察拍照。為定量hBMSCs 的礦化，本實驗從hBMSCs 中分離茜素紅，用氯化十六烷基吡啶緩沖液孵育1 h，在562 nm 波長處檢測茜素紅OD 值，繪制標準曲線，計算成骨誘導前后及轉染后第14 天茜素紅的濃度。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 取處于對數生長期的第4 代細胞，分為對照組（sh-NC 組）、實驗組（sh-SNHG5＃1/2/3 組）。將兩組細胞按2×105個/孔的密度接種于6 孔培養板中，加入培養基至2 mL，過夜培養48 h 后，待細胞融合度達到80%～90%時，停止培養。PBS 沖洗3 遍后胰酶消化離心收集細胞沉淀，加入適量的PBS 重懸細胞，再次離心后收集細胞沉淀。加入預冷的70%乙醇（無水乙醇∶PBS = 7∶3）4℃過夜固定，加入 1 00 μL RNaseA 溶液重懸細胞，放在37℃水浴鍋中加熱30 min，加入400 μL 碘化丙咤（PI）染色液，40℃避光孵育30 min，孵育結束后PBS 洗2 次。采用流式細胞儀進行檢測：流式細胞儀激化光波長用488 nm，用波長＞560 nm 的通帶濾器檢測PI 熒，用一波長為515 nm 的通帶濾器檢測FITC 熒光，計算轉染后第14 天細胞凋亡率。

1.2.8 酶聯免疫吸附試驗檢測Caspase-3 活性 用90 μL 裂解緩沖液裂解 h BMSCs，然后用 1 0 μL Ac-DEVD-ρNA 處理細胞裂解液。室溫孵育2 h 后，經酶標儀測定405 nm 波長處的吸光度值，實驗重復3 次，檢測轉染后第14 天Caspase-3 活性。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（）表示，兩組比較用t檢驗；成骨誘導前后、轉染不同質粒后的比較用隨機區組設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成骨誘導前后各成骨蛋白相對表達量的比較

Western blotting 檢測結果顯示，成骨誘導前、誘導后第7 天、誘導后第14 天的OCN、OSX 及COL1A1 蛋白相對表達量比較，經隨機區組設計的方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），進一步兩兩比較，經LSD-t檢驗，誘導后第14 天高于誘導后第7 天和成骨誘導前（P＜0.05），誘導后第7 天高于成骨誘導前（P＜0.05）。見圖1 和表2。

表2 成骨誘導前后OCN、OSX、COL1A1蛋白相對表達量比較 （）

表2 成骨誘導前后OCN、OSX、COL1A1蛋白相對表達量比較 （）

注：①與成骨誘導前比較，P ＜0.05；②與成骨誘導第7天比較，P ＜0.05。

OCN蛋白1.000±0.100 1.652±0.162①時間成骨誘導前成骨誘導第7天成骨誘導第14天F 值P 值OSX蛋白1.000±0.100 1.810±0.182①COL1A1蛋白1.000±0.100 1.702±0.173①2.301±0.232①②2.266±0.222①②2.156±0.201①②38.042 0.000 42.335 0.000 40.106 0.000

圖1 成骨誘導前后各成骨蛋白的表達

2.2 成骨誘導前后ALP活性和茜素紅濃度比較

成骨誘導前、成骨誘導第7 天、成骨誘導第14 天ALP 活性和茜素紅濃度比較，經隨機區組設計的方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，經LSD-t檢驗，誘導后第14 天的ALP 活性和茜素紅濃度大于成骨誘導第7 天和成骨誘導前（P＜0.05），成骨誘導第 7 天大于成骨誘導前（P＜0.05）（見表3）。成骨誘導第14 天茜素紅染色深度明顯提高，表明ALP 活性上升，鈣鹽沉積增多，成骨活性增強（見圖2、3）。

表3 成骨誘導前后ALP活性及茜素紅濃度比較 （）

表3 成骨誘導前后ALP活性及茜素紅濃度比較 （）

注：①與成骨誘導前比較，P ＜0.05；②與成骨誘導第7天比較，P ＜0.05。

茜素紅濃度/（μmol/μg）0.158±0.028 0.448±0.068①0.731±0.139①②29.971 0.000時間成骨誘導前成骨誘導第7天成骨誘導第14天F 值P 值ALP活性/[μmol/（mL·min）]0.123±0.026 0.180±0.027①0.242±0.040①②10.488 0.011

圖2 成骨誘導前后ALP染色結果 （×20）

圖3 成骨誘導前后茜素紅染色結果 （×20）

2.3 成骨誘導前后SNHG5和OCN mRNA相對表達量比較

qRT-PCR 檢測結果顯示，成骨誘導前、成骨誘導第1 天、成骨誘導第3 天、成骨誘導第5 天、成骨誘導第7 天、成骨誘導第14 天SNHG5、OCN mRNA 相對表達量比較，經隨機區組設計的方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。SNHG5 和OCN mRNA 相對表達量隨時間推移逐漸升高。見表 4 和圖 4。

表4 成骨誘導前后SNHG5和OCN mRNA相對表達量比較 （）

表4 成骨誘導前后SNHG5和OCN mRNA相對表達量比較 （）

時間成骨誘導前成骨誘導第1天成骨誘導第3天成骨誘導第5天成骨誘導第7天成骨誘導第14天F 值P 值SNHG5 mRNA 1.000±0.173 1.201±0.275 1.716±0.281 2.080±0.511 2.478±0.389 2.951±0.466 12.399 0.000 OCN mRNA 1.000±0.151 1.297±0.229 1.755±0.302 2.071±0.380 2.455±0.417 2.922±0.634 10.443 0.000

圖4 SNHG5和OCN mRNA相對表達量隨時間變化趨勢

2.4 轉染不同質粒后各組SNHG5 mRNA 相對表達量比較

轉染不同質粒后，sh-NC 組、sh-SNHG5#1 組、sh-SNHG5#2 組 及 sh-SNHG5#3 組 的 SNHG5 mRNA相對表達量比較，經隨機區組設計的方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）。進一步兩兩比較，經 LSD-t檢驗， sh-SNHG5#1 組、sh-SNHG5#2 組 及sh-SNHG5#3 組的SNHG5 的相對表達量低于sh-NC組 （P＜0.05）。結果表明轉染 sh-SNHG5#1/2/3 均可降低骨髓間充質干細胞SNHG5 表達，其中以轉染sh-SNHG5#1 最為顯著。見表5。

表5 轉染不同質粒后SNHG5 mRNA相對表達量比較（）

表5 轉染不同質粒后SNHG5 mRNA相對表達量比較（）

注 ：?與sh-NC組比較，P ＜0.05。

組別sh-NC組sh-SNHG5#1組sh-SNHG5#2組sh-SNHG5#3組F 值P 值SNHG5 mRNA 0.999±0.157 0.180±0.031?0.221±0.042?0.290±0.070?56.044 0.000

2.5 轉染后第14 天OCN、OSX、COL1A1 蛋白相對表達量比較

兩組細胞轉染質粒后第14 天OCN、OSX、COL1A1 蛋白相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組低于對照組。見圖5和表6。

圖5 轉染不同質粒后各成骨相關蛋白的相對表達量

表6 轉染不同質粒后兩組各成骨標志物蛋白相對表達量比較 （）

表6 轉染不同質粒后兩組各成骨標志物蛋白相對表達量比較 （）

組別對照組實驗組t 值P 值OCN蛋白1.000±0.100 0.380±0.035 10.118 0.000 OSX蛋白1.000±0.100 0.323±0.035 11.005 0.000 COL1A1蛋白1.000±0.100 0.415±0.039 9.434 0.000

2.6 轉染質粒后第14天OCN、OSX、COL1A1 mRNA相對表達量比較

兩組細胞轉染質粒后第14 天OCN、OSX 及COL1A1 mRNA 相對表達量比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組低于對照組。見表7。

表7 兩組轉染質粒后第14天OCN、OSX、COL1A1mRNA相對表達量比較 （）

表7 兩組轉染質粒后第14天OCN、OSX、COL1A1mRNA相對表達量比較 （）

組別對照組實驗組t 值P 值OCN mRNA 1.001±0.228 0.344±0.069 4.766 0.004 OSX mRNA 0.999±0.216 0.402±0.074 4.521 0.005 COL1A1 mRNA 1.000±0.169 0.384±0.093 5.529 0.003

2.7 細胞轉染質粒后ALP活性和茜素紅濃度比較

細胞轉染后第14 天兩組ALP 活性比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組低于對照組（見表8）。ALP 染色結果顯示，轉染sh-SNHG5#1后第14 天，實驗組ALP 染色明顯淺于對照組，結果表明ALP 活性降低，實驗組骨向分化程度低于對照組（見圖6）。細胞轉染后第14 天兩組茜素紅濃度比較，經t檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組低于對照組（見表8）。結果表明下調SNHG5 可以明顯抑制BMSCs 的骨向分化。茜素紅染色結果顯示，轉染sh-SNHG5#1 后第14 天，實驗組細胞染色明顯淺于對照組（見圖7）。表明實驗組鈣離子沉積較少，骨向分化程度低，礦化水平明顯低于對照組。

圖6 轉染質粒后ALP染色結果 （×20）

圖7 轉染質粒后茜素紅染色結果 （×20）

表8 細胞轉染質粒后兩組ALP活性及茜素紅濃度比較（）

表8 細胞轉染質粒后兩組ALP活性及茜素紅濃度比較（）

組別對照組實驗組t 值P 值ALP活性/[μmol/（mL·min）]0.240±0.058 0.106±0.018 3.800 0.010茜素紅濃度/（μmol/μg）0.669±0.165 0.218±0.053 4.512 0.005

2.8 兩組細胞凋亡率和Caspase-3活性比較

流式細胞術實驗結果顯示，兩組細胞凋亡率和Caspase-3 活性比較，經t檢驗分析，差異有統計學意義（P＜0.05），實驗組高于對照組（見表 9）。SNHG5基因下調后，早期及晚期凋亡細胞的數量明顯增加。見圖8。

表9 兩組細胞凋亡率和Caspase-3活性比較（）

表9 兩組細胞凋亡率和Caspase-3活性比較（）

對照組實驗組t 值P 值細胞凋亡率/%2.659±0.270 11.027±1.015 13.795 0.000 Caspase-3活性1.000±0.159 3.496±0.835 5.087 0.004

圖8 流式細胞圖

3 討論

隨著全球人口老齡化的加劇，骨質疏松癥的發病率不可避免地增長，骨質疏松癥成為一個嚴峻的公共衛生問題。骨質疏松癥在口腔頜面不僅僅體現為牙周附著能力的喪失，加重牙周病的發展，導致早期牙齒缺失，同時由于骨質疏松的發生，骨量的降低及骨結合能力下降，對口腔種植體的早期穩定性帶來了巨大的挑戰，極大影響種植手術預后效果，頜骨骨質疏松成為了口腔頜面部功能修復的一大障礙[1-2]。機械應力、激素波動、營養缺乏及炎癥是導致骨質疏松的主要危險因素[3-4]。

治療頜骨骨質疏松的方法主要是藥物治療，包含骨吸收抑制劑（激素治療法、選擇性雌激素受體調節治療、二磷酸鹽治療）、骨礦化劑（鈣劑、維生素D、鍶制劑）和骨形成促進劑（甲狀旁腺素）的應用。其中二磷酸鹽作為最常見的治療藥物，其可能導致嚴重的頜骨壞死，從而破壞口腔健康，影響口腔正常功能，所以干細胞療法及生物療法的研究顯得越發重要。

骨髓間充質干細胞具有自我更新功能和分化能力，在骨質疏松癥的進展中起著至關重要的作用。因此，闡明骨髓間充質干細胞成骨的潛在機制有助于提高骨質疏松癥的臨床治療水平。骨髓間充質干細胞是多種成熟細胞的前體細胞，具有自我更新、高增殖及多向分化能力。骨髓間充質干細胞可以分化為多種間充質細胞譜系，包括肌細胞、成骨細胞、脂肪細胞及軟骨細胞。骨髓間充質干細胞在骨質疏松癥的發展中具有重要意義，因此，了解骨髓間充質干細胞成骨分化的調控機制，有助于發現治療骨質疏松的有效方法。

LncRNAs 被認為是非編碼RNA 分子的重要組成部分，多個研究表明，lncRNAs 可作為誘餌分子、信號調節蛋白、引導蛋白及支架蛋白參與多種生物活性，如細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲、分化等[11-12]，在包括骨質疏松癥在內的各種疾病中發揮著十分重要的作用[6]。其中，一些參與腫瘤進展的lncRNA 也可能參與骨質疏松癥。例如：lncRNA H19[13]、lncRNA KCNQ1OT1[14]、SNHG1 等[15]。 SNHG1 的 過 度表達通過促進神經前體細胞表達發育性下調蛋白4（NEDD4）與p-p38 之間的相互作用，從而降低BMSCs 的分化能力，且其表達隨著成骨進展不斷降低。

SNHG5是一個位于6q15染色體、長度為524個核苷酸的lncRNA。SNHG5 的功能已經在很多疾病中得到了探索。SNHG5可通過miR-181a-5p/TGFBR3軸促進軟骨細胞增殖，抑制骨關節炎進展[16]，LncRNA SNHG5 通過激活miR-132-3p 正向調控直腸癌細胞的分化過程，miR-132-3p 與SNHG5 表達呈負相關，SNHG5 可以直接結合到miR-132-3p 的3'-UTR 區域并抑制其表達[17]。而研究發現miR-132-3p可通過靶向骨形成蛋白2（BMP-2）抑制骨髓源性干細胞（BMSC）成骨分化，抑制miR-132-3p 可顯著提高BMSCs 的成骨能力[18]。SNHG5 可能通過miR-132-3p 參與成骨分化過程。然而SNHG5 對于成骨機制相關的研究較少，尚無有力證據。

本研究通過檢測成骨誘導后SNHG5 的表達，發現在hBMSCs 成骨分化過程中，相關成骨標志物（OCN、OSX、COL1A1）蛋白的相對表達量均上調，與此同時，SNHG5 mRNA 相對表達量也顯著提高；而通過短發夾RNA 抑制SNHG5 的表達后，再行成骨誘導，成骨相關蛋白相對表達量相較于對照組顯著下降，ALP 活性明顯降低，礦化水平也大大下降，充分證實了降低SNHG5 表達后，hBMSCs 成骨活性被抑制。這可能與miR-132-3p 等成骨相關miRNA 水平的變化有關，需要進一步探究。與此同時，SNHG5 下調導致凋亡細胞比例上升且Caspase-3活性明顯提升，證明了SNHG5 下調促進了hBMSCs的凋亡，這與SNHG5 的下調誘導軟骨細胞[15]及肺癌細胞[17]凋亡有相同的趨勢。本研究結果表明，通過對患者臨床標本檢測SNHG5 可用于指導臨床上骨質疏松的治療。然而骨質疏松受很多因素的影響，成骨分化作為其中的重要一環，仍受到其他因素（如激素水平改變等）的影響及制約，而本實驗只是對SNHG5 參與hBMSCs 成骨分化及細胞凋亡的初步探究，尚不完善。因此，未來需要側重于骨質疏松患者臨床標本（如血漿等）中SNHG5 的研究，SNHG5 可能成為全新的骨質疏松癥的檢測指標，為不同治療策略和高危人群早期診斷帶來更有意義的臨床價值。同樣，SNHG5 有可能成為治療骨質疏松的靶基因，對于后續實驗的推進有著極大的價值，從而推動基因治療骨質疏松癥的進程。

綜上所述，SNHG5 參與調控骨髓間充質干細胞成骨分化和凋亡，可能是一種很有前途的治療骨質疏松癥的新靶點。然而，SNHG5 在骨質疏松癥中的價值需要進一步探討，激活下游通路中的蛋白表達可能成為后續的研究方向，并需要臨床和體內實驗進一步證明，進而為臨床上治療頜面部骨質疏松與頜骨缺損提供新思路及新選擇。