細菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析

李純，葉俊琴，黎四平（通信作者）

1 廣東醫科大學 （廣東東莞 523808）；2 廣東醫科大學附屬東莞市兒童醫院 （廣東東莞 523325）

病原菌是引起人體感染的主要因素之一。近年隨著抗菌藥物、侵入性操作等在臨床的廣泛應用，促使細菌的耐藥性呈不斷上升趨勢，并產生多重耐藥菌，而由此類病原菌誘發的感染已成為臨床較為棘手的問題[1-2]。大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等為臨床常見病原菌，是引起人體感染的常見革蘭陰性菌。由于廣譜抗菌藥物的廣泛應用，使得細菌產超廣譜β-內酰胺酶的檢出率逐年升高，臨床治療難度增加[3-4]。因此，及時明晰此類病原菌的耐藥基因分布情況與藥敏試驗結果之間的關系，對于指導臨床規范選用抗菌藥物意義重大。基于此，本研究分析細菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性，以指導臨床合理用藥，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取2020年2月至2021年4月醫院臨床各科送檢的住院患者的標本，包括痰液、血液、尿液等。

1.2 方法

細菌培養：將痰液、尿液等標本置于無菌容器內，血液標本置于血培養瓶內，嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》[5]進行細菌培養，將獲取的標本分別對應接種于巧克力瓊脂平板、血瓊脂平板上進行初步細菌培養，之后放入孵箱內培養24～48 h，待細菌長成菌落后挑取單個菌落采用VITEK 2 COMPACT 全自動微生物鑒定系統進行藥敏試驗。

耐藥基因檢測：依據大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、屎腸球菌的常見耐藥基因頭孢噻肟酶（cefotaximase，CTX-M）序列進行特異性引物與引物序列設計，采用煮沸法提取核酸，即將細菌準確接種在LB 營養瓊脂平板上，放入培養箱（設定溫度為35 ℃）內過夜培養，次日挑選單個菌落，借助LB 營養瓊脂平板開展分離純培養，第3 天取菌落數個放入EP 試管（內含雙蒸水）中并蒸煮10 min，而后取200 μl 菌液，以13 000 r/min 離心5 min，獲取上清液，在上清液中加入50 μl 0.9%氯化鈉溶液，重新懸浮，再以13 000 r/min 離心3 min，獲取上清液，加入200 μl 0.9%氯化鈉溶液，之后以95 ℃煮沸10 min，以13 000 r/min 離心3 min，獲取上清液，由深圳華大因源醫藥科技有限公司檢測耐藥基因，以細菌耐藥基因CTX-M 型陽性為檢測出基因型，陰性即為未檢測出基因型。

1.3 觀察指標

以聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法檢測大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、糞腸球菌、屎腸球菌的基因型（CTX-M 型）分布情況，并比較細菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性。

1.4 統計學處理

采用SPSS 18.0 統計軟件進行數據處理，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，一致性采用Kappa檢驗，Kappa<0.40 表示一致性不佳，0.40～0.74 表示一致性尚可，>0.74 表示一致性良好，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大腸埃希菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析

354 株大腸埃希菌中，CTX-M 型339 株，占比95.76%（339/354），未檢測出基因型13株，占比3.67%（13/354），≥2 種基因型2 株，占比0.56%（2/354）；大腸埃希菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果一致性良好（Kappa=0.778，P=0.000），見表1。

表1 大腸埃希菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析

2.2 肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析

82 株肺炎克雷伯菌中，CTX-M 型74 株，占比90.24%（74/82），未檢測出基因型1 株，占比1.22%（1/82），≥2 種基因型7 株，占比8.54%（7/82）；肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果一致性較為尚可（Kappa=0.491，P=0.000），見表2。

表2 肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析（株）

2.3 糞腸球菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析

24株糞腸球菌均未檢測出基因型；糞腸球菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果一致性不佳（Kappa=0.188，P=0.122），見表3。

表3 糞腸球菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析（株）

2.4 屎腸球菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析

12株屎腸球菌均未檢測出基因型；屎腸球菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果一致性不佳（Kappa=0.143，P=0.593），見表4。

表4 屎腸球菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果的一致性分析（株）

3 討論

隨著臨床抗菌藥物的大量使用、介入性診療手段的廣泛使用以及各種免疫抑制劑的運用增多，促使各類病原菌的耐藥性增加，并呈現出多重耐藥，進而增加了感染控制難度[6]。多重耐藥菌的產生不僅嚴重影響感染性疾病的控制和治療，而且還會延長患者的住院時間，給其身心健康造成較多影響[7-8]。另外，不同國家和地區抗菌藥物使用的種類、數量和習慣的不同，導致病原菌的基因型分布呈明顯的區域特征[9-10]。因此，及時準確掌握臨床病原菌的耐藥基因分布情況以及與藥敏試驗結果的一致性，對于指導臨床合理選擇、科學使用抗菌藥物具有重要意義。

本研究結果顯示，354 株大腸埃希菌中，CTX-M型339 株，占比95.76%（339/354），未檢測出基因型13 株，占比3.67%（13/354），≥2 種基因型2 株，占比0.56%（2/354）；大腸埃希菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果一致性良好（Kappa=0.778，P=0.000）；82 株肺炎克雷伯菌中，CTX-M 型74 株，占比90.24%（74/82），未檢測出基因型1 株，占比1.22%（1/82），≥2種基因型7株，占比8.54%（7/82）；肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果一致性較為尚可（Kappa=0.491，P=0.000）；提示多數的產超廣譜β 內酰胺酶類的大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌為CTX-M 基因編碼所致，而且有多株同時攜帶2 種及以上的基因型，分析原因可能與臨床上長期大劑量使用頭孢曲松等第三代頭孢菌素誘導耐藥細菌產生與傳播聯系密切[11-12]；此外，還提示大腸埃希菌與肺炎克雷伯菌的耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果具有良好的一致性，臨床可根據細菌耐藥基因檢測結果選擇最佳的抗菌藥物。本研究結果顯示，24 株糞腸球菌均未檢測出基因型，糞腸球菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果一致性不佳（Kappa=0.188，P=0.122）；12 株屎腸球菌均未檢測出基因型，屎腸球菌耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果一致性不佳（Kappa=0.143，P=0.593）；原因可能與此類病原菌納入樣本量較少有關。

綜上所述，大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌對頭孢塞肟的耐藥性較為嚴重，且耐藥基因檢測結果與藥敏試驗結果具有良好的一致性，臨床可根據細菌耐藥基因檢測結果選擇最佳的抗菌藥物。