烯醇化酶1多肽共價修飾改變細胞的生長和代謝模式

宋學文 李文玲 朱麗雯 PRITHIVIRAJ Nagarajan 王 軍 嚴繼舟1,

(1. 上海海洋大學海洋生態系統和神經科學研究所, 上海 201306; 2. 上海海洋大學水產科學國家級實驗教學示范中心, 上海 201306)

烯醇化酶1(Enolase1, ENO1)存在于許多組織中, 是糖酵解的限速酶, 除在葡萄糖代謝過程中催化2-磷酸甘油酸轉化為磷酸烯醇丙酮酸外, 根據其細胞定位還參與多種生理和病理過程[1]。在糖酵解代謝, Warburg效應是腫瘤異常代謝的主要特征之一, 腫瘤細胞借助這一異常能量代謝可以逃避正常的細胞凋亡, 來進行增殖和遷移[2]。Warburg效應中葡萄糖代謝以糖酵解方式為主, 并抑制線粒體的氧化磷酸化[3]。比如ENO1在卵巢癌和胃癌組織中呈現高表達[4,5]; ENO1在肝癌組織中高表達并促進肝癌細胞的增殖、遷移與侵襲[6,7]。但也有研究表明ENO1在非小細胞肺癌(Non-small-cell carcinoma,NSCLC)組織中表達的上調與臨床結果相關性不大[8,9]。Chang等[10]的研究表明, 非小細胞肺癌中ENO1蛋白水平明顯降低, ENO1過表達抑制了A549細胞系向上皮間充質的轉變(Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)。這些結果表明ENO1是一個多功能蛋白。

蛋白質翻譯后修飾(Post-translational modification, PTM)是蛋白質功能調節的一種重要方式, 對蛋白質的結構和功能起著至關重要的作用[11]。蛋白質翻譯后修飾幾乎參與細胞的所有生命活動過程, 發揮著非常重要的調控作用。常見的修飾方式包括甲基化、磷酸化、泛素化、乙?；?、糖基化、SUMO 化、亞硝基化和氧化等。絕大部分的蛋白質在合成過程中或合成后都要經過某些形式的翻譯后修飾, 某些疾病常常與一些蛋白質異常的修飾有關。修飾基團的加入, 可能會引起蛋白質理化性質、結構和空間構象的改變, 從而引起蛋白質功能的改變, 進而引發某些疾病。特定的翻譯后修飾還被作為疾病的生物標志或治療的靶標[12]。

生物活性肽是一類能夠調節生物體生理功能的多肽, 參與神經調節、抗癌、免疫調節、激素遞質調節、新陳代謝、營養保健、抗氧化和延緩衰老等[13,14]。從肽轉運可能性到雙甘肽跨膜轉運現象再到寡肽吸收機制實驗證實蛋白質能以肽的形式被人體利用和吸收。相比于蛋白質等大分子, 多肽更容易被機體吸收, 因此被廣泛應用于生物活性多肽功能和營養學的研究。本實驗室前期在研究海星活性成分過程中, 利用蛋白質質譜檢測多肽種類, 通過蛋白質譜結果和文獻篩選追蹤到ENO1多肽。我們推測ENO1的不同功能是由ENO1活性多肽的不同化學修飾引起的。本文通過合成甲基化、乙?；?、磷酸化修飾及不經過修飾的ENO1多肽片段, 探究ENO1蛋白的生化功能和對細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要實驗材料

細胞系: PAC2斑馬魚胚胎成纖維細胞[15,16], 從美國國立衛生研究院(NIH)引進。甲基化、乙?；?、磷酸化修飾和未修飾的ENO1多肽(ENO1多肽序列: EG-Me: ELRDNDK(Me)TPYLGKG; EG-Ac:ELRDNDK(Ac)TPYLGKG; EG-Ps: ELRDNDK(Ps)TPYLGKG; EG: ELRDNDKTRYLGKG)由強耀生物公司合成。Leibovitz’s L-15 培養基、胎牛血清、含酚紅的2.5%胰酶為美國Gibco公司產品,CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(Cat.No.C0037)、乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(Cat.No.C0016)為碧云天生物科技有限公司產品, 線粒體染色試劑盒(Cat.No.E607509)、溶酶體染色試劑盒(Cat.No.E607506)為上海生工生物有限公司產品。2-Phosphoglycerate Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(Cat.No.MAK198)為Sigma-Aldrich公司產品。RT2ProfilerTMPCR Array試劑盒(Cat. No. PAZF-006Z ), RT2 SYBR?Green qPCR Mastermix(Cat. No. 330529) 和RNeasy Mini Kit(Cat.No.74104)為Qiagen Germany公司產品, PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(Cat. No. RR037B)為TaKaRa公司產品。

1.2 四種多肽對細胞的處理

取對數生長期的PAC2斑馬魚胚胎成纖維細胞,用含10%胎牛血清的L15培養基調整細胞懸液密度為1×105ind./mL, 向96孔板或LAB-TEK板每個孔中加入100 μL細胞懸液, 置于32℃培養箱中培養。Dai等[17]的研究結果表明海星的甲醇水層提取物在100 μg/mL的濃度下處理細胞24h作用效果較好。因此, 待細胞密度達到80%左右, 用不含血清的細胞培養液(Leibovitz’s L-15 培養基)分別將4種多肽稀釋至100 μg/mL, 培養PAC2細胞24h。以不含多肽的稀釋液培養細胞為空白對照, 所有實驗有3個平行。

1.3 CCK-8法檢測PAC2細胞增殖能力

向上面細胞培養的96孔板每孔加入10 μL CCK-8和90 μL無血清的L15培養基, 32℃孵育過夜。用酶標儀(Microplate reader)在450 nm處測定各孔的吸光度(OD)值。

1.4 胞內、胞外乳酸脫氫酶(LDH)釋放的檢測

糖酵解過程中生成的丙酮酸在LDH的催化下還原為乳酸。LDH試劑盒檢測中: LDH可使1種四唑鹽INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyltetrazolium chloride)轉化為強生色的紅色甲瓚, 生成的紅色產物的量與LDH的含量成正比, 在490 nm波長下產生吸收峰, 從而可以通過比色法來定量乳酸脫氫酶的活性。實驗操作按照試劑盒說明書進行。先用4種多肽處理細胞24h進行預實驗, 確定后續裂解的細胞組(樣品最大酶活性孔)。到預定檢測時間的前1h, 在“樣品最大酶活性對照孔”中加入10 μL LDH釋放試劑、混勻, 孵育。到達預定時間后, 將細胞培養板400 r/min離心5min。取上清液120 μL, 進行胞外LDH檢測。細胞沉淀加入150 μL用PBS稀釋了10倍的LDH釋放工作液試劑(10體積1×PBS中加入1體積LDH釋放試劑并混勻), 適當搖晃混勻, 32℃孵育1h, 到達預定時間后, 400 r/min離心5min, 取120 μL上清用于細胞內總LDH的檢測。分別向胞外和胞內LDH檢測樣本中, 加入60 μL LDH檢測工作液(乳酸溶液﹕1×INT溶液﹕酶溶液=1﹕1﹕1), 混勻。室溫避光孵育2h, 用酶標儀(Microplate reader)在490 nm測吸光度值。細胞LDH釋放率=(多肽處理后細胞上清液OD–對照組細胞上清液OD)/(最大酶活性組細胞培養液OD–對照組上清培養液OD)×100%。

1.5 線粒體和溶酶體完整性檢測

將對數生長期的PAC2斑馬魚胚胎成纖維細胞用胰酶消化后取細胞懸液(1×105ind./mL)接種到LAB-TEK板中, 按上述的多肽處理方法用100 μg/mL的4種多肽分別處理PAC2細胞并培養24h。線粒體和溶酶體染色: 用1×PBS清洗細胞2—3次, 加入200 μL溶酶體(紅色)和線粒體(綠色)工作液32℃孵育1h。然后棄染色液, 用L15培養基﹕PBS=1﹕1的緩沖液洗滌2次。用TRITC和FITC濾光器的熒光顯微鏡(OLYMPUS TH4-200)觀察細胞并拍照。

1.6 2-磷酸甘油酸(2-PG)檢測

2-PG的含量是通過將2-PG轉化為PEP再轉化為丙酮酸來確定的。丙酮酸被氧化, 產生的熒光強度(Ex/Em=535/587 nm)與2PG含量成正比。利用2-PG試劑盒可以檢測ENO1修飾后的4條多肽對糖酵解代謝的終極產物丙酮酸生成的影響。

先建立標準曲線: 用975 μL超純水稀釋25 nmol/L(1 mmol/μL)的2-磷酸甘油(2-PG)至工作濃度為25 μmol/L(25 pmol/μL)的2-PG 標準品, 添加0、2、4、6、8和10 μL的2-PG標準品工作液, 使最終濃度為0、50、100、150、200和250 pmol/孔。然后加2-PG Buffer至每個使最終體積為50 μL。用4種多肽處理PAC2細胞24h后, 將96孔板從培養箱中取出,移走培養基, 用PBS清洗2次。每個孔用50 μL胰酶消化貼壁細胞3min, 顯微鏡觀察細胞變圓后加入含10%FBS的L15培養基終止消化, 轉移至離心管,1000×g離心3min, 棄培養基。加入100 μL 的1×PBS清洗細胞。離心沉淀加入200 μL預冷的2-PG Assay Buffer, 超聲破碎并勻漿, 12000×g離心5min, 將上清液移至另一個新的96孔板中, 每孔中50 μL的熒光反應體系混合液, 室溫避光孵育40min。酶標儀在Ex/Em=535/587 nm下測熒光值。2-PG濃度C=Sa/Sv(Sa. 從標準曲線中得到未知樣品中2-PG的含量; Sv. 檢測的樣品體積)

1.7 RNA提取及PCR Array分析葡萄糖代謝通路

總RNA提取和cDNA合成用0.25%的胰酶消化收集4種不同修飾多肽處理24h后的細胞懸液,利用TRIzol法提取細胞total RNA, 并去除基因組DNA; cDNA的合成: 按照TaKaRa公司的PrimeScript?II High Fidelity RT-PCR Kit試劑盒方法進行反轉錄合成cDNA。–20℃保存備用。

PCR ARRAY利用PCR ARRAY通過Real-Time PCR分析參與葡萄糖代謝過程中84個關鍵基因的表達。每個編目的RT2Profiler PCR陣列中包含葡萄糖代謝的84個關鍵基因和5個管家基因。將上述合成的cDNA用于real-time RT2Profiler PCR Array (QIAGEN, Cat. No. PAZF-006Z)與RT2SYBR?Green qPCR Mastermix(Cat. No. 330529)檢測。將CT值導出到Excel文件, 以創建CT值表。該表隨后上傳至QIAGEN官方數據分析門戶網站http://www.qiagen.com/geneglobe, 將樣本分配給對照組和試驗組。從GeneGlobe的QIAGEN門戶網站導出相應數據分析報告。

1.8 轉錄組測序

基于以上結果, 選取空白對照處理和乙酰化修飾多肽處理24h之后的PAC2細胞進行轉錄組分析。利用TRIzol法提取total RNA, 由金唯智生物科技有限公司（現改名為“安升達生命科學技術公司”）進行RNA-seq測序, 采用Illumina測序平臺完成轉錄組測序, 構建Illumina PE文庫進行150 bp測序。

1.9 數據統計分析

我們利用PCR ARRAY通過Real-Time PCR分析了參與葡萄糖代謝過程中84個關鍵基因的表達。PCR ARRAY中包含5種管家基因, 基因組DNA污染質控。未經修飾的ENO1的多肽EG-4作為對照, 采用相對定量法(2–??Ct)分析了葡萄糖代謝通路中基因表達水平的變化, 通過T-Student計算P值。篩選出變化倍數在2以上, 具有統計學意義(P<0.05)的差異表達的基因。利用DAVID對PCR ARRAY葡萄糖代謝通路中差異表達的基因進行功能富集。

轉錄組數據分析, 參考基因組使用的是ENSEMBL,Danio rerio.GRCz11.100, 比對軟件是Hisat2(v2.0.1)默認參數, 定量軟件是Htseq(v0.6.1),KEGG使用的是R包里的數據庫。基因差異分析使用Bioconductor軟件包的DESeq2(V1.6.3)進行分析,對檢測的結果按照差異顯著性標準(差異基因表達變化2倍以上且qvalue (fdr, padj)≤0.05)進行篩選,統計基因顯著性差異表達上下調情況。然后對數據進行相似度計算, 并根據相似度將數據進行分類,從而將具有相同功能或密切聯系的基因聚集成類,識別未知基因的功能或已知基因的未知功能, 推斷是否共同參與同一代謝過程或細胞通路。最后利用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)R包里的數據庫對差異基因進行通路(Pathway)顯著性富集分析, 來確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑。

2 結果

2.1 四種多肽對PAC2細胞增殖的影響

實驗采用CCK-8評估PAC2細胞增殖和細胞活性。與對照組相比, 甲基化修飾的烯醇化酶肽(EGMe)表現為抑制PAC2細胞增殖; 乙酰化修飾的烯醇化酶肽(EG-Ac)表現為極顯著地促進細胞增殖; 磷酸化修飾的多肽(EG-Ps)也表現為較為明顯地促進細胞增殖; 然而沒有經過任何修飾的多肽(EG)對細胞的作用并不明顯(圖1)。

圖1 烯醇化酶1多肽修飾的處理PAC2細胞的計量分析Fig. 1 Quantitative analysis of PAC2 cells in different modified enolase peptidesP>0.05(用n表示); 0.010.05 (indicated by n); 0.01

2.2 四種多肽處理對胞內和胞外LDH釋放的影響

胞內總LDH的含量一方面可以反映細胞糖酵解代謝生成乳酸的能力, 另一方面能間接反映細胞數量的多少。結果顯示(圖2): 與對照組相比, ENO1的4種多肽處理PAC2后的導致細胞內總LDH的含量均下降, 尤其未修飾肽最顯著。

圖2 24h時PAC2細胞總LDH的相對含量Fig. 2 Relative content of total LDH in pac2 cells at 24h

胞外LDH的釋放被認為是細胞膜完整性的重要指標, 通過檢測質膜破裂的細胞中釋放到培養液中LDH的活性, 可實現對細胞膜完整性的定量分析[18]。結果顯示4種多肽處理后細胞LDH的釋放量極低,其中釋放最多的EG-Ac處理PAC2細胞其LDH的釋放率僅為胞內LDH的3.953871%, 因此, 修飾后ENO1的4種多肽沒有或很少破壞細胞膜結構的完整性。

2.3 四種多肽處理對2-磷酸甘油酸(2-PG)的影響

2-PG是糖酵解途徑的重要中間代謝產物, 在烯醇化酶(ENO1)的催化下轉化為磷酸烯醇丙酮酸(PEP), 后者又被丙酮酸激酶轉化為丙酮酸。本實驗所用2-PG試劑盒是通過2-PG酶轉化成PEP,PEP進一步轉化成丙酮酸, 通過檢測丙酮酸含量來間接反映2-PG含量。圖 3顯示4種多肽處理后的細胞生成丙酮酸的量都顯著降低, 而修飾的EG下降更為明顯。實驗結果顯示4種多肽處理后細胞內2-PG和丙酮酸含量下降, 4種多肽都不同程度地改變了糖酵解代謝途徑或者改變內源性烯醇化酶反應活性, 特別是修飾EG比未修飾EG改變更為明顯。

圖3 多肽處理24hPAC2 細胞2-PG的相對含量Fig. 3 Relative content of 2-PG in peptide-treated PAC2 cells at 24h

2.4 四種多肽對線粒體和溶酶體的影響

線粒體和溶酶體結構觀察比較顯示對照組的細胞線粒體和溶酶體都呈現單層完整的細胞形態結構, 經過修飾后的4種多肽處理細胞后溶酶體均呈現不同程度的細胞粘附團(圖4)。經過甲基化多肽EG-Me和乙酰化修飾的多肽EG-Ac使線粒體發生聚集, 經過磷酸化修飾的EG-Ps及未修飾的多肽EG處理后PAC2細胞中明顯看到綠色熒光聚集變大變亮, 可見線粒體體積變大, 推測是線粒體發生了融合的結果。這些兩種細胞器的形態改變也提示氧化磷酸化發生變化。

圖4 四種多肽對PAC2細胞線粒體和溶酶體的影響Fig. 4 Fluorescence image of mitochondrion and lysosome staining of PAC2 cell after 4 peptide treatments嵌入圖為細胞放大圖。左上角標尺: 50 μmInsets show magnification of individual cells. Upper left scale bar: 50 μm

2.5 四種多肽對葡萄糖代謝通路的影響

利用PCR ARRAY分析參與葡萄糖代謝過程中84個關鍵基因的表達。結果顯示甲基化修飾的EGMe引起13個基因的表達上調和3個基因的表達下調。乙?；揎椀腅G-Ac 組有6個基因的表達上調和4個基因的表達下調。經過磷酸化修飾的EGPs組有3個基因的表達上調和41個基因的表達下調(圖5和表 1)。

圖5 四種多肽對葡萄糖代謝通路中特異性基因表達的相對表達水平Fig. 5 Effects of four peptides on relative expression level of specific gene in glucose metabolic pathway

通過DAVID對PCR ARRAY葡萄糖代謝通路中差異表達的基因富集分析(表1)發現, 甲基化修飾EG-Me和乙酰化修飾EG-Ac處理后的PAC2細胞,表達上調的基因明顯多于下調的基因。相反, 磷酸化修飾的EG-Ps處理后的PAC2細胞, 表達上調的基因明顯多于下調的基因。這說明多肽共價修飾不同程度地改變細胞糖酵解、糖異生、葡萄糖代謝調控、磷酸戊糖途徑、糖原合成和糖原分解、糖酵解、糖異生等代謝途徑。

表1 糖代謝途徑中差異表達基因的富集Tab. 1 Enrichment of differentially expressed genes in glucose metabolism pathway

2.6 基因差異表達和通路分析

為了將糖代謝與細胞增殖關聯, 本文將空白對照處理和乙?；揎椀腅G-Ac處理的PAC2細胞進行轉錄組測序。按照差異顯著性標準(差異基因表達變化2倍以上且qvalue (fdr, padj)≤0.05)進行篩選, 統計基因顯著性差異表達上下調情況。如圖 6所示, 與對照組相比, 有189個基因顯著性上調,45個基因顯著性上調。火山圖表示樣本采集有代表性, 差異分析非常明顯。

圖6 乙酰化修飾ENO1多肽處理引起PAC2差異表達基因火山圖Fig. 6 Volcano map of differentially expressed genes induced by acetylation modified eno1 polypeptide in PAC2

將篩選出來的顯著性差異基因從細胞組分(CC, cellular component)、生物進程(BP, biological process)和分子功能(MF, molecular function)三個層面進行GO功能顯著性富集分析, 然后采用通過KEGG分析顯著性富集能確定差異表達基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑(表2和表 3)。

表2 乙酰化修飾ENO1多肽處理引起PAC2差異表達基因KEGG富集分析(疾病相關的通路)Tab. 2 KEGG Enrichment analysis of PAC2 differentially expressed genes between acetylation modified eno1 polypeptide treatment and non-treatment (disease related pathways)

表3 乙?；揎桬NO1多肽處理引起PAC2差異表達基因KEGG富集分析(代謝相關的通路)Tab. 3 KEGG Enrichment analysis of PAC2 differentially expressed genes between acetylation modified eno1 polypeptide treatment and non-treatment (metabolism related pathways)

由圖 7可見, 可顯著富集到30條途徑, MF Term包括ATP結合、鈣離子結合、結構分子調節、肌動活動、微管肌動活動、三價鐵運動、NAD+ADP核苷轉移酶活性、雙鏈RNA腺苷脫氨酶活性和左手Z-DNA結合; CC Term包括細胞內、微管、肌球蛋白復合物、微管相關復合物、細胞內復合物、微管骨架和脂類粒子; BP Term包括微管為基礎的運動、體節特異性、抗原處理和內源性肽通過MHC-1類抗原呈遞、細胞鐵離子穩態、ATP分解代謝過程、鐵離子轉運、有絲分裂紡錘體定位、ATP合成過程、電子傳遞、膽固醇流出、有絲分裂紡錘體組裝檢查。GO富集結果顯示, 一些ATP結合和分解過程和NAD+ADP核苷轉移酶活性都受到了影響, 說明乙?；揎椣┐蓟?多肽EGAc可以改變細胞的能量代謝過程。

圖7 乙酰化修飾ENO1多肽(EG-Ac)處理引起PAC2差異表達基因GO富集分析Fig. 7 Enrichment analysis of pac2 differentially expressed gene go caused by acetylation modified eno1 polypeptide treatmentGO富集柱狀圖?？v坐標為富集的GO term, 橫坐標為該term中差異基因個數。不同填充用來區分生物過程、細胞組分和分子功能Go enrichment histogram. The ordinate is the enriched GO term, and the abscissa is the number of differential genes in the term. Different filling are used to distinguish biological processes, cellular components and molecular functions

KEGG通路富集分析將富集到的一些DEGs關聯到一些相關的信號通路。與對照組相比, 一些與癌癥和病毒感染相關的信號通路比較明顯。與疾病相關的信號通路有人乳頭瘤病毒感染、甲型流感、單純皰疹病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、病毒致癌、肥厚型心肌病(HCM)、丙型肝炎、小細胞肺癌、致心律失常性右心室心肌病(ARVC)、癌癥中的轉錄失調、胰腺癌、microRNA與癌癥、結直腸癌、癌癥中的蛋白多糖等信號通路。與代謝相關的信號通路有苯丙氨酸和酪氨酸等多種氨基酸代謝、膽固醇代謝、糖代謝和蛋白質代謝等信號通路。所富集的多個代謝通路與PCR array結果相符。還富集到一些其他的信號通路, 有胞漿DNA感應途徑、卵母細胞減數分裂、孕酮介導的卵母細胞成熟、黏著、RIG-Ⅰ樣受體信號通路、ECM受體相互作用、雌激素信號通路等信號通路。

3 討論

3.1 烯醇化酶1不同修飾多肽改變PAC2細胞生長模式

本文從亞細胞水平和細胞代謝水平相互驗證了4種多肽ENO1對PAC2細胞生長和代謝的影響。首先通過CCK-8細胞活性檢測, 可以反映4種多肽處理細胞后細胞活性和增殖能力, 接著通過胞內外LDH釋放實驗檢測糖酵解代謝和細胞膜完整性, 再用線粒體(綠色)和溶酶體(紅色)專一性染料對4種多肽處理的細胞進行染色, 檢測細胞器形態和代謝功能, 然后通過2-PG和PCR Array實驗檢測糖代謝相關途徑, 最后利用RNA測序進行轉錄組深層功能分析。

線粒體和溶酶體對維持細胞內穩態起到重要的作用, 在很多疾病中都觀察到他們的功能缺陷。線粒體是真核細胞重要的細胞器, 是細胞氧化磷酸化和ATP合成的主要場所, 線粒體與眾多疾病的發生、發展、治療密切相關[19]。線粒體是一個高度動態、呈網絡結構的細胞器, 他們通過不斷分裂和融合來調節自身動態, 交換線粒體內部分子。損傷線粒體可通過與健康線粒體相互融合交換成分, 在一定程度上修復缺陷, 改善功能[20]。因此線粒體的融合和分裂對線粒體形態功能都有很大的調節作用[21]。溶酶體不僅是細胞中物質的降解中心, 也是一些物質代謝過程和細胞生長的重要代謝傳感器[22]。在線粒體自噬和線粒體應激過程中, 線粒體和溶酶體融合來維持線粒體和細胞的穩態; 通過形成線粒體-溶酶體的膜接觸點來維持兩者的動態平衡[23]。線粒體和溶酶體通過RAB7 GTP酶作用相互交流,對細胞功能的完整性有重要作用[17]。結合CCK-8結果和線粒體形態的變化表明4種ENO1多肽影響細胞的生長和代謝狀況, 但只有乙?；揎桬NO1肽EG-Ac促進細胞增殖效果最為明顯。雖然磷酸化修飾多肽EG-Ps和未修飾多肽EG處理后的細胞對照組相比線粒體發生了一定程度的融合, 但都沒有增加細胞膜通透性, 應該是改變細胞代謝的結果。

3.2 烯醇化酶1不同修飾多肽改變PAC2細胞糖代謝模式

LDH發揮作用是Warburg 效應的重要一環, 與惡性腫瘤的增殖和侵襲息息相關[3]。但LDH的具體調節通路不清楚。本實驗結果顯示4種多肽處理后細胞內總LDH的含量均顯著降低。檢測胞外LDH釋放的活性實驗結果表明4種多肽處理后沒有或很少程度的造成細胞膜結構的破壞, 總LDH含量的檢測結果表明4種多肽處理后均顯著下降, 表明4種多肽處理后細胞生成乳酸的能力下降。進一步的2-磷酸甘油酸檢測發現4種多肽處理后2-PG含量顯著降低, 結合LDH檢測結果, 表明4種多肽可能抑制內源性烯醇化酶反應活性的能力, 特別是共價修飾后抑制ENO活性。

進一步利用PCR ARRAY篩選出差異表達的基因進一步分析了修飾化多肽對糖代謝通路的影響。與對照組相比, 磷酸化修飾多肽EG-Ps處理后細胞相關糖代謝通路基因整體上呈現下調趨勢, 表明磷酸化修飾多肽EG-Ps整體上是抑制細胞的糖代謝通路。甲基化修飾多肽EG-Me和乙?；揎椂嚯腅G-Ac對細胞糖酵解、糖異生、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環等糖代謝通路都表現出不同程度的調控作用, 但沒有磷酸化修飾作用明顯。

3.3 乙?；揎椣┐蓟?多肽改變細胞能量和物質代謝模式

PCR ARRAY結果提示乙酰化修飾多肽EGAc可以改變細胞的糖代謝模式, 但可能不是促進細胞增殖的主要原因。進一步的轉錄組結果顯示,GO富集到些ATP結合和分解過程和NAD+ADP核苷轉移酶活性都受到了影響, 說明PAC2細胞內能量代謝發生了變化, 我們推測乙?；揎椣┐蓟?多肽EG-Ac可以改變PAC2細胞的能量代謝過程。

轉錄組結合PCR Array檢測結果顯示, 調節磷酸戊糖途徑中的rbks基因表達上調, rbks基因編碼的蛋白是激酶PfkB家族的一個成員。編碼的蛋白質在ATP和Mg2+存在下磷酸化核糖形成核糖-5-磷酸, 參與調控磷酸戊糖途徑。rbks基因表達上調表明乙?；揎椂嚯目赡芗ぐl磷酸戊糖途徑來增加細胞的核酸代謝。轉錄組結果還顯示乙?；揎椂嚯奶幚砗髤⑴c氨基酸代謝和脂類代謝基因明顯富集。我們推測這些代謝可能是乙?；揎椂嚯奶幚砗蟠碳ぜ毎鲋车拇x機制。

4 結論

烯醇化酶(ENO1)是糖酵解途徑的一個重要蛋白酶, 同時也是一個多功能蛋白。本文研究顯示同一個烯醇化酶蛋白肽經不同修飾處理后, 對細胞生長、代謝途徑, 對細胞線粒體和溶酶體形態結構的完整性都有特異影響。在細胞水平上, 甲基化修飾多肽表現為抑制細胞增殖、乙酰化和磷酸化修飾表現為促進細胞增殖。EG-Ps總體上抑制糖代謝,而EG-Ac促進氨基酸代謝, 脂類代謝和磷酸戊糖途徑促進細胞生長, 并調控一些疾病如一些癌癥和病毒感染等的發生發展過程。不同修飾的ENO1多肽發揮作用的具體分子機制和所調節的代謝通路尚未明確, 有待于進一步研究。本文采用的研究方法對以后ENO1蛋白以及多肽的多功能研究提供了一個新的思路, 也有助于生物活性多肽功能和營養學的研究。