鞍帶石斑魚精子誘導斜帶石斑魚雌核生殖

樊 欣 張維煒 吳廷昌 文 鑫 陳猛猛 吳光燦 駱 劍

(海南大學海洋學院, 海南省院士團隊創新中心, 海南省水產種業工程研究中心,南海海洋資源利用國家重點實驗室, 海口 570228)

數十年來, 人工誘導雌核生殖在理論研究和生產實踐中取得了突出的成就[1—6], 已成為魚類生殖研究與遺傳育種工程的重要組成部分[7]。然而, 雌核生殖在淡水魚[8]中的研究較早、成果豐碩, 而在海水魚[9—12]中, 由于全人工繁殖技術發展較晚, 雌核生殖的研究與應用少。人工雌核生殖作為一種高效的細胞學育種技術, 在海水魚養殖產業蓬勃發展的同時, 必然會受到越來越多的重視。

石斑魚屬于名貴暖水性礁棲魚類, 隸屬鱸形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、石斑魚屬(Epinephaelus), 約有159種[13]。石斑魚產量逐年遞增,據2020年中國漁業年鑒[14]統計, 2019年全國石斑魚養殖產量為18.3×107kg, 較前一年的15.9×107kg增幅14.76%, 僅次于大黃魚(Larimichthys crocea),是我國海水養殖產量第二的魚類, 是一個極具養殖開發潛力的種質資源類群。石斑魚養殖產業快速發展的同時也面臨著病害頻發、養殖性狀參差不齊等亟待解決的問題, 這與石斑魚的良種率低的現狀密切相關。石斑魚性成熟時間長達3—5年,傳統選育周期長。而人工誘導雌核生殖可以實現優勢基因的快速純合與劣勢基因的淘汰[15], 大大提高石斑魚的選育效率。而且, 作為一種先雌后雄的性反轉魚類, 雌核生殖是研究其性別規律的獨特手段。

本研究以斜帶石斑魚為對象, 開展人工誘導雌核生殖的研究, 不僅為良種培育提供理論和技術支持, 也為后續其他熱帶海水魚類開展雌核生殖研究提供了參考依據, 同時對于石斑魚性別決定機制的研究也具有重要價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用親魚由海南青利水產繁殖有限公司提供, 位于三亞鐵路港和陵水新村。選取體表無傷、性腺發育成熟、健康的親魚, 親魚無需催產,用棉布擦干泄殖孔及腹部, 輕輕擠壓腹部即可獲得鞍帶石斑魚鮮活精子及斜帶石斑魚成熟卵子, 精子置于4℃保溫箱中避光待用, 卵子現取現用。

1.2 實驗方法

預實驗鮮精取回需對精子活力進行檢查,以加入海水10min后仍有超過50%精子具有運動能力為精子質量較好。分別設置100、300和500 lx三組紫外強度滅活實驗, 實驗后發現, 使用100 lx滅活精子, 一直滅活到10min, 通過與卵子受精進行倍性檢測, 仍有較高比率的二倍體, 精子滅活不足, 使用500 lx滅活精子, 僅照射30s后, 與卵子的受精能力便快速下降, 照射劑量難以準確把握。使用300 lx滅活5min與卵子受精直至孵化, 發現較高比例的單倍體綜合征, 通過對這些單倍體綜合癥胚胎/初孵仔魚隨機抽取進行倍性分析檢測, 皆為單倍體。

設置受精后5min、15min和25min, 在5℃、10℃和15℃的水溫下, 持續冷休克10min、20min、30min和40min對胚胎進行處理, 所有組的胚胎均經倍性分析儀檢測倍性, 最終檢測到在受精后5min和10℃水溫, 冷休克持續10min、20min和30min均存在冷休克加倍二倍體存在。

綜上, 對所有預實驗條件進行梯度設置, 進行下列實驗。

精子遺傳物質滅活精子稀釋液采用Ts-19[16],精子與稀釋液比例為1﹕9, 取1mL稀釋的精子平鋪在預冷的培養皿中, 緩慢搖動培養皿使稀釋精子厚度均勻確保其充分滅活。紫外燈(Philips, G15T8,wavelength of 254 nm)提前10—15min開啟使照射強度穩定, 采用照度計(Philips, G15T8, wavelength of 254 nm)測量照射劑量; 強度為250—340 lx, 燈箱中心區域是340 lx, 兩端是250 lx, 平均光強為330 lx; 紫外照射過程中保持搖動以確保精子照射均勻。

分別設置精子照射時間對照組(C, 0min)和實驗組分別照射2min、4min、6min、8min和10min,錫箔紙包裹EP管收集照射過的精子置于4℃冰箱中遮光保存備用。滅活完的精子需在顯微鏡觀察是否在滅活過程中被激活。用各實驗組精子與斜帶石斑魚正常卵子授精, 靜水培養, 受精約1.5h后, 顯微鏡下檢查16—32細胞期的受精卵200—300個統計胚胎發育個數, 表觀受精率=(卵裂卵子數/卵子總數)×100。隨后, 將所計數胚胎轉移至燒杯中, 培育至初孵仔魚, 計算孵化仔魚總數和表現單倍體綜合癥(同時采用倍性分析儀鑒定倍性校正)數目, 孵化率=(出苗數/總受精卵數)×100; 用于比較不同照射時長的精子能力, 確定最佳照射劑量。受精卵培養的海水鹽度為30‰, 溫度為26—28℃, 下同。

最佳冷休克啟動時刻實驗冷休克處理時刻實驗組分別設置為C1(正常二倍體對照組)和C2(單倍體對照組, 使用預實驗得到的最佳照射劑量處理得到的精子), 對照組C1用于檢測精子和卵子的質量, 而對照組C2用于檢測精子紫外滅活環節是否達到要求。分別在受精后3min、4min、5min、6min、10min、15min、20min、25min、30min和35min開始進行冷休克處理, 每組的受精卵約為5—10 g, 根據預實驗結果設定冷休克水溫保持在4—6℃, 持續時間為30min, 待處理結束后, 立即使受精卵脫離低溫環境并用大量26—28℃海水清洗并復溫。分別統計受精率, 孵化率和誘導率, 得到最佳處理時刻。

冷休克處理時長和處理水溫實驗冷休克處理時長時間分別設置為C1、C2、10min、15min、25min、30min和35min, 處理水溫分別為1—3℃、4—6℃和7—9℃, 雙因子交叉分組, 冷休克啟動時刻參照冷休克啟動時刻實驗中的最佳結果, 對照組C1和C2條件同上, 以上各組分別設2—3次重復。

誘導率=(二倍體胚胎數/檢測總胚胎數)×100。

胚胎倍性檢測使用Partac倍性分析儀(Sysmex/CyFlowPloidy Analyser)檢測胚胎相對DNA含量測定, 以此鑒定雌核生殖子代的倍性狀態。取正常二倍體對照組(C1)、單倍體對照組(C2)、雌核生殖二倍體實驗組受精后的胚胎/仔魚10—20個, 破碎細胞, 制成細胞懸液, 將勻漿用50 μm的過濾器過濾樣本, 加入1.6 mL DAPI染液染色, 經2—5min孵育后, 上機分析。校準儀器, 電壓為551.5V, 使得正常二倍體的峰值設定在30附近。該設置保持恒定,并且測試樣品通過其主峰的相對位置來表征。

斜帶石斑魚雌核生殖子代的微衛星鑒定從已發表的研究報道[17]中, 查找石斑魚屬微衛星引物, 從26對中篩選出能夠很好鑒定雌核生殖子代的8對微衛星引物, 分別為D316、Mbo061、GAG01、Mbo066、GAA-1、RH_GATA_003、Ec-122、CA-2和GAA-1(表1)。

表1 微衛星引物信息Tab. 1 Microsatellite primer information

分別提取雌核生殖子代14個、正常雜交個體2個、父母本各1個的DNA, 采用微衛星引物行PCR反應, 通過非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測, 常規PAGE膠銀染顯帶。

1.3 數據處理

采用 Excel 統計各項指標, 所有數據均表示為平均值±標準差表示。采用IBM SPSS Statistics 19軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和 Duncan氏多重比較。顯著性水平用P表示,P<0.05 表示差異顯著,P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 最佳精子紫外遺傳滅活條件確定

精子滅活條件實驗中各組受精率、孵化率及單倍體率情況如圖 1。實驗結果顯示: 實驗組中2min、4min與6min組的受精率分別為82%、78.7%和6%, 而8min和10min組的受精率分別為0.5%和0.67%; 2min組胚胎單倍體率為72%, 其余各實驗組所檢測胚胎的單倍率均為100%; 孵化率方面各組分別為80.3%(對照組)、41.3%、2%、0、0和0;2min組及4min組的大量胚胎在孵化前后出現明顯的單倍體綜合征。4min組與其他實驗組相比, 具有較高的受精率、單倍體率和較低的孵化率, 因此確定照射4min (518 mJ/cm2)為最佳精子紫外照射時間, 后續實驗均采用此劑量處理精子。

圖1 不同紫外照射時間對鞍帶石斑魚精子的影響Fig. 1 Effect of different times with UV irradiation on sperm0為正常雜交二倍體對照; n=3; xˉ ±SD0. normal hybrid control

2.2 最佳冷休克處理時刻的確定

分別在受精后的3min、4min、5min、6min、10min、15min、20min、25min、30min和35min時刻冷休克處理受精卵, 處理水溫為4—6℃, 冷休克持續時間30min。實驗結果顯示如圖 2所示: 各實驗組中4min組和20min組顯示出較高的受精率; 孵化率從3min組到6min組呈現逐步上升的趨勢, 6min組孵化率達到29.7%, 后又逐漸下降; 胚胎倍性檢測數據顯示, 6min組二倍體誘導率最高(100%), 統計誘導率時發現15min以后的實驗組孵化率極低, 因此確定受精后的6min為冷休克最佳處理時刻。

圖2 斜帶石斑魚雌核生殖不同受精后啟動時刻的比較Fig. 2 Comparison of different post fertilization initiation times of gynogenesis in Epinephelus coioidesC1. 二倍體對照; C2. 單倍體對照組; 同類型柱形圖中標有不同小寫字母者差異顯著; P<0.05; n=3; xˉ ±SD; 下同C1. Hybrid control; C2. Haploid control; Different superscript letters within the same type of column chart significant difference, P<0.05.The same applies below

2.3 冷休克持續時間和水溫的確定

分別設定冷休克處理持續時間組為: C1、C2、10min、20min、30min和40min, 處理水溫分別設置為1—3℃、4—6℃和7—9℃。Duncan多重比較分析(表2)結果顯示, 不同處理時間(P=0.579)和處理水溫(P=0.133)在受精率方面差異并不顯著,而在孵化率方面不同處理時間組間差異顯著(P=0.002), 不同處理水溫組差異不顯著(P=0.396),從孵化率的角度分析, 處理時間為10min時, 隨著處理水溫的升高, 孵化率也逐步增加; 20min組, 孵化率隨著處理水溫的增加而增加, 在4—6℃處達到最大值, 而后下降; 30min、40min組, 隨著處理水溫的增加, 孵化率表現為下降趨勢。如圖 3和圖 4所示,在4—6℃的水溫條件下處理20min可以得到相對較高的受精率和孵化率。

圖3 斜帶石斑魚雌核生殖不同處理方式受精率的比較Fig. 3 Fertilization rate of different duration times and temperatures of cold shock on gynogenesis in Epinephelus coioidesC1. 二倍體對照組; C2. 為單倍體對照組C1. hybrid control; C2. haploid control

圖4 斜帶石斑魚雌核生殖不同處理孵化率的比較Fig. 4 Hatching rate of different duration times and temperatures of cold shock on gynogenesis in Epinephelus coioidesC1. 二倍體對照組; C2. 單倍體對照組C1. Hybrid control; C2. Haploid control

表2 Duncan多重比較分析數據表Tab. 2 Duncan multiple comparative analysis data table

2.4 單倍體、正常二倍體、雌核生殖二倍體倍性鑒定及形態比較

受精后16h測定正常發育二倍體、雌核生殖二倍體、單倍體的DNA相對含量, 正常二倍體DNA峰值設定為30, 則單倍體DNA峰值為15, 倍性檢測結果見圖 5。

圖5 人工雌核生殖各組DNA相對含量Fig. 5 Relative content of DNA in artificial gynogenesisA. 斜帶石斑魚雌核生殖單倍體; B. 正常發育二倍體對照; C. 雌核生殖二倍體A. Haploid; B. Normal diploid control; C. Gynogenetic diploid

發育形態如圖 6所示: 雜交二倍體精卵狀態良好, 受精后可以正常發育, 具有較高的受精率(90.8%)和孵化率(58.2%)。雌核生殖因為經歷了精子滅活處理以及胚胎冷休克處理, 表觀受精率(40%)和孵化率(29.7%)相比較雜交二倍體都有所降低, 另雌核生殖胚胎在原腸胚期及神經胚期具有較高的死亡率, 神經胚期之后發育正常。雌核生殖個體和雜交二倍體出膜后活力正常。

單倍體胚胎在各個主要的胚胎發育階段都有不同程度畸形: 在細胞分裂期時, 單倍體胚胎細胞隆起但是無法正常分裂; 單倍體胚胎囊胚結束后胚胎異常無法下包進入原腸胚期; 神經胚期, 單倍體胚胎分化異常, 不能形成神經管; 器官形成期, 單倍體胚胎圍心腔較大, 肌節形成緩慢、尾短, 不能運動, 表現出單倍體綜合癥, 僅有4.1%的個體發育到出膜, 少量出膜個體表現為卵黃囊為正常二倍體的130%, 同時期雌核生殖個體尾部長度僅為正常二倍體的31%, 也很快死亡。

2.5 微衛星鑒定結果

8對微衛星引物分別為D316、Mbo061、GAG01、Mbo066、GAA-1、RH_GATA_003、Ec-122和CA-2(表3), 對母本斜帶石斑魚、父本鞍帶石斑魚(誘導精子供體)、雜交對照個體和雌核生殖誘導個體均能擴增出穩定的條帶。結果顯示: 雜交對照樣本N1、N2的條帶均分別來自于父母本; 人工雌核生殖誘導樣本C1—C12中, 11個個體的條帶均與母本保持一致, 而C11個體的7個位點的條帶既有母本條帶也有父本條帶, 該個體應該是紫外照射處理中未滅活精子受精導致; 此外C6號個體在Mbo061位點擴增出父本條帶相同(圖7), 而在其他位點與母本相同, 該個體應為異精效應現象。微衛星結果顯示該批樣品具有91.29%的雌核生殖誘導率。

圖7 斜帶石斑魚人工雌核生殖誘導樣本在微衛星Mbo061位點上的擴增結果Fig. 7 The PAGE gel elctrophpresis figure of primer Mbo061 product♂為父本樣品; ♀為母本樣品; N1、N2為雜交對照樣品; C1—C12為雌核生殖個體樣品♂. Male parent; ♀. Female parents; N1 and N2. Controls; C1—C12. Gynogenetic individuals

表3 斜帶石斑魚人工雌核生殖群體微衛星鑒定結果Tab. 3 Microsatellite identification of artificial gynogenesis population of Epinephelus coioides

3 討論

3.1 異源精子是石斑魚卵子雌核生殖的良好激活源

人工雌核生殖通常采用異源精子作為刺激源[18—20],一方面便于誘導后的鑒定, 一方面異精效應的存在可能帶來新的優良性狀[21]。本文選用異源鞍帶石斑魚的精子作為激活源具有兩個優勢: 其一是鞍帶石斑魚精子量大, 方便獲取; 其二是鞍帶石斑魚與斜帶石斑魚具有明顯的形態學差異, 可以外觀分辨雌核生殖二倍體和雜交二倍體。

本文設置了單倍體對照組對人工誘導雌核生殖進行控制, 單倍體組采用滅活異源精子激活卵子,但不進行二倍化誘導。在正常條件下, 該對照組將出現發育停滯、圍心腔擴大和短尾等單倍體綜合癥(圖6)。若單倍體組中出現正常的初孵仔魚, 則表明該批次滅活的精子存在不徹底的問題, 在胚胎孵化階段就可以排除掉不符合要求的誘導組, 大大降低誘導的錯誤率。

圖6 斜帶石斑魚人工雌核生殖各組主要胚胎發育階段Fig. 6 The main embryonic development stages of artificial gynogenesis groups of Epinephelus coioidesa. 雌核生殖卵裂期; b. 雌核生殖原腸胚期; c. 雌核生殖神經胚期; d. 雌核生殖肌節期; e. 單倍體卵裂期; f. 單倍體原腸胚發育停滯;g. 單倍體神經胚發育停滯; h. 單倍體肌節發育異常; i. 正常二倍體初孵仔魚; j. 雌核生殖二倍體初孵仔魚; k. 單倍體初孵仔魚a. Gynogenetic cleavage stage; b. Gynogenetic gastrula stage; c. Gynogenetic neuroembryo stage; d. Gynogenetic sarcomere stage;e. Haploid cleavage stage; f. Haploid gastrula stage; g. Haploid neuroembryo stage; h. Haploid sarcomere stage; i. Haploid control;j. Gynogenetic diploid; k. Normal diploid control

3.2 低溫短時間處理是斜帶石斑魚雌核生殖的關鍵

雌核生殖中另一個關鍵因素是誘導條件的選擇, 本研究得到的斜帶石斑魚人工雌核生殖的誘導條件為: T(冷休克溫度), 4—6℃; TA(冷休克開始時間), 6min; D(冷休克持續時間), 20min, 這與牙鲆(Paralichthys olivaceus; T, 0—4℃; TA, 2—5min; D,45—60min)[22], 大菱鲆(Scophthalmus maximus; T,–1—0℃; TA, 6.5min; D, 25min)[23], 漠斑牙鲆(Paralichthys lethostigma; T, 0—2℃; TA, 3—4min; D,45—50min)[24], 大黃魚(T, 3—4℃; TA, 2min; D,10min)[4], 黃姑魚(Nibea albiflora; T, 3—4℃; TA,2min; D, 10min)[25], 半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis; T, 5℃, TA, 5min, D, 20—23min)[26]等海水魚類相比(圖8), 處理水溫較牙鲆、大菱鲆、漠斑牙鲆高, 而與大黃魚、黃姑魚、半滑舌鰨比較接近,這與牙鲆等為冷溫性魚類, 而大黃魚等為暖溫性魚類的最適生活溫度有關。

一般而言, 處理起始時刻是最重要的因素, 對誘導效果的影響最大。本研究中受精后4min得到較高的受精率與誘導率, 但是考慮讓受精卵受精過程充分完全, 處理前洗卵所需要的時間, 以及得到更高比例的雌核發育后代群體, 選擇6mpf為最適處理起始時刻, 而10mpf后孵化率與誘導率顯著下降,這可能是處理時刻較晚導致無法充分抑制第二極體排放所致。斜帶石斑魚雌核生殖啟動誘導的時間與歐鱸(Dicentrarchus labrax)受精后的5—6min,以及大菱鲆受精后6.5min較為相近, 不同種魚類適合處理時刻差別與卵子發育速度、培育水溫相關(圖9); 持續時間和大菱鲆(25min)、半滑舌鰨(20—23min)較為接近(圖8), 與不同魚類對低溫的耐受差異相關。石斑魚雌核生殖誘導率在處理時間各組中差異很顯著, 這反應出其胚胎發育對低溫的耐受時間比較敏感相關; 石斑魚人工誘導雌核生殖條件具有中等低溫、短時間處理的特點。

圖8 不同海水魚雌核生殖最佳冷休克溫度和時間Fig. 8 Optimal temperature and time of cold shock for gynogenesis of different marine fishes

圖9 不同海水魚雌核生殖最佳啟動時間Fig. 9 Optimal cold shock start time for gynogenesis of different marine fishes

3.3 斜帶石斑魚雌核生殖后代微衛星鑒定

通常通過染色體核型、子代性狀和單倍體效應[27,28], 來鑒定雌核生殖后代, 利用分子標記技術能快速區分雌核生殖子代和雜交子代[29]。為提高人工誘導石斑魚雌核生殖的成功率, 本研究采用了多組對照條件、倍性鑒定和微衛星標記等手段。單倍體組、雌核誘導組的倍性數據反映出精子滅活的程度; 微衛星鑒定則具有多態性豐富、共顯性遺傳等優點[30]。本研究雌核生殖樣本獲得了平均91.7%的誘導率, 可以滿足研究和應用的要求。其中6號個體在Mbo061位點上被檢測出存在與父本相同的微衛星片段, 這應當是異精效應導致部分鞍帶石斑魚DNA片段整合到雌核生殖后代基因組產生的結果, 這種整合表現可能在子代的生理和代謝方面顯現出差異[21], 異精效應也是石斑魚人工雌核生殖育種關注和利用的重點之一。

人工雌核生殖不僅在提高群體的遺傳一致性和性狀一致性有著重要作用[31,32], 同時雌核生殖子代基因型的純合會導致部分個體近交衰退和致死,從而淘汰群體中的劣質基因。本研究在斜帶石斑魚(♀) × 鞍帶石斑魚(♂)受精細胞學基礎之上, 確定精子滅活的條件, 成功制備斜帶石斑魚雌核生殖子代, 為斜帶石斑魚及其他石斑魚遺傳育種工作奠定基礎。此外, 雌核生殖是研究性別決定機制的重要途徑[33]。本文為研究性逆轉石斑魚的性別決定機制, 提供新的思路和材料。