納米抗體在非洲豬瘟檢測中的應用

王賽楠，安天賜，何 健，石建州

（南陽師范學院生命科學與農業工程學院，河南 南陽 473061）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起豬的急性、高度接觸性、高病死率的烈性傳染病[1]。世界動物衛生組織（OIE）將非洲豬瘟列為法定通報動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[2]。迄今為止，針對非洲豬瘟尚無有效的疫苗和藥物可以使用，它的流行和傳播會給養豬業造成毀滅性打擊[3]。目前對抗非洲豬瘟的主要措施是檢測和撲殺[4]。自1921年肯尼亞首次暴發ASF以來，疫情已蔓延擴散至非洲、歐洲、美洲和亞洲地區，初步呈現出擴大流行的態勢。我國自2018年8月3日在沈陽市確認首例ASF以來[5]，疫情快速蔓延至全國各地。

納米抗體（Nanobody，Nb）是在駱駝、羊駝和鯊魚血清中發現的一種結構簡單、分子量小的新型抗體，具有低免疫原性、穩定性高、特異性高、親和力高、組織滲透性強以及可識別抗原縫隙表位、易于改造、易于制備、成本低廉等特點，在疾病診斷方面具有廣闊的應用前景。

1 非洲豬瘟病毒檢測方法的研究進展

1.1 非洲豬瘟概述

ASFV是一種巨大而復雜、有囊膜的DNA病毒，屬于非洲豬瘟病毒科 （Asfarviridae）、豬瘟病毒屬（Asfivirus）的唯一成員，也是目前唯一已知的蟲媒DNA病毒[6]。病毒粒子系由3萬多個蛋白亞基組裝成的直徑為260～300 nm的球狀顆粒[7]，具有與核質大DNA 病 毒 （Nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV）超家族相同的結構、基因組和復制特性。A SFV編碼的蛋白組裝成了五層結構[8]，內核芯殼（Core shell）、內膜（Inner envelope）、核衣殼（Capsid）、外囊膜（External envelope）從內到外依次將病毒基因組（Nueleoid）多層包裹，呈二十面體對稱結構形態[9]。其蛋白包括結構蛋白在內至少有54種，尚有非結構蛋白100多種[10]。其抗原也表現為多樣性[11]，參與ASFV基因組的復制、修復、轉錄、組裝以及免疫逃逸等生物過程[12]。

ASFV能夠長時間穩定存在于環境中，在豬科動物間高效易感傳播。家豬、野豬和軟蜱為ASFV的天然宿主和傳播媒介[13]。各年齡段的豬均可感染。基于感染不同毒力的毒株，其臨床癥狀表現為四種類型[14]。最急性型；受強毒株感染，患病豬無明顯的臨床癥狀而突然死亡，死亡率達100%；急性型：受強毒株感染，病程為4～10 d，出現高熱和出血癥癥狀，病死率達100%；亞急性型：受中等毒力毒株感染，癥狀與急性型相似但較輕，病程為5～30 d，仔豬死亡率高；慢性型；受低毒力毒株感染，病程為2～15個月，患病豬出現波狀熱、呼吸困難、生長緩慢、皮膚潰瘍以及關節腫脹等癥狀。

2021年初我國出現了基因II型自然變異流行株，其基因組序列均發生不同程度的改變（核苷酸缺失、突變、插入或短片段替換等）[15]。 ASFV變異株毒力較為溫和，但殘存毒力傳染性很強。臨床表現不明顯，隱蔽性強，檢測難度大，使得疫情更加復雜難控[16]。因此，早期診斷和準確快速檢測，是ASF防控體系構建中的關鍵環節[17]。

1.2 非洲豬瘟病毒的檢測方法

目前常用的檢測方法包括病毒分離、核酸和蛋白水平檢測。

核酸水平檢測即分子水平檢測，蛋白水平檢測即免疫學檢測。病毒分離和核酸檢測屬于抗原檢測，是檢測急性期或病程初期感染病毒以及開展潛伏期診斷的有效方法。蛋白水平檢測主要是檢測抗體，包括酶聯免疫吸附試驗ELISA、免疫熒光和免疫層析試紙等方法。

1.2.1 病毒分離。病毒分離是鑒定ASFV的金標準，需要在P3實驗室進行。首先采集臨床疑似感染豬的血液、脾臟和淋巴結等組織，分離病毒，其后接種于豬源原代細胞、巨噬細胞和單核細胞內。ASFV在干細胞中復制增殖，出現紅細胞吸附現象48～72 h后，若發生細胞病變（CPE），則說明檢測樣品中存在ASFV。若細胞分離無變化，或熒光抗體試驗和PCR檢測呈陰性，則需再次接種，傳代3～5代，才可確認樣品為ASFV陰性。可以說病毒分離是分子生物學研究的基礎[18]。病毒分離的缺點是操作繁瑣，鑒定周期較長，需要其他輔助檢測方法參與判定。

1.2.2 核酸水平檢測方法。聚合酶鏈式反應PCR。基于多聚酶鏈式反應PCR的核酸檢測技術是最常用的ASFV實驗室檢測方法，其操作簡便快捷、靈敏度高、特異性強，是國際貿易中OIE指定的ASFV檢測方法。PCR是替代病毒分離鑒定的一種快速、靈敏、特異的ASFV檢測技術。相比于酶聯免疫吸附試驗（ELISA）有著更高的特異性與敏感性。PCR方法對病原核酸純度要求不高，適用于檢測不適合進行病毒分離的腐敗組織或血液樣品。能夠實現早期診斷，是非疫區檢測疫病的重要手段之一，尤其適用于鑒定體外分離不到的病原。普通PCR可用于ASF的監測和診斷[19]。該檢測方法的缺點是容易發生交叉污染和依賴儀器設備。熒光定量PCR（quantitative Real-time PCR，qPCR）是將PCR與光譜進行結合的核酸定量檢測技術，具備傳統PCR的特異、靈敏、快速的特點和光譜技術的高靈敏性和高精確定量的優勢，高效、無需電泳檢測擴增產物，自動化程度高、閉管操作交叉污染概率低，避免了假陽性結果。qPCR包括探針法和染料法[20]。KING[21]等建立的針對ASFV-p72基因序列的qPCR，其引物和探針需經OIE認證。MCKLLEN[22]等建立的分子信號實時PCR靈敏度高，可鑒別診斷與ASFV癥狀相似的豬瘟。2019年初，中國農業農村部公布了第一批ASF現場快速檢測試劑和11種病原學檢測試劑盒，其中60%以上是采用qPCR方法，部分產品的敏感性和特異性達到100%。qPCR方法的顯著優勢在于能夠實時檢測反應過程，測定模板的絕對量。不足之處在于容易出現假陽性，且對引物或探針要求高[23]。病原檢測可采用P72/CD2v/MGF或P72/EGFP/mCherry三重實時熒光定量PCR方法檢測病毒核酸。對不常見的基因變異且具有特殊臨床癥狀的樣品，需再進行全基因組測序鑒別[17]。環介導等溫擴增檢測技術LAMP，該技術無需高溫變性、無需溫度循環、無需電泳、無需紫外監控，操作簡便、檢測時程短、反應快速精確、特異性更高、結果判定直觀且成本低廉，較適用于現場檢測。缺點是容易造成氣溶膠污染，形成假陽性結果。環介導等溫擴增技術（Loop mediated Isothermal Amplification，LAMP）作為一種靈敏高效、特異性強的基因擴增方法，檢測不依賴于設備，能滿足基層現場的快速使用[23]，其為疫情監測提供了一種便捷、準確、低成本的選擇[25]。

1.2.3 蛋白水平檢測方法。主要包括酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光試驗（IFA）和免疫層析試紙。

酶聯免疫吸附試驗 (Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)作為實驗室常用的免疫學檢測方法，有抗原檢測和抗體檢測2種，其中抗體檢測是國際貿易中OIE指定的ASF首選血清學診斷方法。其基本工作原理是通過與酶分子共價結合的抗體和吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合，在底物溶液存在的情況下，由酶分子催化發生顏色反應[26]。 采用《非洲豬瘟診斷技術》（GB/T 18648）規定的間接ELISA，阻斷ELISA等方法進行抗體檢測[17]。ELISA具有高靈敏度、強特異性、可使用自動化設備檢測大量樣本、操作方便的特點。該方法要求操作人員具備一定的專業技術，且必須依賴儀器設備判斷試驗結果，試驗時程長。ELISA方法可通過ASFV常用的靶標抗原 P73、P72、P54、P32/P30 等直接檢測出感染豬抗體[27]。檢測抗原的成本低于PCR，在無特殊儀器設備的實驗室，可以實現在短期內進行大規模篩查。同時，可以輔助病毒學和血清學檢測[28]。ELISA主要適用于亞急性和慢性ASF的診斷。當ELISA檢測結果不確定或者制備抗原出現困難時，可選用IFA血清學檢測方法復核[29]。

間接免疫熒光試驗（IFA）。基于免疫學、生物化學和顯微鏡技術的間接免疫熒光抗體試驗（Indirect fluorescence antibody test，IFA），系利用抗原抗體作用以定位細胞和細胞內抗原物質的一種方法[30]。該方法的特異性好、靈敏度高、成本低，但需要具備培養細胞的試驗條件和熒光顯微鏡等設備。

免疫層析試紙。此為基于單克隆抗體、免疫層析、免疫標記以及新材料等而發展出的一種簡便快速的新型免疫學檢測技術 （Immunochromatographic lateral flow strip test，ILFST）， 又 稱 側 流 免 疫 檢 測 技 術（Lateral flow immunoassay，LFA）。 采用該技術無需專業技能，不依賴儀器，便攜性好、使用便捷、檢測迅速、結果判定簡易、干擾小、成本低[31]。隨著納米粒子與顯色手段的發展，目前免疫層析試紙已不局限于膠體金試紙[26]。采用最新研發的ASFV血清抗體量子點熒光檢測試紙條，配合手持式熒光免疫分析儀，可將高敏感性的量子點標記技術與側向流免疫層析技術相結合，實現了ASF抗體的現場實時POCT檢測[32]。

不同的檢測方法具有不同的特點，在現場檢測中選用哪一種檢測方法需要在比較每種方法的優缺點和適用情景后做出取舍[23]。

2 納米抗體

納米抗體（Nanobody，Nb）作為抗體的新成員，近年來在醫藥檢測和治療領域的發展較為迅速。Nb較傳統的單克隆抗體有著更加優越的應用前景，可以克服傳統單克隆抗體制備成本高、工藝復雜，以及難以人工改造等缺點。

2.1 納米抗體的結構特征

傳統的IgG由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈構成，重鏈間、重鏈與輕鏈間通過二硫鍵連接，重鏈和輕鏈由可變區和恒定區組成，相對分子量約為150 kDa。納米抗體是在駱駝、羊駝和鯊魚體內發現的一種結構特別的抗體，與傳統IgG相比，Nb體積小，呈橢圓形，通常包括骨架區和互補決定區，為凸型結構，利于與抗原結合。故Nb特異親和力更高。單鏈抗體缺少輕鏈和重鏈CH1，只含有重鏈CH2、CH3和可變區。抗原結合部分僅由重鏈可變區構成，尺寸約是傳統抗體的1/10。 Nb主要依靠 3個互補決定區（CDR1，CDR2，CDR3）與抗原分子結合，其氨基酸序列突變性較強。高變區之間骨架區的氨基酸序列變化較小[33]。

2.2 納米抗體的生物學特性

Nb結構簡單、體型小，相對分子量約為15 kDa，較小的分子量和體積使其具有較好的組織穿透力。Nb溶解度高，在于Nb骨架區FR2中的疏水氨基酸殘基突變為親水氨基酸殘基，因而增加了Nb的溶解性[34]。Nb穩定性強、易于保存，對極端條件具有一定的抵抗力。Nb在37℃下可保存1周，在-80℃低溫下可長期保存，甚至可以承受90℃的高溫、高壓以及較寬范圍的pH條件[35]。Nb抗原結合能力強，具有較長的CDR3，能夠形成穩定的凸型結構，更易于進入抗原結構的內部結合隱蔽的位點[36]。為進一步降低Nb的免疫原性，可將特定Nb的CDR移植到人源化的支架上，獲得低免疫原性的Nb[34]。

2.3 納米抗體在免疫檢測中的應用

由于Nb結構功能的獨特性和優越性，因而受到廣泛關注，且已在疾病檢測治療方面得到應用。Nb在ELISA、熒光免疫技術、免疫層析技術、電化學發光免疫分析等免疫學檢測中有著良好的應用前景[37]。利用禽戊型肝炎病毒 （avian Hepatitis E virus,a HEV）ORF2截短蛋白特異性Nb建立的競爭ELISA檢測方法，減少了HRP標記的二抗的使用，縮短了檢測時間，簡化了操作流程。理論上能夠檢測所有基因型的禽HEV，可廣泛應用于雞群禽HEV感染的血清學調查[38]。

3 納米抗體在非洲豬瘟檢測中的應用及展望

Nb是天然缺失輕鏈和重鏈第一恒定區的一種單鏈抗體，分子量小、體積小、溶解性好、結構穩定、特異性高、易于基因改造，并具有易于用細菌大量表達生產等優勢，相較于傳統的單抗，Nb在診斷方面更具有開發價值[33]。

監測ASFV的流行動態，最終實現ASFV的凈化，迫切需要提高檢測水平。納米抗體在ASFV檢測中的應用尚處于起步階段。目前以ASFV p30、p54和p72蛋白的納米抗體與HRP的融合蛋白為檢測抗體，已成功建立了ASF疫病抗體的新型競爭ELISA檢測方法，可用于豬血清中抗體的檢測。該方法操作簡單（無需使用酶標二抗）、便捷，敏感性強，特異性高和生產成本低，具有良好的市場開發前景[39-40]。