泛素蛋白酶體系統在腦卒中后病理過程中的機制探討

李煜超， 王 燕綜述， 鄒 偉審校

腦卒中又稱中風,是一種急性腦血管疾病,其主要特征為腦部血管突然破裂或大腦供血中斷引起腦組織損傷進而導致神經功能障礙,包括缺血性和出血性卒中。在全球范圍內,卒中已成為僅次于缺血性心臟病的第二大死因。目前,研究發現泛素蛋白酶體系統參與了卒中發生和發展相關生物進程。此外,泛素蛋白酶體系統與造成卒中后神經損傷的許多信號通路存在聯系。但是具體機制尚不明晰。本文探討了泛素蛋白酶體系統參與腦卒中后相關病理過程的機制,為進一步研究泛素蛋白酶體系統和腦卒中的治療提供理論依據。

1 泛素蛋白酶體系統

泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin-proteasome system,UPS)是細胞內蛋白質降解的主要非溶酶體途徑,該系統不僅降解錯誤折疊或氧化的蛋白質,還降解具有基本功能的蛋白質,是生理和病理條件下維持蛋白質穩態的重要系統。UPS參與許多細胞過程,包括DNA修復,內吞運輸和免疫反應。UPS對中樞神經系統疾病也非常重要。在阿爾茲海默癥和帕金森病這類因異常蛋白積累而形成的神經退行性病變中,UPS參與了異常蛋白的清理[1]。另外,UPS還參與調控腦血管病的主要危險因素如動脈粥樣硬化、高血壓、高脂血癥等。

2 UPS與腦卒中

UPS與腦卒中后相關的病理變化密切相關,包括線粒體損傷、氧化應激和炎癥反應等。在缺血性卒中后,由于Ca2+超載或線粒體轉換孔的打開等因素,最終導致線粒體功能障礙。而在腦出血中,線粒體呼吸功能障礙是導致腦出血后血腫中氧代謝減少的原因。對功能障礙線粒體的清除有助于神經細胞的生存。線粒體自噬是線粒體質量和數量的重要調控途徑,而UPS在線粒體自噬的調控中起著重要作用[2]。線粒體是氧化能量中心,是細胞生存所必需的細胞器,而老化或受損的線粒體是有毒活性氧的來源。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是氧化應激中重要的信號分子,在腦卒中病理表現中,相對過量的ROS將破壞細胞內環境穩態,導致氧化應激和線粒體損害。Keap1-Nrf2途徑是對氧化應激的主要保護反應,UPS可以通過該通路來嚴格調節轉錄因子Nrf2的轉錄,從而影響抗氧化過程。炎癥是腦卒中后最常見的病理表現之一,可由多種原因引起。炎癥的發生會引起神經毒性作用導致神經元死亡。有研究顯示,UPS參與炎癥的調控。調節UPS可能是控制炎癥的有效途徑。因此,在卒中過程中,通過UPS調控相關通路及其關鍵蛋白可能是保護神經元和防止細胞死亡的有效解決方案。

3 泛素蛋白酶體系統的調控機制

3.1 NF-κB通路與泛素蛋白酶體系統 在靜息狀態下,NF-кB與抑制因子IкB相結合以無活性的潛在狀態存在于細胞漿中。NF-кB信號通路主要包括經典和非經典激活途徑。在經典的NF-кB信號通路中,當細胞受到促炎因子、生長因子、免疫受體配體及應激反應等刺激時,IKK復合體被激活。活化的IKK能特異地催化IκB特定部位絲氨酸(serine,ser)殘基的磷酸化。IκB的磷酸化導致其氨基端第21和22位賴氨酸殘基通過SCF型E3泛素連接酶復合物與多個泛素分子共價結合,這種結合使IκB的空間構象發生變化,導致其被ATP依賴性26S的蛋白酶體所識別并降解[3]。當抑制因子IκB與NF-κB解聚后,釋放的NF-κB二聚體通過各種翻譯后修飾被進一步激活,導致炎癥細胞因子如TNF-α、IL-2、IL-6和INF-γ的產生和釋放。非經典的NF-кB途徑激活依賴于受體激活激酶NIK,NIK可激活IKK復合體中的IKKα亞基。應激條件下,活化后的IKKα可將NF-κB2 p100的C端殘基磷酸化,隨后導致其自身的泛素化,經蛋白酶體識別并部分降解為p52,最終p52-RelB異二聚體進入細胞核啟動轉錄[4]。促炎細胞因子和其他炎癥介質的過度產生會促使組織損傷,NF-κB作為調節炎癥過程中促炎基因表達的中樞轉錄因子,在急、慢性炎癥性疾病中發揮重要作用。

3.2 PINK1/Parkin通路與泛素蛋白酶體系統 Parkin是一種E3泛素連接酶,而PINK1作為Parkin的上游因子,對激活Parkin和將Parkin招募到去極化線粒體上都至關重要。在生理情況下,PINK1的跨膜段部分被位于內膜的早老素相關菱形蛋白(presenilins-associated rhomboid-like protein,PARL)以蛋白質水解方式切割,被切割的PINK1在其N端暴露不穩定的氨基酸殘基,并釋放到細胞質,E3泛素連接酶(UBR1、UBR2和UBR4)以N端規則將其泛素化后通過蛋白酶體迅速降解[5]。當線粒體膜電位出現異常時,PINK1逃避了PARL介導的切割和N端規則依賴性降解,穩定地與外膜轉位酶(translocase of the outer membrane,TOM)結合,并積聚在線粒體外膜(mitochondrial outer membrane,MOM)上。在MOM上積累的PINK1可以通過兩種方式激活Parkin。一方面,PINK1通過直接磷酸化Parkin的UBL結構域中的Ser65激活Parkin[6]；另一方面,PINK1磷酸化在基礎水平時與MOM結合的泛素的Ser65。Parkin對磷酸化泛素的高度親和力促使其定位于線粒體。被激活的Parkin進一步將泛素結合到MOM蛋白上,隨后泛素又會被PINK1磷酸化[7]。PINK1生成的磷酸化泛素作為線粒體上的自噬信號,而Parkin將其放大。隨后,被泛素化的MOM蛋白招募自噬銜接蛋白SQSTM1/P62到受損線粒體,通過自噬促進其降解。在PINK1/Parkin途徑中存在著一些與UPS相關的負性調節機制,這對線粒體自噬的穩定非常重要。泛素特異性蛋白酶30(Ubquitin-specific protease 30,USP30)是一種定位于MOM的去泛素化酶,USP30的存在可以維持MOM蛋白泛素化的穩態,防止過度的線粒體自噬[8]。

3.3 Keap1-Nrf2通路與泛素蛋白酶體系統 核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid2-related factor,Nrf2)是氧化還原和代謝穩態的主要調節因子,具有7個Nrf2-ECH同源結構域(Neh1-Neh7),每個結構域都具有不同的功能。其中Neh2作為Nrf2最重要的調控結構域,包括兩個基序DLG和ETGE,它們可通過與其他蛋白質(如Keap1)的結合來調節Nrf2的穩定性和泛素化[9]。在正常條件下,Nrf2的Neh2結構域通過DLG和ETGE基序的介導在細胞漿中與Keap1中的Kelch/DGR域相互作用,Keap1-Cul3-E3泛素連接酶靶向定位于Nrf2 N端的Neh2結構域的多個賴氨酸殘基,并促進Nrf2的泛素化,泛素化后的Nrf2被遞送至26S蛋白酶體進行降解[10]。氧化應激條件下,Keap1中的關鍵半胱氨酸殘基(cysteine,Cys),尤其是Cys151,充當損傷細胞的傳感器,并被親電物質或ROS共價修飾[11]。這種修飾可能通過破壞Kelch結構域和DLG基序之間的低親和力相互作用,從而誘導Keap1的構象變化,導致Nrf2泛素化受損,阻斷UPS介導的降解,增加Nrf2蛋白水平[12]。

4 腦卒中后UPS在信號通路中的作用

4.1 泛素蛋白酶體系統調控的PINK1/Parkin通路與腦卒中 在腦卒中引起的線粒體功能障礙時,PINK1/Parkin通路介導功能障礙MOM蛋白的泛素化,隨后通過與自噬的串擾清除異常線粒體。事實上PINK1/Parkin通路介導的線粒體泛素化是線粒體自噬的基礎,非活性PINK1不能激活或招募Parkin到線粒體[13]。阻止Parkin的線粒體易位,減少Parkin磷酸化,降低磷酸化泛素水平,可以抑制各種線粒體損傷因子誘導的線粒體自噬[14]。Rakovic等研究發現[15],MOM蛋白可以通過不依賴自噬的UPS途徑降解。較大的MOM蛋白MFN2和TOM70僅通過UPS降解。同時,較大MOM蛋白的降解影響了MOM的穩定性導致其破裂,最終導致線粒體內膜和基質蛋白的二次降解[16]。在氧葡萄糖剝奪(OGD)神經模型中,與對照組相比,PINK1敲除組更容易受到缺血損傷[17]。另外,在創傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)中,Parkin的缺失會增加ROS的產生,促進氧化應激,進一步導致神經元死亡[18]。缺血誘導的大鼠模型的海馬神經元中,PINK1/Parkin介導的線粒體自噬起到神經保護作用[19]。這說明,PINK1或Parkin基因缺失都會加重神經元損傷,而在腦卒中后,提高PINK1和Parkin的表達可以避免大量神經細胞死亡。因此,在后續研究中有必要關注PINK1/Parkin/UPS機制在腦卒中后線粒體損傷中的作用。

4.2 泛素蛋白酶體系統參與NF-κB通路與腦卒中 UPS可通過調控多種炎癥調節蛋白,在炎癥過程中發揮重要作用[20]。腦缺血再灌注過程中,細胞受到氧自由基等因素的刺激,激活IKK,引起IкB磷酸化和泛素化,最終被蛋白酶體識別并降解,NF-κB入核引起炎癥基因的轉錄和表達。腦損傷時IKKα/β被激活,導致IκB的蛋白酶體降解,從而促進NF-κB轉入細胞核,引發炎癥[21]。在卒中急性期,迷走神經刺激可以通過抑制小膠質細胞中的NF-κB通路促進M2小膠質細胞極化并抑制M1小膠質細胞極化以減輕腦損傷[22]。由此可知,抑制NF-κB的活性,可以減輕腦出血或腦缺血后的神經損傷[23]。UPS與NF-κB的激活有關,通過干預UPS可以阻止IκB降解,抑制NF-κB的活性,使NF-κB與IκB結合在細胞溶質中,并且能夠有效減輕腦缺血后的炎癥反應和再灌注損傷[24]。Phillips等對局灶性腦缺血模型大鼠應用蛋白酶體抑制劑PS519,發現PS519可減輕腦損傷大鼠的炎癥并改善神經功能恢復[25]。研究發現,雖然早期干預UPS在轉錄水平抑制NF-κB過度表達具有神經保護作用,但長期蛋白酶體活性降低與細胞內蛋白聚集和遲發性神經元變性以及死亡有關[26]。說明UPS可能對缺血后的神經元發揮雙重作用。提示我們盡管蛋白酶體抑制劑已被證明可在腦缺血中提供保護,但因蛋白酶體活性下降導致的其他神經損傷問題不能被忽略。

4.3 泛素蛋白酶體系統通過Keap1-Nrf2參與腦卒中 Nrf2從Keap1抑制中逃逸是Nrf2介導激活的關鍵事件。腦缺血或腦出血期間,氧化應激使Keap1構象發生變化,Nrf2解離并轉移至細胞核與ARE結合,激活下游抗氧化酶等細胞保護蛋白的因表達。研究表明,缺血腦組織中Nrf2表達顯著上調,多種Nrf2誘導劑在腦缺血后均具有神經保護作用[27]。富馬酸二甲酯(DMF)的直接代謝產物富馬酸一甲酯可直接修飾Keap1的Cys151,促進Nrf2解離起到神經保護作用[28]。此外,在人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y中,miR-7可靶向抑制Keap1 mRNA的翻譯,從而阻止Nrf2蛋白的降解,增加Nrf2的表達量起到細胞保護作用[29]。雖然這些試劑還需在腦卒中模型中進一步研究,但是不可否認的是,在腦卒中后神經元保護方面,通過對Keap1的修飾或抑制,阻止Nrf2被蛋白酶體降解是一個有前景的措施。

5 展 望

UPS是細胞溶質、核蛋白和跨膜蛋白降解的主要途徑,也是維持神經發育、大腦結構和功能的主要調節器。腦卒中后,由于神經元生存的內環境被破壞,引起一系列神經元損傷事件,最終引起神經細胞死亡,導致神經功能喪失。近年來,對UPS的相關研究越來越多。研究發現UPS介導的蛋白質降解是機體調節細胞內蛋白水平與功能的重要機制,參與這一生物學過程的成分主要包括泛素及其相關啟動酶,UPS對維持細胞穩態具有十分重要的作用。目前,腦卒中相關生理病理機制研究有較多研究成果,然而關于UPS與腦卒中的探討不足,缺乏可供參考的文獻。盡管如此,它仍然可能成為基礎研究和潛在臨床應用的新熱點。需要注意的是,泛素化蛋白質的聚集是腦卒中后的重要特征之一[30]。UPS與線粒體自噬、氧化應激以及炎癥反應等腦卒中后相關病理變化的通路的聯系非常密切。研究UPS在PINK1/Parkin、NF-κB、Keap1-Nrf2等通路的調節機制,對于腦卒中患者的臨床治療及預后有重要意義。

目前,還有許多問題需要更多的實驗進行研究,從維持穩態角度看,需要明確如何適度的激活或抑制UPS來發揮細胞保護作用。腦卒中病理過程是一個動態的過程,需要注意分期分階段觀察UPS的變化。由于缺乏對實驗動物藥物副作用的研究和臨床試驗的結果,UPS調節藥物是否介導腦卒中后的細胞保護或細胞毒性的結論依然存在爭議。深入探討UPS與腦卒中之間的關系及其發生機制,對改善腦卒中患者的預后有巨大潛力。