microRNA與雄性生育功能關(guān)系的研究進(jìn)展

田 輝 趙曉曦

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

microRNA（miRNA）是一類長度大約18-24個核苷酸的非編碼RNA。miRNA 的產(chǎn)生是在細(xì)胞核中的RNA 聚合酶II（RNA polymerase II）的作用下，生成長度可達(dá)1000 個核苷酸并帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pri-miRNA，pri-miRNA 經(jīng)過一種被稱為“Drosha”的核糖核酸酶III(RNase III) 進(jìn)一步加工，產(chǎn)生 miRNA 的前體(pre-RNA)，之后被exportin-5 轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中，再由另一種核糖核酸酶III“Dicer”對pre-RNA 進(jìn)行處理，產(chǎn)生一條雙鏈miRNA，又經(jīng)AGO2蛋白做最后處理，從而產(chǎn)生一條成熟的miRNA[1]。miRNA的主要調(diào)節(jié)方式是通過其5′端的2-8個核苷酸序列，與靶mRNA的3′-非編碼區(qū)(3′-untranslated region，3′-UTR)結(jié)合，抑制靶 mRNA的翻譯過程[2]。基于這種機制，miRNA 參與了哺乳動物約50%的基因表達(dá)與調(diào)控，而且一個miRNA往往可以作用于多個mRNA，一個基因也可以由多種miRNA來控制表達(dá)。miRNA在循環(huán)、呼吸、內(nèi)分泌、以及生殖等系統(tǒng)中都有著非常豐富的表達(dá)，參與機體正常的生理活動。在疾病的發(fā)生和發(fā)展中，部分miRNA則會出現(xiàn)表達(dá)異常的情況，這些異常將帶來一些病理變化，這標(biāo)志miRNA檢測具有潛在臨床意義。

一、miRNA 參與精子發(fā)生

（一）miRNA在精子發(fā)生中的表達(dá)

精子發(fā)生可以被劃分為三個階段：二倍體精原干細(xì)胞（spermatogonial stem cells，SSCs）通過增殖分化形成精母細(xì)胞，精母細(xì)胞減數(shù)分裂形成單倍體精細(xì)胞，精細(xì)胞經(jīng)變形形成成熟精子，精子發(fā)育成熟后會被儲存在附睪中。在 2 月齡與 6 月齡、6 月齡與 12 月齡和 2 月齡與12月齡的小尾寒羊睪丸組織中可以分別檢測出5個、1個和4個差異表達(dá)的已知的miRNA，以及132、105和24 個差異表達(dá)的未知miRNA[3]。小鼠SSCs 增殖分化時，miRNAs占總小RNA（total small RNAs）的19%，在減數(shù)分裂期間，最高會達(dá)到60%以上，減數(shù)分裂末期miRNAs 的量則會下降到小于5%，在成熟的精子中，miRNAs 的量約為40%。在小鼠的X-連鎖miRNAs（X-linked miRNAs）家族中有19個基因位于SLITRK 2，3 個基因位于FMR1，而在人類中14 個miRNA 基因位于SLITRK 2，17 個基因位于FMR1[4]。這些數(shù)據(jù)表明，在不同物種之間的miRNA 前體序列具有高度的同源性。而且miRNA 在睪丸組織發(fā)育的不同時期表達(dá)會有差異，在精子生成的過程中，miRNA 的表達(dá)也會有較大的差異。

（二）miRNA參與SSCs的調(diào)控

SSCs 的增殖分化是精子發(fā)生的第一步，miRNAs可以通過各種通路調(diào)控SSCs 的增殖和分化。細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）包括Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1等，它們在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的過程中至關(guān)重要。其中Cyclin B1 對于SSCs 的調(diào)控可能是通過Lin28a 和let-7 miRNA 實現(xiàn)的，敲除Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1基因會導(dǎo)致人SSCs增殖下降，而提高miR-663a可以通過靶向抑制轉(zhuǎn)錄因子NFIX，調(diào)控Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1 的表達(dá)，來促進(jìn)SSCs 分裂[5]。小鼠睪丸中miR-30a-5p的下調(diào)可能導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子受體α1（GFRα1）的降低。GFRα1的降低則可以通過阻斷GDNF/GFRα1/RET 信號通路，來促進(jìn)SSCs 的自我更新[6]。支持細(xì)胞可以分泌的含有miR-486-5p 的外泌體，而SSCs中的miR-486-5p可以下調(diào)張力蛋白同源物基因（PTEN）和上調(diào)視黃酸刺激基因8（STRA8），這表明外泌體miR-486-5p可以通過PTEN/STRA8軸促進(jìn)SSCs 的分化，抑制SSCs 我更新[7]。除上述miRNA之外，miR-322、和Hsa-miR-1908-3p 分別通過Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族基因8（RASSF8）和Kruppel 樣轉(zhuǎn)錄因子2（KLF2）來調(diào)控SSCs的增殖和凋亡[8,9]。這些數(shù)據(jù)表明，SSCs自身產(chǎn)生的miRNAs和外泌體miRNAs均可以參與SSCs的生理活動并且發(fā)揮著重要作用。

（三）miRNA參與精母細(xì)胞減數(shù)分裂

減數(shù)分裂前和減數(shù)分裂過程中所表達(dá)的miRNA有所不同。如 miR-10，miR-10-iso，miR-181，miR-148和miR-143 等在生殖細(xì)胞中的表達(dá)會隨著減數(shù)分裂過程的進(jìn)行逐漸減少。而miR-125、miR-15、miR-99、let-7、miR-143、miR-26、miR-127、miR-22 和 miR-30 等在減數(shù)分裂前表達(dá)增加，在精子細(xì)胞中的表達(dá)量會減少。在臨近精母細(xì)胞減數(shù)分裂時，miR-34、miR-191、miR-470 和 miR-871 家族的表達(dá)均會增加[10]。Wang 等學(xué)者通過對雞精子發(fā)生過程中STRA8（在調(diào)控減數(shù)分裂的起始中起著重要作用）的3′-UTR的miRNAs預(yù)測，構(gòu)建了4 個miRNA，其中miR-31 可以直接靶向抑制STRA8 的表達(dá)從而抑制減數(shù)分裂的發(fā)生，隨后將Gga-miR-218的干擾載體轉(zhuǎn)染到雞的SSCs中后發(fā)現(xiàn)與減數(shù)分裂相關(guān)基因STRA8、DAZL、SYCP3、NANOS3和DMC1有不同程度的下調(diào)，后經(jīng)驗證STRA8是GgamiR-218 靶點之一[11]。miR-29 家族是減數(shù)分裂中是一個重要的調(diào)節(jié)因子[10]：精母細(xì)胞中的miR-29 可以通過下調(diào)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNMT3A）的表達(dá)，使小鼠精母細(xì)胞減數(shù)分裂前期I 期mRNA 的靶基因被廣泛抑制。目前研究顯示多種miRNAs參與到了精母細(xì)胞的減數(shù)分裂過程中，雖有部分調(diào)控機制被證實，但是其中大部分調(diào)控機制尚不明確，仍需實驗驗證。

（四）miRNA參與精細(xì)胞變形和附睪功能

精母細(xì)胞在第二次減數(shù)分裂末期形成單倍體精細(xì)胞，呈圓形，需要經(jīng)過變形才能形成“蝌蚪”狀的成熟精子。在精子染色質(zhì)濃縮變形的過程中，精細(xì)胞中的組蛋白被過渡蛋白（transition nuclear protein，TP）取代，在精細(xì)胞變長的時期，魚精蛋白（Promatine，PRM）會取代TP，在此過程中，PRM可以使染色質(zhì)變得穩(wěn)定，不易發(fā)生突變。在圓形精細(xì)胞中表達(dá)的miR-122a 可以通過調(diào)控TP2，參與到過渡蛋白取代組蛋白的過程中。而 miR-469 可以通過結(jié)合 TP2 和 PRM2 的 mRNA 編碼區(qū)，抑制TP2和PRM2蛋白表達(dá)，參與到精子變形的過程中。miR-888 也可以通過靶向控制精子相關(guān)抗原1和6（SPAG1、SPAG6）的表達(dá)，協(xié)助精子尾部的形成和結(jié)構(gòu)的完整[12]。附睪是連接睪丸和輸精管的組織，成熟的精子會在附睪中儲存，并在此處進(jìn)一步成熟，獲得運動能力。在羊的附睪頭和體之間有13個已知的miRNA 差異表達(dá)，頭和尾之間有29 個，體和尾之間有22個，其中l(wèi)et-7、miR-541-5p、miR-133b和miR-150可能在羊附睪精子成熟調(diào)控中發(fā)揮重要作用[13]。睪丸和附睪頭中由小管連接，這些小管中有類似輸卵管中的纖毛組織，在把精子從睪丸送到附睪的過程中起著重要的作用。滅活小鼠的miR-34b/c 和miR-449 后，小鼠出現(xiàn)了精子成熟障礙的表現(xiàn)，而且睪丸重量增加，連接睪丸和附睪頭的小管明顯增大[14]。而與人類初級纖毛運動障礙相關(guān)基因DNAH6 是miR-34b/c 和miR-449 的靶點。因此推測，miR-34b/c 和miR-449 可能通過參與纖毛的發(fā)生影響精子的成熟。

二、miRNA與雄性精子質(zhì)量、胚胎發(fā)育

（一）miRNA在男性不育中的表達(dá)

在全球范圍內(nèi)，約8-12%的夫妻患有不孕癥，并且有相當(dāng)部分不孕癥患者的病因不明。而患有不孕癥的夫婦中，男性因素達(dá)到了50%。其中無精子癥（azoospermia）、少精子癥（oligospermia，OS）、弱精子癥（asthenozoospermia，AZS）和畸形精子癥是男性不育的重要精液表相。Salas[15]在對8例精子參數(shù)正常、但是女方無法受孕的男性精液進(jìn)行分析，并與對照組比較后發(fā)現(xiàn)，共有57個miRNAs在群體中差異表達(dá)（45個表達(dá)上調(diào)，12個表達(dá)下調(diào)），針對這些miRNAs，共預(yù)測了8606 個靶基因。另一項研究發(fā)現(xiàn)，在不育男性中有5種miRNAs顯著上調(diào)，3種miRNAs表達(dá)下調(diào)，而且精子濃度與多種miRNAs 的表達(dá)水平（let-7a、miR-7-1-3p、miR-141、miR-200 A、miR-429）呈顯著負(fù)相關(guān)[16]。鑒于miRNA在精子發(fā)生過程中的重要作用，miRNA也許可以成為男性不育的診斷依據(jù)和生物學(xué)標(biāo)志，在男性不育診治過程中起到作用。

（二）miRNA與無精子癥、少精子癥和弱精子癥

無精子癥患者可以分為梗阻性無精子癥（OA）和非梗阻性無精子癥（NOA）。有研究報道，在OA 與NOA患者的病例分析中發(fā)現(xiàn)hsa-miR-27a-3p的表達(dá)有顯著差異，在NOA 患者精液中其表達(dá)為上調(diào)，并可以通過靶向下調(diào)賴氨酸去甲基化酶3A（KDM3A）參與NOA 的發(fā)生[17]。Cito[18]檢測了 14 例 NOA 患者血漿中循環(huán)miR-20a-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與正常人相比，其表達(dá)量顯著增高。而在NOA 患者睪丸組織中miR-10b-3p 和miR-34b-5p的組合對NOA的診斷具有較高的準(zhǔn)確度，可以作為診斷男性不育的生物學(xué)標(biāo)志物。外泌體miRNAs的分析可能成為檢測疾病或者判斷身體情況的一種新手段，檢測無精子患者精漿外泌體中miR-539-5p和miR-941的水平可以用于鑒定睪丸中是否有精子的存在[19]。運用這種方法可以在睪丸穿刺診斷NOA 前，給予醫(yī)生參考。miR-371 家族在生殖系統(tǒng)腫瘤中得到了大量的研究，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為miR-371 家族具有成為睪丸生殖細(xì)胞腫瘤的新血清標(biāo)志物的潛力。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-371-3p的表達(dá)與精子濃度和精子總數(shù)顯著相關(guān)，可以作為OS 的生物學(xué)標(biāo)志物[20]。線粒體miR-17～92 的缺失可以破壞精子的發(fā)生：在僅敲除小鼠睪丸miR-106b～25 基因后，小鼠睪丸體積變小，表現(xiàn)為OS，但依然具有生育能力，而 miR-17～92 和 miR-106 b～25雙基因敲除的小鼠則表現(xiàn)為睪丸組織嚴(yán)重受損，生育能力明顯降低[21]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA 在AZS 患者精液中的表達(dá)與正常人有差別，Heidary[22]在AZS 患者的精液里發(fā)現(xiàn)了18 種差異表達(dá)的miRNAs，其中miR-888-3p 的上調(diào)似乎與特發(fā)性AZS 有關(guān)。SEMG1是精子中一種重要的分泌蛋白，它參與了精子凝膠基質(zhì)的形成。而AZS 患者SEMG1 基因的mRNA 和蛋白水平明顯高于正常人，并且miR-525-3p 可以與SEMG1 基因的 3′-UTR 結(jié)合，靶向調(diào)控 SEMG1 蛋白的表達(dá)[23]。不僅如此，AZS患者精液中的miR-135a-5p可以通過靶向抑制Janus激酶2（JAK2），從而影響精子活力[24]。線粒體相關(guān)miR-4485-3p 被發(fā)現(xiàn)在AZS 患者精液中表達(dá)下調(diào)，并且其三個靶基因（DNAH 1、KIT 和PARK 7）可能通過影響線粒體功能，涉及AZS 的病理機制[25]。

（三）miRNA與畸形精子癥和不良妊娠結(jié)局

精子貢獻(xiàn)了胚胎50%的遺傳物質(zhì)，因此精子異常不但會影響受孕，而且還會影響到妊娠結(jié)局。精子的形態(tài)、膜的完整性、精子畸形率和精子DNA 完整性等因素異常是造成不良妊娠結(jié)局的重要因素。Gholami[26]用Westernblotting 方法檢測畸形精子癥患者miR- 582-5p和CRISP2（富含半胱氨酸的分泌蛋白，CRISPs）的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)miR-582-5p 在畸形精子癥患者的精液里表達(dá)上調(diào)，而CRISP2 的表達(dá)下降，之后又檢測畸形精子癥患者精液CRISP3 的表達(dá)，并且測定了靶向CRISP3的 4 個 miRNAs，發(fā)現(xiàn)有三 個 miRNA（miR-182-5p，miR-192-5p 和 miR-493-5p）有上調(diào)，并且 CRISP3 糖基化亞型的表達(dá)水平明顯低于正常人。推測miRNAs靶向調(diào)控CRISP2和CRISP3可能是畸形精子癥發(fā)病的一個機制。精子染色質(zhì)和DNA 異常被認(rèn)為是早期流產(chǎn)的原因之一。精子DNA碎片指數(shù)（DFI）是一個體現(xiàn)精子DNA完整度和受損程度的指標(biāo)。在高DFI的精漿標(biāo)本中 miR-374b 和 miR-26b 的表達(dá)會下降[27]，因此miR-374b 和miR-26b 可能是反映精子質(zhì)量的指標(biāo)，從而預(yù)測產(chǎn)婦的妊娠結(jié)局。

目前對于OA、NOA、OS 和AZS 的診斷依賴于精液分析，但是精液分析對于男性不育的指導(dǎo)價值有限，并不能完全反應(yīng)男性真實的生育能力。大量研究表明miRNAs在精子質(zhì)量異常的精液里的表達(dá)有顯著差異，可以作為生物學(xué)標(biāo)記物參與到疾病的診斷中，但多數(shù)研究的重點是miRNAs的表達(dá)差異與OA、NOA、OS和AZS的相關(guān)性，對于具體調(diào)控機制的研究仍然不足。

（四）精源性miRNA與受精

通常認(rèn)為人卵巢排出的卵子并未徹底完成減數(shù)分裂，還屬于初級卵母細(xì)胞，其在輸卵管內(nèi)受成熟促進(jìn)因子和細(xì)胞生長抑制因子的刺激發(fā)育到第二次減數(shù)分裂中期，而卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂就需要精子或者其他物質(zhì)的作用才能進(jìn)行，精子中所帶的這種物質(zhì)被稱為精源性卵母細(xì)胞激活因子（sperm-borne oocyte activation factor,SOAF）。鈣離子振蕩是卵母細(xì)胞激活的一個重要機制，而磷脂酶 C-zeta（phospholipase C zeta,PLCz）作為卵母細(xì)胞鈣離子震蕩的重要調(diào)控因子現(xiàn)已被證實是SOAF 的一種，Schrimp R[28]在對漢諾威溫血馬的PLCz1 的基因經(jīng)行測序后，發(fā)現(xiàn)在其基因內(nèi)含子里含有miRNA 的基因序列，這說明miRNA 可能會參與到PLCz1的的表達(dá)，從而影響卵母細(xì)胞的激活。Li[29]在對比公豬新鮮的精子和獲能的精子后發(fā)現(xiàn)了12個差異表達(dá)的 miRNAs（8 個已知 miRNAs，4 個未知 miRNAs）可能通過PI3K-AKT、MAPK、cAMP-PKA 和鈣離子信號通路參與到精子的獲能過程中。由此可見精源性miRNAs可以通過調(diào)控其靶基因參與到激活卵母細(xì)胞和精子獲能的過程中，從而影響受精過程。

（五）miRNA與胚胎早期發(fā)育

在受精卵形成之后隨即開始分裂，從單個細(xì)胞變更成多細(xì)胞囊胚的過程中有著多種因素的調(diào)控，miRNAs在其中也發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-449b[30]在精子中的表達(dá)明顯高于在卵子中的表達(dá)，在牛的1細(xì)胞胚胎、2 細(xì)胞胚胎和8 細(xì)胞胚胎時期，體外受精、體細(xì)胞核移植胚胎和孤雌激活胚胎之間的miR-449b表達(dá)并沒有顯著差別，并且精子攜帶的miR-449b 并沒有下降。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)miR-449b 的過表達(dá)增加了體細(xì)胞核移植早期胚胎的整體組蛋白乙酰化水平、延長了胚胎的第一次卵裂時間、降低了胚胎凋亡指數(shù)，并測得 CDK6、C-MYC、HDAC 1 和 BCL-2 均是miR-449b 調(diào)控對象，這些數(shù)據(jù)說明精源性miR-449b可以通過調(diào)控上述基因的表達(dá)參與早期胚胎的發(fā)育。Alves[31]在對有著不同受孕率的冷凍公牛精子中的miRNAs 分析后發(fā)現(xiàn)有9 個miRNA 的表達(dá)有差異（miR-205、-505、-532、-33b、-126-5p、-216b、-339a、-500和-542-5p），而且與 miR-216b 呈負(fù)相關(guān)的K-RAS 在兩細(xì)胞胚胎第一次卵裂和囊胚時期大量表達(dá)，由此推測精源性miR-216b 可能通過調(diào)控K-RAS 參與到牛胚胎早期的分裂。Qin[32]觀察了普通受精組、體細(xì)胞核移植組（NT-C 組）和注射了精子攜帶的miRNA 的體細(xì)胞核移植組（NT-T 組）兔子的胚胎發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)NT-C 組的組蛋白H3 水平顯著高于受精組和NT-T 組，NT-C 組的囊胚凋亡指數(shù)明顯高于受精組和NT-T 組，NT-C 組胚胎的總細(xì)胞數(shù)顯著低于受精組胚胎，注射精子攜帶的miRNA 可顯著增加體細(xì)胞核移植囊胚的總細(xì)胞數(shù)。用精子介導(dǎo)的pLenti-III-GFP-miR-Off-Let-7a載體處理獲得的卵母細(xì)胞經(jīng)激活發(fā)育后，可以檢測到卵母細(xì)胞中 miR-Let-7a 的表達(dá)降低、Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）在基因和蛋白質(zhì)水平上表達(dá)較高、并且觀察到滋養(yǎng)層細(xì)胞向子宮內(nèi)膜細(xì)胞的附著和遷移顯著增加，這說明miR-Let-7a 通過調(diào)控TLR4，參與到胚胎的著床過程[33]。先前的實驗發(fā)現(xiàn)精源性miR-34c 是小鼠受精卵第一次分裂不可或缺的調(diào)控因素，而后另一篇報道發(fā)現(xiàn)miR-34b/c 和miR-449 是精子發(fā)生所必須的，但不是在受精或者胚胎發(fā)育之前不可缺少。造成矛盾結(jié)果的原因可能是先前的研究使用的是miR-34c的抑制劑，而且 miR-34c 屬于 miR-34a、miR-34b/c 和miR-449a/b/c 家族，它們擁有相同的 3′-UTR 識別種子序列，因此它們都是功能冗余的，家族中的一個失活不會影響表型[34]。miRNAs 在胚胎發(fā)育過程中的研究主要以母體產(chǎn)生的miRNAs 和胚胎發(fā)育過程中出現(xiàn)的miRNAs為主，對于精子攜帶的miRNAs在這一鄰域的研究還處于起步階段，而且部分功能和調(diào)控機制還存在爭議，仍然需要學(xué)者繼續(xù)努力。

總結(jié)與展望

男性不育病因目前尚未完全明確，因此男性不育的治療也難以展開。已有的研究表明，精液質(zhì)量是引起男性不育的重要因素，精子在發(fā)生過程中出現(xiàn)異常將會極大的影響精液質(zhì)量。目前已有大量學(xué)者們發(fā)現(xiàn)了眾多與調(diào)控精子發(fā)生和男性生育相關(guān)的miRNAs差異表達(dá)和調(diào)控通路，包括調(diào)控SSCs的增殖分化、減數(shù)分裂、精細(xì)胞變形和附睪功能，其中差異表達(dá)的miRNAs可以做為生物學(xué)標(biāo)志為醫(yī)生提供參考。發(fā)現(xiàn)更多miRNAs在其中的作用有助于明確男性不育的病因，為診斷和治療提供新思路。由于精子攜帶的miRNAs 在受精及胚胎的早期發(fā)育過程也起著重要作用，異常的精源性miRNAs也會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，甚至造成流產(chǎn)等不良妊娠結(jié)局。胚胎發(fā)育異常被認(rèn)為是流產(chǎn)的主要因素之一，但依然有一半的流產(chǎn)病因無法確定，深入研究精源性miRNAs在胚胎發(fā)育過程中的作用機制有助于了解流產(chǎn)的病因，從而探討新的預(yù)防、診斷和治療的方法。