大連地區先兆性流產與亞甲基四氫葉酸還原酶多態性關系的研究

孫紹華，劉瑩，于海華

（大連市婦女兒童醫療中心（集團）遺傳代謝醫療中心，遼寧 大連 116000）

葉酸是人體自身不能合成的重要營養素，屬于B族的水溶性維生素。經過腸道吸收的葉酸通過亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）轉化生成5-亞甲基四氫葉酸，不僅可提供同型半胱氨酸的代謝過程中所必須的甲基供體，同時在細胞周期等生命活動中具有重要作用，參與DNA 氧化損傷修復、組織的生長、細胞的增殖、蛋白質代謝等活動，與維生素B12共同作用促進紅細胞的生成、成熟[1-2]。同型半胱氨酸代謝途徑的關鍵酶由于基因突變導致MTHFR基因677C/T多態性有3個基因型，分別是CC型（野生型）、CT 型（雜合突變型）及TT 型（純和突變型），MTHFR酶活性降低會導致同型半胱氨酸向甲硫氨酸的轉化率降低，因此，同型半胱氨酸在TT基因型的人群中水平會顯著增高，高同型半胱氨酸對胚胎發育有一定的影響，可能會導致唐氏綜合征、神經管畸形、先天性心臟病等出生缺陷；同時，妊娠期高血壓、胎盤早剝、反復流產、先兆子嫻等孕期疾病的發生可能與血漿中同型半胱氨酸水平升高有一定的相關性[3]。先兆性流產[4-5]是一種較常見的孕期癥狀，是指在孕28 周前陰道出現少量的流血，繼而出現陣發性下腹疼痛或腰痛，經盆腔檢查子宮口未開胎膜完整，無妊娠物排出，癥狀嚴重者，可能發展為流產[6-7]，對孕婦及家屬造成較大的心理傷害。本研究旨在檢測本地區葉酸代謝相關的基因MTHFR多態性的分布情況，分析本地區育齡女性先兆先流產與MTHFR 多態性的相關性，以期為預防本地區孕婦先兆性流產及孕期葉酸補充提供指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月至2020年5月于本院就診的380例先兆流產患者作為先兆流產組，另選取同期孕期各項檢測指標均正常且無任何不良妊娠疾病的孕期女性508名作為正常對照組。所有研究對象孕齡均＜13 周，年齡22～40 歲。研究對象均簽署葉酸基因檢測知情同意書，抽取外周血于EDTA 抗凝管保存。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法1.2.1 設備與試劑 Fluorescent Quantitative PCR Detection System 熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測系統9600 系列。亞甲基四氫葉酸還原酶基因677C/T 檢測試劑盒（PCR-熒光探針法）購于泰樂德醫療有限公司。

1.2.2 檢測方法 取EDTA 抗凝管中50 μl 全血樣本加入1.5 ml離心管中，加入150 μl氯化銨、碳酸氫鈉、乙二胺四乙酸混合液沉淀DNA，14 000 r/min離心2 min，棄上清，加入150 μl 十二烷基硫酸鈉和蛋白酶K混合液進行洗滌，14 000 r/min離心2 min，棄上清，加入50 μl 裂解液混勻65°C 水浴5 min，最后加入15 μl含有三羥甲基氨基甲烷、碳酸氫鉀的穩定液，混勻后檢測DNA檢測濃度。八連管反應孔中加入預配置好的PCR擴增體系（氯化鎂、Taq酶，探針，脫氧核苷酸等）16 μl，分別加入4 μl 的待檢測樣本DNA，同時做好陰性陽性對照。探針：MTHFR1-F 5’-CGAAGCAGGGAGCTTTGAGGCTG-3，MTHFR1-R 5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3。

將上述放入反應管放入熒光定量PCR 擴增儀中，擴增程序如下：50 ℃2 min，95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，45個循環，擴增反應完成后，收集熒光信號進行檢測結果分析。

1.3 統計學方法 采用SPSS 23.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗 對兩組MTHFR基因多態性分布數據進行遺傳平衡檢驗，樣本有區域代表性符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡規律，可以對收集到的數據進行比較和分析。

2.2 兩組MTHFR 的基因型構成與基因頻率比較正常對照組的MTHFR C667T 位點野生CC 型占21.6%，雜合突變CT 型占48.2%，純合突變型TT 型占30.2%；先兆流產組MTHFR C667T 位點野生CC型占17.9%，雜合突變CT 型占47.3%，純合突變型TT 型占34.8%，兩組MTHFR C677T 基因型構成比較差異無統計學意義。

正常對照組突變基因T 的基因頻率為54.3% ，C的基因頻率為45.7%；先兆流產組突變基因T的基因頻率為58.4% ，C的基因頻率為41.6%。兩組C、T等位基因型頻率分布比較差異無統計學意義。

3 討論

葉酸的代謝吸收在胎兒生長發育過程中十分重要，妊娠期間孕婦對葉酸的需求量是普通人群的4 倍，人體內葉酸、同型半胱氨酸的水平與MTHFR基因多態性相關，如葉酸代謝酶活性降低導致同型半胱氨酸水平升高可能會引發妊娠期孕婦復發性流產、胎盤早剝、妊娠高血壓及胎兒神經管畸形等出生缺陷[8]。同型半胱氨酸代謝途徑的關鍵酶MTHFR[9]能夠催化5，10 -亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，可為同型半胱氨酸代謝提供甲基，因此，能夠降低同型半胱氨酸水平。MTHFR基因位于1 號染色體q36.3，長度約為2.2 kb，共有11個外顯子，已發現MTHFR有20余種基因多態性的突變位點，最常見的是第5 外顯子上677 位點的突變，此位點的胸腺嘧啶替代了胞嘧啶，在體內形成CC 型、CT 型及TT 型3 個基因型，MTHFR 酶的活性降低是由于此突變導致丙氨酸突變為纈氨酸所致。有研究指出在CT 基因型（雜合突變型）人群中MTHFR 酶活性降低約35% ，在TT 基因型（純合突變型）人群中MTHFR 酶活性降低50%～70%[10]，MTHFR酶活性降低，導致血漿中同型半胱氨酸增高，可能會引發一系列出生缺陷。

本研究對該地區先兆流產的女性和孕期表型正常的女性進行MTHFR 基因多態性檢測，結果顯示，先兆流產組與正常對照組MTHFR基因型構成、等位基因分布結果比較差異均無統計學意義。提示，本地區MTHFR C677T位點生突變與先兆流產并無明顯相關性，引起先兆流產的因素復雜多樣，受環境、營養狀況和遺傳因素的共同影響，尚需進一步分析檢測。

目前，我國推行的孕期保健措施是指導孕婦在孕前3 個月至孕早期3 個月每天補充0.4 mg 的葉酸，在葉酸攝入無差異的情況下，由于MTHFR 突變，TT型、CT型個體相較于CC型個體，體內葉酸水平降低20%左右，導致部分孕婦葉酸缺乏，進而使子代存在神經管畸形、唐氏綜合征及心臟畸形等風險[11-13]，通過對備孕女性或者孕早期女性進行MTHFR C677T 基因遺傳學檢測，并根據本地區葉酸代謝基因型分布的特點，因人而異制定個性化的葉酸補充方案，對遺傳上存在葉酸代謝障礙風險的人群（如TT 型）指導其增加補充葉酸劑量，幫助孕期女性合理補充葉酸，能有效達到預防出生缺陷的目的。