動脈粥樣硬化與CD36相關的氧化應激研究進展

王丹丹，封 銳，師 帥，魏娜敏，胡元會

導致動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發生的機制十分復雜，氧化應激是重要的機制之一。 活性氧(ROS)在體內的作用與其濃度相關，中等濃度的ROS能夠傳遞重要信號[1]，然而過量或持續的ROS產生，會導致負責清除ROS的系統超負荷，此類現象稱為氧化應激(oxidative stress，OS)。目前可知的多種AS致病原因，如吸煙[2]、糖尿病[3]、高脂血癥[4]、高血壓[5]等，均能夠增加ROS產生，損害內皮功能，降低一氧化氮(NO)生成。當過量的ROS產生，以及低密度脂蛋白(LDL)氧化物增加時，會促進AS的形成[6]。

1 AS中的氧化應激系統

在血管壁中，存在許多ROS生成系統，如還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidases，Nox)、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)、線粒體和功能失調的內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)系統。這些氧化劑生成系統之間存在著相互作用[7]，Nox能引起eNOS系統解偶聯[8]、XO活性升高[9]以及線粒體ROS生成。

1.1 Nox系統 Nox是人體內最重要的ROS生成系統之一。最初，Nox是在吞噬細胞質膜上被發現，后來研究證明其不僅在浸潤的單核/巨噬細胞中表達，而且血管壁中也有表達，隨后，作為Nox2(gp91phox)的同源物Nox1、Nox3、Nox4、Nox5也被發現，統稱為Nox家族，是具有多亞基單位的酶復合物，在ROS形成過程中有重要作用。

Nox的各種亞型在AS中的作用已經被研究過[10]。有研究顯示，在小鼠中，Nox1和Nox4由血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表達[11]，Nox2和Nox4由內皮細胞表達[12]。Nox1在ApoE-/-小鼠中的缺失可緩解AS發生，Nox2缺失也被證明與小鼠降主動脈AS的減少有關。但是，Nox4在AS形成中的作用是有爭議的，有不同證據證明其對AS有保護和促進功能。有研究發現，Nox5在小鼠基因組中缺失，但在糖尿病、高血壓和人類AS病變中上調[13]。巨噬細胞的Nox活性是氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)生成的重要組成部分[14]。并且，Nox活性還被認為在內皮黏附分子的表達、單核細胞的浸潤和VSMCs增殖中起作用[15]。

1.2 XO系統 XO存在于內皮和血漿中，產生超氧陰離子和過氧化氫(H2O2)。有證據顯示，在實驗性AS和人AS斑塊中，內皮細胞XO[16]和血漿XO[17]的活性均升高，即證明了由XO生成的超氧化物能促進AS形成[18-19]。另外，血管緊張素Ⅱ和振蕩剪切應力可增加內皮XO的表達[20]。研究表明，XO抑制劑可以減少ApoE-/-小鼠AS的發展[21]，減輕重度吸煙者的內皮功能障礙[22]。另外，XO能夠刺激巨噬和VSMCs表達清道夫受體氧化低密度脂蛋白受體-1(LOX-1)和CD36，增加ROS生成，促進泡沫細胞形成。此外，XO產生的尿酸也可通過促進CD36表達觸發泡沫細胞形成[23]。

1.3 線粒體電子傳遞鏈 線粒體酶在生理狀態下產生超氧陰離子，也可因功能障礙或抗氧化機制失效導致過量ROS產生。近年來對ROS與炎癥發生機制的研究發現，來自線粒體的ROS作為信號轉導分子，可引起內皮功能障礙，并與eNOS解耦聯，誘導炎癥細胞浸潤和活化，增加內皮細胞和VSMCs的凋亡[24]。此外，動脈粥樣硬化性高脂血癥、高血糖均可誘發線粒體功能障礙。線粒體ROS的生產過剩可導致LDL氧化增多，促進AS進展[25]，并且其功能障礙可導致細胞凋亡的發生，導致斑塊穩定性降低以致破裂。Nox系統和線粒體系統在ROS生成和內皮功能障礙方面存在相互作用，這可能與AS的發生有關。

1.4 功能障礙的eNOS系統 NO可通過激活eNOS系統在內皮中持續生成。但是在與氧化應激相關的病理條件中，或者當eNOS的輔因子四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)血管組織水平較低時，可導致eNOS功能障礙，從而產生超氧化物而不是NO。研究表明，eNOS輔助因子的有效性與內皮功能障礙的發展呈負相關[26]。體外實驗研究證明，eNOS中的NO構成抗AS分子，對AS有保護作用[27]，eNOS缺乏可加速eNOS缺失小鼠AS病變的過程。

2 CD36在AS氧化應激中的作用

清道夫受體是糖蛋白受體之一，于人體組織中大量表達，能促進AS形成，其主要亞型包括：SR-A、SR-B、CD68(SR-D)、LOX-1(SR-E)、SREC(SR-F)以及SR-PSOX(SR-G)[28]，其中SR-B分為SR-BI和CD36兩個亞型。Kunjathoor等[29]研究證明對ox-LDL進行識別的主要清道夫受體為CD36。CD36可于不同細胞中表達，如單核與巨噬細胞、血小板、內皮和VSMCs等[30]，可與多種組織蛋白結合。其中，單核巨噬細胞上的CD36是吞噬攝取ox-LDL的主要受體。關于CD36的調節，Nicholson[31]研究證明，ox-LDL可以通過活化過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)調節CD36的轉錄。另有研究發現，胞內膽固醇能使CD36表達升高[32]，轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)β1和TGF β2均通過PPARγ途徑下調CD36的表達。另外，CD36亦能促進凝血和單核細胞聚集、促進炎癥反應和氧化、凋亡等多種功能，是非常重要的一類糖蛋白受體。

配體介導的CD36信號的特點是促進細胞內ROS的產生，而ROS依賴于環境和細胞類型。血管、造血細胞產生ROS的機制各不相同，CD36在VSMCs、內皮、單核、巨噬細胞和血小板中均能參與氧化應激的發生。

2.1 CD36參與VSMCs氧化應激過程 VSMCs對血管的功能和血液流動至關重要，其功能障礙可在血脂異常時導致AS病變發生，增加斑塊破裂的風險。當VSMCs表達CD36時，其具有調節血管功能的作用。值得注意的是，當VSMCs受到氧化脂質的刺激時，CD36信號下調了關鍵的抗氧化因子，如氧化還原敏感因子核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)等。有學者發現在化學誘導的動脈損傷后，CD36-/-小鼠血管壁中的ROS明顯低于正常型小鼠，表明CD36可能參與了VSMCs自身ROS的生成[33]，并且證實了氧化還原敏感轉錄因子Nrf2介導的VSMCs中的CD36相關通路能夠下調內源性的抗氧化防御。轉染Nrf2或其下游靶點[如血紅素加氧酶-1(HO-1)]在體內外均能抑制ROS的生成，改善AS和阻塞性血管疾病[34-35]。Nrf2的下調是通過Src家族激酶成員Fyn的磷酸化實現的，并且在CD36信號通路中的下調并不是唯一的。Nrf2的激活因子如ox-LDL和4-羥基壬烯醛(4-HNE)，可促進小鼠巨噬細胞[36]和巨噬細胞樣細胞系[37]中CD36的表達。Nrf2介導CD36表達以支持瘧原蟲吞噬的過程也印證了上述機制[38]。

2.2 CD36參與內皮細胞氧化應激過程 CD36也表達于微血管內皮細胞(microvascular endothelial cells，MVEC)，在內皮功能中發揮作用。CD36與血小板反應蛋白(TSP)-1和TSP-2及其他幾種抗血管生成蛋白結合時，是通過與血小板反應蛋白結構同源重復序列(thrombospondin structural homology repeats，TSR)區域相結合以發揮作用的[39]。CD36識別TSR區域可促進MVEC的凋亡信號，增強促血管新生的血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)的去磷酸化程度，減少內皮細胞遷移[40]。MVECs上的CD36也能識別細胞外囊泡表面的陰離子磷脂酰絲氨酸，從而抑制細胞遷移[41]。這是與Src家族激酶Fyn、Nox的激活和ROS的生成途徑相關的。當CD36的遺傳缺失，Src家族激酶或Nox受藥理學抑制，或SOD對過量ROS進行了清除時，則囊泡介導下的內皮細胞遷移可以恢復。這些數據表明，CD36產生的ROS能夠在循環細胞外囊泡大量存在的特定條件下調節MVEC的遷移。

2.3 CD36參與單核/巨噬細胞氧化應激過程 研究提示CD36具有促進巨噬細胞中ROS生成的功能[42]。阻斷CD36或抑制Nox可減少ox-LDL誘導的ROS形成，證明了巨噬細胞中CD36信號可直接誘導ROS形成[43]。Kotla等[44]發現CD36基因表達在巨噬細胞系統中受到ROS的機械調控，是通過調節布魯頓酪氨酸激酶(Bruton′s tyrosine kinase，BTK)磷酸化酰基轉移酶p300的途徑來驅動CD36表達，隨后P300能夠活化信號轉導和轉錄激活因子(STAT)1。這些信號事件隨后促進STAT1和PPARγ驅動CD36的表達。這些研究將巨噬細胞系統ROS的產生與蛋白質的遺傳轉錄聯系起來。同時有研究顯示，氧化脂質刺激巨噬細胞也能夠上調PPARγ介導的CD36表達的轉錄途徑[45]。

氧化甾醇能夠通過部分依賴清道夫受體的機制在單核/巨噬細胞中促進AS進展。有研究表明，氧化甾醇[46]，特別是7-酮膽固醇被證明可以促進巨噬細胞中CD36基因的表達，并能夠促進ox-LDL的攝取，加劇泡沫細胞的生成[47]。

2.4 CD36參與氧化應激過程調控血小板活化 有證據顯示，CD36與氧化的LDL或微粒結合，能夠激活血小板活化過程[48]。在不良因素(如高脂血癥和氧化應激)刺激下，該通路在體內被活化。CD36基因的缺失可保護小鼠免于生成與高脂血癥相關的病理性血栓，但對正常止血無明顯影響。因此，以CD36或其信號通路為基礎，有可能研究出可供AS病人使用的新型抗血栓療法。在脂質代謝紊亂小鼠模型中，血小板CD36能調控血小板活化與聚集；而在人類中，血小板CD36受體表達增加與ox-LDL介導的血小板活性升高和血栓形成風險具有相關性。

2.4.1 CD36參與氧化應激相關的血小板信號傳導途徑 在血小板中，CD36與多種信號通路相互作用。有研究表明，CD36能夠招募并激活Fyn和Lyn，Fyn是血小板中能夠與ox-LDL和其他配體相結合的主要的Src家族激酶之一[49]，可促進脾酪氨酸激酶(Syk)活化[50]、ROS產生[51]，以及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)激活[52]。

目前，由ROS激活的血小板通路尚未完全確定。但是血小板確實表達了一些氧化還原敏感的細胞因子，如MAPK家族成員[53]，這些因子在ROS及H2O2刺激下可以激活。在典型的MAPK家族中，血小板系統中的CD36信號轉導促進c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)2[54]和細胞外信號調節激酶5(extracellular signal regulated kinase，ERK5)的激活。這兩種激酶都對氧化還原信號敏感，可通過外源H2O2干預或細胞內ROS信號刺激被激活[55]。盡管血小板中ROS是否能直接激活JNK尚不清楚，但JNK對CD36激活血小板和加速動脈血栓形成是非常必要的[56]。有研究顯示，用藥物JNK抑制劑SP600125可阻止ox-LDL激活血小板[57]。研究顯示JNK在野生型小鼠的血栓中直接激活，而在CD36缺失的動物中沒有，JNK也能夠通過經典的生理激活劑如蛋白酶激活受體或膠原受體糖蛋白Ⅵ等促進血小板活化[58]。ERK5是MAPK系統中的一員，近幾年備受人們關注。有研究發現，血小板ERK5能夠被產生ROS的生理激動劑不同程度地激活[59]。此外，細胞暴露于H2O2后，可直接激活血小板ERK5。在小鼠心肌梗死模型的ROS生成較豐富的組織缺血時，血小板ERK5激活能夠促進其梗死面積進一步擴大。

另外有研究顯示，血小板衍生微粒(platelet micro-vesicles，PMVs)是血栓形成的主要原因，PMVs可能是氧化應激激活血小板的重要來源，氧化應激可啟動AS血栓形成的凝血過程[60]。PMVs是氧化損傷、MAPK信號和血小板活化的中樞介質，ox-LDL能夠顯著促進PMVs產生。PMVs與血小板CD36的結合觸發絲裂原活化蛋白激酶激酶4(MKK4)/JNK信號傳導并激活血小板。此外，PMVs以CD36和磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)依賴方式增強血小板氧化產物。另外，還發現PMVs與血小板的相互作用促進了人8異前列腺素F2α(8-iso prostaglandin F2α，8-iso-PG-F2α)的產生，這是氧化應激發生的一個重要指標。這一功能依賴于CD36和PS，提示CD36不僅能激活血小板，而且能增強氧化應激，因此可以認為ox-LDL刺激產生的PMVs能夠促進血小板活化和氧化應激，而氧化應激的增強進一步增加了PMVs的生成。

Nox1和Nox2是血小板中產生ROS的主要復合物[61]。Violi等[62]研究表明，Nox產生的ROS能夠促進血小板活化。Magwenzi等[63]研究表明，ox-LDL與血小板CD36結合能夠刺激Nox2表達，從而促進血小板ROS和超氧化物的生成，并且激活Nox2的過程是與CD36信號通路相關的，強調CD36調節ROS產生能夠驅動體內和離體血小板激活。

2.4.2 CD36參與氧化應激降低血小板抑制傳導途徑 敏感性NO-環磷酸鳥苷(3′-5′-cyclic guanosine monophosphate，cGMP)-蛋白激酶G(protein kinases G，PKG)信號通路對體內血小板功能的調控至關重要，NO激活可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylyl cyclase，sGC)產生cGMP[64]。cGMP依賴性激酶(cGMP-dependent kinase，cGK)是cGMP的主要細胞受體[65]。然后，cGK催化其底物磷酸化，從而啟動各種細胞反應，如平滑肌松弛、血小板聚集延遲等[66]。有研究證明，CD36產生的ROS抑制了NO/cGMP信號介導的天然血小板抑制途徑[66]，發現CD36/Nox產生的ROS能夠調節PKG以阻止其底物-血管擴張刺激磷蛋白(vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP)的下游激活，而VASP是血小板抑制性信號傳導的中樞。ox-LDL導致血小板cGMP通路敏感性降低進而阻止下游信號傳導，為氧化脂質促進血小板活化提供了新的機制。然而，當血小板與抗Src家族激酶、磷脂酶C-γ2(PLCγ2)、蛋白激酶C(PKC)和Nox的CD36阻斷單克隆抗體或抑制劑共同孵育時，ox-LDL介導的脫敏可被阻止。因此，以上研究表明，CD36的氧化還原信號事件除了對促進血小板活化途徑的作用外，還對血小板抑制途徑產生負面影響。

3 小 結

目前研究存在的問題有：①在體內氧化應激系統里，Nox家族的Nox4在AS形成中的作用具有爭議，最近的一些研究表明其對AS形成有保護作用，證明了氧化應激系統在人體中的作用多樣且復雜，對其認識還不足，需要更深入的研究；②氧化應激直接導致ERK5激活的機制尚不清楚，了解其信號轉導機制，對于闡明一種新的途徑具有重要意義；③在平滑肌細胞中，CD36信號產生ROS的具體來源尚未確定，有藥理學研究表明，ROS可能來自線粒體和非線粒體來源[67]。VSMCs的CD36信號通路中ROS來源還需要更深入的研究。

CD36作為促AS發展、促血栓形成和抗血管生成物的受體，其相關研究已經取得一定的進展，其介導的氧化還原信號是多途徑的，與其他氧化途徑息息相關，受各種細胞因子的調控。隨著研究方式的進展，未來可以應用多種成像和分析方法對其功能進行探索。也可以從已知的氧化系統及通路入手，研究CD36與系統中各組分的關聯，探索其影響氧化應激的新的機制。氧化應激過程是影響AS發生和進展的主要機制之一，而內皮產生的NO能夠延緩AS形成。目前所知的多種危險因素能夠降低內皮細胞NO的產生，并且促進各種氧化應激通路產生ROS，包括Nox、XO、功能障礙的eNOS和線粒體。AS發生過程中的關鍵分子事件，如脂蛋白和磷脂的氧化修飾、內皮細胞活化和巨噬細胞浸潤、活化，都受到氧化應激的促進。因此，除了防治已確定的危險因素外，對血管氧化應激的預防和內皮功能的改善也應當被作為治療的途徑之一，為臨床藥物開發和應用提供新的角度和思路。