ELISA在獸醫實驗室檢測的應用

黃 雨，寧璐璐

（西北農林科技大學動物醫學院 712100）

夏商周時期甚至更早之前，人類就知道診斷并治療疾病，最初主要依靠對表面現象的觀察和簡單經驗的積累。現代醫學診斷學是在物理、化學等基礎學科以及微生物學發展的基礎上逐漸形成的更為精細的診斷學，因為顯微鏡的方面而研制出細菌分離培養、血清學診斷法，提高了疾病診斷的科學性和準確性。近年來，細菌學、病毒學、血清學、免疫學等迅速發展，由此也創建了針對特定的生物學病原的實驗室檢查、診斷方法和技術，顯著地提高了獸醫臨床診斷的準確性、科學性和應用價值。1971年，Engvall和Perlmann分別研發出了酶聯免疫吸附試驗，即ELISA，可用于檢測體液中微量物質。ELISA是疾病診斷中的一種新方法，不僅可以檢測特異性抗原，如病毒、細菌、寄生蟲或者是血清中的激素水平，還可用于定量或定性地檢測血清中的抗體水平，現已在多種疾病的臨床診斷方面得到推廣。目前使用結果顯示，ELISA具有敏感性強、特異性高、簡便快速且易于自動化操作等特點，不僅適用于臨床疾病診斷，而且也適用于流行病學調查。ELISA可用于檢測抗原或抗體，現已作為一種對疾病進行早期診斷的快速檢測技術，對于有效診治及防控動物疾病具有重要意義。

1 ELISA的基本原理與分類

杜敏等[1]介紹了實驗室常規ELISA檢測的基本原理、操作要領及注意事項。ELISA的基本原理是利用抗原-抗體特異性反應，把某種抗原（或抗體）吸附于固相載體表面，再用某種特定酶標記抗原或抗體，測定時將受檢樣品和酶標抗原或抗體根據不同的方法依次與包被在固相載體上的抗原或抗體進行反應，形成抗原抗體復合物，洗去多余物質，加入底物后，底物被固相載體上的酶催化成有色產物，根據有色產物的量來確定待檢樣品中抗原或抗體的有無及多少。由于酶催化效率很高，間接地放大了免疫反應效果，從而使這種檢測方法具有很高的敏感度。經過多位研究人員的改進與優化，目前常用的ELISA有間接ELISA（常用于檢測抗體）、夾心ELISA（常用于檢測大分子抗原）、競爭ELISA（常用于檢測小分子抗原）等。

2 ELISA在幾種動物疾病檢測中的應用

2.1 ELISA在犬細小病毒病檢測的應用

犬細小病毒病（Canine Parvovirus Disease，CPVD）是犬細小病毒（Canine Parvovirus，CPV）引起犬的一種具有高度接觸性傳染的烈性傳染病，各種年齡段的犬均可感染，斷乳前后的幼犬極為易感，臨床特征以出血性腸炎和非化膿性心肌炎為主，具有較高的發病率和致死率，對犬類的健康造成了極大的危害，同時也給我國養犬業帶來了重大的損失。因此，對隱性感染CPV的犬和發病犬進行早期快速診斷，對預防該病的流行具有重大意義。

目前可根據血液學檢查結果和臨床癥狀對感染犬進行初步診斷，運用血凝與血凝抑制試驗、血清中和試驗、免疫擴散試驗、ELISA等可對CPVD進一步確診。其中酶聯免疫吸附試驗因特異性強、敏感度高、易操作而廣泛應用于犬細小病毒病的快速診斷。在國外已有商品化試劑盒，國內也有多位學者已研制出快速診斷試劑盒。CPV診斷的ELISA方法包括間接法、抗原競爭法、Dot-ELISA等。由姜騫[2]等研制的犬細小病毒ELISA抗體檢測試劑盒，是將大腸桿菌原核表達系統獲得的CPV-2 VP2蛋白經親和層析柱純化后，以此為包被抗原創建的檢測CPV抗體的間接ELISA法，試驗結果表明該方法具有良好的重復性，準確性以及特異性。除此之外，劉劍郁[3]等研發的間接ELISA法是用犬腎細胞增殖犬細小病毒，純化后作為包被抗原;國內也有學者建立了Dot-ELISA法診斷CPV，并發現其敏感性比常規ELISA更高。由此可見，ELISA技術現已成為一種廣為應用的快速診斷CPV的方法。

2.2 ELISA在貓免疫缺陷病診斷的應用

貓免疫缺陷病（FID）又被稱為貓艾滋病，是由貓免疫缺陷病毒（FIV）引起貓的慢性接觸性傳染病，該病毒導致機體免疫力下降，病貓常表現出發熱、口炎、腹瀉以及神經癥狀等，并伴有各種繼發性寄生蟲疾病[4]。盡管FIV致死率極高，但是對感染的貓進行恰當的治療可延長病貓的生命，因此貓免疫缺陷病的早期確診具有十分重要的意義。

FIV具有很長的潛伏期，貓感染后出現的臨床癥狀大多是由于機體免疫系統被破壞，其他病原趁機襲入機體導致繼發性感染的結果，所以其他一些與貓有關的疾病的臨床癥狀在感染FIV的貓上均有所體現，因此僅憑臨床癥狀的觀察無法進行FIV的準確診斷。據報道，目前該病的確診主要依靠病毒分離和抗體檢測。病毒分離培養法是確診該病的最佳方法，但因其檢測周期長而不常用;ELISA技術由于具有較強的特異性、較高的敏感性、操作簡便、快速、成本低、易于大量檢測，是目前應用較多的一種檢測方法，主要通過全血、血清或血漿等樣本檢測病毒p15和p24蛋白的特異性抗體。潘美喬[5]運用ELISA和PCR兩種方法共同檢測了在哈爾濱和上海市收集到的274只流浪貓感染FIV情況，結果顯示11只為陽性，陽性總檢出率為4%。趙莎莎[6]采用免疫熒光試驗和ELISA檢測感染貓血清中抗體，研究表明采用ELISA檢出抗體比免疫熒光試驗更早，而且滴度高，但也會存在假陰性的情況。Natasa[7]等通過酶聯免疫吸附測定和聚合酶鏈反應對42只家貓進行FIV感染患病率調查。通過ELISA試驗檢查的42只貓中，FIV抗體血清反應陽性的有14只（33.3%），在PCR分析中，FIV陽性的有11只（26.2%）。FIV陽性貓的平均年齡為6歲，其中室外貓(65%FIV)和雄貓(71.4%FIV)的感染率較高。這項研究中使用的兩種測試的結果均表明，斯洛文尼亞的貓中感染的患病率均很高，并且發現ELISA方法可用作快速檢測FIV感染的篩選測試。

2.3 ELISA在犬心絲蟲病診斷的應用

犬心絲蟲又名犬惡絲蟲，寄生于犬等其他動物的右心室及肺動脈內（少見于胸腔、支氣管），其成蟲寄生于心臟內，引起循環障礙，呼吸困難及貧血等癥狀，最終致死。心絲蟲是動物心血管系統中最常見的寄生蟲之一，除犬以外，貓及其他野生動物也易感[8]，美國、日本均出現過相關報道，在我國也分布甚廣，北至沈陽，南至廣州均有發現。葉青華和陳濤[9]首次在國內使用商品化犬心絲蟲快速檢測試劑盒(ELISA法)，同時也采用了改良Knott’s法對四川省境內的128只工作犬(包括警犬和護衛犬)進行了感染率調查，其感染率分別為20.31%和5.47%，結果表明ELISA法檢測效果明顯優于改良Knott’s法，同時也證明四川盆地是犬心絲蟲病的流行區域。

甄森萍[10]等介紹了目前常用的犬心絲蟲病的檢查方法，包括直接檢查、血涂片檢查法、淡黃層檢查法、改良Knott's技術、過濾技術、酶聯免疫吸附法等10余種實驗室檢查方法，并表明酶聯免疫吸附法的更具有優勢。姜鑫[11]等建立了基于重組MTFP基因蛋白的犬心絲蟲抗體Dot—ELISA檢測方法，結果表明該方法敏感性高、重復性好、特異性強，并且可直接觀察結果，易于在基層檢疫工作中推廣，為犬心絲蟲病的臨床診斷提供了一種切實可行的新方法。

3 總結

動物疾病臨床診斷常用的細菌培養、細胞培養等微生物檢查方法特異性雖強，但費時費力，檢測成本高且不易推廣;聚合酶鏈式反應受影響因素很多，結果不穩定，精確度低;免疫膠體金技術、乳膠凝集試驗、血凝試驗快速簡便易操作但敏感性較低。ELISA方法特異性強、敏感性高、快速簡便，在獸醫臨床、流行病學調查中應用越來越多，技術也越來越成熟，相關檢測試劑盒陸續被開發和應用。但該技術的穩定性亟待提高，操作過程中各個環節均可對檢測結果產生較大影響，因此技術操作的規范化與標準化顯得尤為重要。這樣才能使得不同實驗室與不同操作員得到的檢測結果均具有參考價值，進而更好地應用于獸醫臨床疾病診斷和生產實踐。