中性粒細胞胞外誘捕網與急性腎損傷研究進展

熊號峰，劉景院

(國家傳染病醫學中心 首都醫科大學附屬北京地壇醫院重癥醫學科，北京 100015)

中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)是中性粒細胞在各種刺激因素作用后釋放的一種網狀纖維結構，可以直接捕獲微生物發揮生理作用[1]。研究發現，NETs如果生成過多或沒有及時清除，還可能引發系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)、抗中性粒細胞胞質抗體(antineutrophil cytoplasmic antibody,ANCA)相關性小血管炎、類風濕關節炎、囊性纖維病和癌癥等疾病[2]。NETs和細胞外組蛋白會通過多種不同的方式影響腎臟，導致各種類型的腎臟損傷，包括急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)。AKI是指因各種原因導致腎臟功能在數小時內快速下降，主要表現為血清肌酐水平升高，進行性尿量減少或兩者同時存在[3]，NETs可能通過不同的途徑影響AKI的發生和發展。本綜述總結了NETs不同組分導致腎臟損傷的機制，并分析了NETs與不同類型AKI發生的關系。針對NETs相關的組織損傷機制來制訂治療策略可能有助于改善腎臟疾病的嚴重程度。

1 NETs的形成及釋放

1.1NETs、NET形成 中性粒細胞作為機體固有免疫組成部分，可通過吞噬和分泌細胞因子的方式殺滅病原體[1]。2004年，Brinkmann等[4]發現在12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇刺激下，中性粒細胞可以釋放出一種直接捕獲微生物的網格狀纖維性結構，稱為NETs。這種網狀結構主要以DNA為支撐結構，其內填充顆粒蛋白和肽類等。NETs不斷形成的過程也被稱為NET形成，目前認為這是一種新發現的細胞死亡方式。有研究表明，胞外誘捕網也可以從其他免疫細胞釋放，包括巨噬細胞、嗜堿粒細胞、嗜酸粒細胞和肥大細胞[5]。

1.2NETs的合成及主要組分 在12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇激活中性粒細胞后，細胞核中組蛋白在肽酰精氨酸脫亞氨酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PAD4)的作用下發生瓜氨酸化，降低了DNA和組蛋白結合的緊密強度。其后，中性粒細胞彈性蛋白酶作用于組蛋白，導致細胞核內的染色質解離[1,4]。解聚后的DNA、瓜氨酸化組蛋白和顆粒蛋白，在細胞質內合成NETs，進而釋放到細胞外。NETs的主要組分為游離DNA、組蛋白、高遷移率族蛋白B1、乳鐵蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶、髓過氧化物酶、蛋白酶-3和組織蛋白酶G[6]。

1.3NETs的釋放 目前已知，NETs的釋放存在兩種不同的方式：①中性粒細胞發生死亡，染色質及NETs相關蛋白質通過破裂的細胞膜，釋放到細胞外。通常由12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇、抗體、膽固醇晶體誘發，在刺激數小時后中性粒細胞死亡。②中性粒細胞不發生死亡，染色質及NETs通過囊泡排出細胞外，細胞膜重新封閉[4-6]。細胞膜保持完整，仍具有趨向性及吞噬作用。通常由金黃色葡萄球菌通過補體受體或Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)2，或通過大腸埃希菌作用于TLR4或TLR4激活的血小板誘導[7]。

2 NETs導致腎臟組織損傷的機制

盡管NETs是人體正常的先天性防御系統的一部分，但是NETs的組分可以直接或間接導致組織損傷和誘發機體自身免疫，因此NETs的過量生成或清除障礙可能對腎臟及其他臟器存在損害。研究表明，NETs具有潛在毒性，可以導致腎小球損傷[8]。中性粒細胞降解酶可導致內皮細胞凋亡，同時使基底膜發生降解。而腎小管間質損傷會導致腎小球血流量減少，從而更易產生NETs[9-11]。缺氧以及損傷可導致腎小管上皮細胞釋放組蛋白，繼而激化中性粒細胞生成更多NETs，并產生促炎性細胞因子釋放到血液，對內皮細胞繼續造成損害[8-9]。此外，NETs還可以通過激活補體的途徑而發生血管損傷，并通過誘導內皮-間充質轉化促進腎臟纖維化[9]。NETs相關的腎臟疾病的組織損傷介質主要包括DNA、組蛋白、中性粒細胞彈性蛋白酶、自身抗體和補體等。

2.1DNA和組蛋白 NETs的游離DNA和組蛋白可激活凝血途徑，促進凝血酶生成、血小板聚集、凝血酶原活性、P-選擇蛋白、磷脂酰絲氨酸和因子Ⅴ的表達而促進凝血，同時抑制纖維蛋白溶解[12]。細胞外組蛋白具有細胞毒性，可引起內皮功能障礙，導致器官功能衰竭[13]。在體外研究中，細胞外組蛋白可致使腎臟血管內皮細胞和腎小管上皮細胞死亡[14]。同時，細胞外組蛋白還可以增加活性氧的產生，可募集中性粒細胞，并可產生更多的NETs，形成了有利于NETs產生的惡性循環[15]。

2.2中性粒細胞彈性蛋白酶 Pieterse等[8]研究證明，在NETs相關的炎性疾病中，中性粒細胞彈性蛋白酶、血管滲漏和纖維化過程之間存在聯系。內皮細胞的吞噬能力如果不足以處理過量形成的NETs，就會通過中性粒細胞彈性蛋白酶介導血管內皮鈣黏蛋白水解，導致細胞間連接破壞而發生血管滲漏，從而在水腫和蛋白尿的發展中發揮作用。此外，還可以通過β聯蛋白信號轉導引起的內皮-間充質轉化，內皮-間充質轉化通過改變細胞形狀、極性、運動性和產生膠原蛋白，可導致間質纖維化，從而促進腎臟疾病的發生和進展[16]。

2.3自身抗體 在多種腎臟疾病中普遍存在組蛋白、雙鏈DNA和中性粒細胞顆粒蛋白等NETs組分的自身抗原。此外，ANCA的自體抗原均是NETs組分[17]。當自身無法清除與NETs相關的抗原時，炎癥組織損傷后新的細胞內抗原進一步被釋放，因此每次疾病發作均會引發新的自身抗體產生和組織損傷[18]。NETs也增加T細胞介導的抗原反應并激活B細胞，以誘導免疫球蛋白和抗體產生[19]。盡管自身抗體可通過多種機制引起細胞損傷和免疫激活，但免疫復合物沉積是自身抗體導致發病的重要原因，它可以激活靶細胞通過Fc受體并引起吞噬作用，導致炎癥介質的釋放和細胞毒性。循環中含有DNA和抗雙鏈DNA抗體的IgG免疫復合物是導致腎炎的因素。自身抗體重鏈高變區尤其是高變區-3中的殘基以及抗體的同種型和亞類決定了臨床腎炎的風險[20]。

2.4補體系統 有研究表明，C3和C3a受體缺陷型小鼠中性粒細胞不能形成NETs，補體系統與NET形成相關[21]。通過經典或替代途徑引發的補體蛋白介導的調理作用對于NETs釋放至關重要。除C3外，過敏毒素C5a還通過上調TLR和補體受體來募集并激活中性粒細胞，從而增強NETs的釋放[22]。

3 NETs與不同類型AKI發生的關系

NETs和細胞外組蛋白會通過多種方式影響腎臟，導致各種類型的腎臟損傷。首先，當腎臟出現感染時，NETs作為機體的一種防御因子發揮作用，同時可能會導致腎臟局部或者遠隔臟器的損傷[14]。其次，NETs還可能導致各種形式的無菌壞死性炎癥、促進微血管和大血管血栓形成。再次，如果NETs清除受損，機體可能產生針對NETs組分的自身免疫，例如ANCA和抗核抗體，進而導致AKI的發生。AKI的病理表現通常包括腎小管損傷、腎血管功能障礙、過度炎癥和免疫細胞浸潤[23]。

3.1NETs與缺血再灌注損傷導致的AKI 在缺血再灌注損傷中，NETs誘導腎小管上皮細胞死亡，通過血小板與中性粒細胞的相互作用促進腎小管周圍毛細血管形成血栓，并引發其他中性粒細胞的NET形成[24-25]。有研究表明，在缺血性AKI中，可檢測到循環和局部NETs和組蛋白水平的升高，同時PAD4在腎臟中的表達增加[26]。PAD4主要在中性粒細胞表達，在缺血再灌注損傷后的腎小管周圍毛細血管、腎間質間隙和腎小管中聚集，在AKI發生過程中釋放NETs[14]。使用藥理或遺傳方法抑制PAD4，減少了炎癥和NETs形成，可以防止動物模型中的AKI發生；同時脫氧核糖核酸酶Ⅰ或抗組蛋白IgG促進NETs的降解也減少了腎臟損傷。這些研究均表明了NETs形成在缺血性AKI發生中的重要性[14,24]。腎小管壞死和NETs形成還可以通過釋放組蛋白和細胞因子進入血液循環而加劇遠端器官功能障礙，這也是嚴重AKI的常見特征。

3.2NETs與溶血性尿毒癥綜合征引起的AKI 研究表明，在溶血性尿毒癥綜合征引起的AKI過程中也有NETs釋放，且與健康受試者相比，溶血性尿毒癥綜合征患者血漿中循環細胞游離DNA和核小體的含量增加[26]。NETs可促進微血管系統的炎癥反應和血栓形成，導致溶血性尿毒癥綜合征期間的腎衰竭。

3.3NETs與ANCA相關血管炎導致的AKI ANCA是以單核細胞及中性粒細胞胞質成分髓過氧化物酶及蛋白水解酶3為靶抗原的自身抗體。ANCA相關性血管炎是一種壞死性血管炎，主要影響小血管。其以小血管壞死性炎癥、大量巨噬細胞及中性粒細胞浸潤為主要表現。可以累及多種器官(包括腎臟、肺、皮膚)以及外周神經系統，預后差。主要病變類型有韋格納肉芽腫病、顯微鏡下型多血管炎、變應性肉芽腫性血管炎、節段壞死性星月體性腎炎，統稱為ANCA相關性小血管炎[27]。

中性粒細胞可以被一系列促炎癥因子(白細胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β和脂多糖等)刺激而處于半激活狀態，中性粒細胞內蛋白水解酶3、髓過氧化物酶抗原轉移至中性粒細胞表面。ANCA與蛋白水解酶3、髓過氧化物酶抗原結合后，激活了PAD4依賴的NETs釋放途徑[28]。此外，中性粒細胞激活后可以引起呼吸爆發，導致具有致病活性的各種蛋白酶及活性氧的大量產生，進而導致NETs的釋放。氧自由基的釋放可同時促進聚集的單核巨噬細胞釋放炎癥因子，而ANCA與中性粒細胞Fc受體Ⅲb型受體結合可以上調黏附分子，進一步促進中性粒細胞與內皮細胞的黏附[19]。另外一些促炎癥因子(如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)又會增加中性粒細胞中蛋白水解酶3的表達，繼續與ANCA反應。ANCA介導的中性粒細胞脫顆粒后，使內皮細胞直接暴露于蛋白酶的損傷中。除此之外，ANCA可以激活內皮細胞，這些效應包括使內皮的通透性增高，使炎癥細胞和血小板更易黏附于內皮細胞表面，并導致內皮細胞分泌細胞因子增多，從而導致內皮細胞損傷[29]。由此可見，ANCA及各種黏附、炎癥因子與內皮細胞、中性粒細胞以及NETs之間互相影響，引起一系列免疫反應，造成持續的血管壁或組織損傷。

3.4NETs與系統性紅斑狼瘡性腎炎 SLE是一種以大量自身抗體形成為主要特征的自身免疫性疾病。研究顯示，NETs形成過多及清除障礙可能參與SLE的發病機制，SLE患者體內的NETs水平與SLE活動度評分呈正相關[30-31]。SLE患者有獨特的中性粒細胞亞群，稱為低密度粒細胞，易于促炎性細胞因子釋放和自發性NET形成。這些細胞刺激漿細胞樣樹突狀細胞產生α干擾素。α干擾素對內皮細胞具有細胞毒性，可以破壞內皮細胞的分化和血管生成。因此，在SLE發作期間，α干擾素介導的對成熟內皮細胞及其前體的作用對腎臟脈管系統有害。中性粒細胞和漿細胞樣樹突狀細胞的協同活性會通過 α干擾素放大免疫失調、炎癥和組織損傷，這是SLE的重要發病機制[32]。

在NETs形成過程中，組蛋白、DNA和顆粒蛋白等自身物質大量釋放，可以誘導機體產生抗NET抗體而加重患者病情。SLE患者體內的循環微粒可增強NET形成，這些微粒通常由凋亡細胞等形成。有研究表明，狼瘡腎炎的活動性與循環游離DNA水平異常升高有關[33]。人體補體系統可識別和攻擊SLE患者皮膚、關節、小血管、腎小球等部位沉積的免疫復合物，從而導致不同部位發生急慢性炎癥反應。SLE患者血清中的NETs清除下降與腎炎活動(如蛋白尿、白蛋白水平和肌酐清除率降低)相關[32]。此外，SLE中性粒細胞產生過量的NETs與缺氧、應激反應蛋白DNA損傷誘導轉錄物4的上調以及自噬有關[34]。活躍的SLE中性粒細胞釋放的NETs富含組織因子和白細胞介素-17A，它們可以促進包括腎臟在內的靶器官中的血栓形成、炎癥、組織損傷和纖維化。

3.5NETs與血栓性微血管病(thrombotic microangiopathy，TMA)導致的AKI TMA是一組由自身免疫性疾病、藥物、感染、妊娠等引起的以微血管血栓形成、溶血性貧血、血小板減少以及多器官受累的急性臨床病理綜合征[35]。一項包含90例患者的回顧性研究表明，共11例患者發展為移植相關TMA，血清NETs水平可以預測移植后發生TMA的趨勢；相對于基線，移植后4周或移植當天血清NETs水平升高與移植相關TMA風險增加有關；相反，血栓調節蛋白不利于預測移植相關TMA的發生；在這項研究中，2例移植相關TMA患者的腎小球中檢測到NETs沉積[36]。體外產生的NETs被健康供體的血漿有效降解。但是，NETs在接觸TMA患者血漿后仍保持穩定。無法降解NETs與TMA血漿中脫氧核糖核酸酶活性降低有關。有效的NETs降解需要血漿脫氧核糖核酸酶1，TMA血漿顯示該酶水平降低。用重組人脫氧核糖核酸酶1補充TMA血漿可恢復NET降解活性[37]。

4 小 結

NET形成不僅僅是一種簡單的宿主免疫防御機制，同時也驅動了與無菌炎癥和自身免疫有關的病理生理狀況，導致各種AKI和慢性腎損傷，NET形成在腎臟損傷的發病機制和疾病進展中起著重要作用。針對NETs相關的組織損傷機制來制訂治療策略可能有助于改善腎臟疾病的嚴重程度。由于NETs的組分及其釋放機制與每種疾病的獨特發病機制有關，且同時應保持中性粒細胞介導的針對感染的免疫保護作用，因此，應針對每種疾病類型制訂個性化干預措施。