阿爾茨海默病轉基因動物模型研究進展

王艷云，羅紅波，葉群英

(遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院神經內科，廣東 珠海519000)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)是一種以認知功能障礙及記憶力減退為主要臨床表現的神經退行性變性疾病，主要的病理改變為β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積、Tau蛋白高度磷酸化，以及它們所形成的老年斑、神經原纖維纏結(neurofibrillary tangles,NFTs)。隨著社會的進步與發展，AD的發病人數逐年上升，然而，目前AD的發病機制尚未完全闡明，當前被美國食品藥品管理局批準上市的藥物僅能輕度減輕癥狀或延緩病情的發展，尚無有效的預防或治療措施。王英全等[1]報道，預測2050年AD的患病人數約為3 003萬，在未來30年，中國AD的患病人數將大幅度上升。賈亞泉等[2]報道，研究者們為了進一步探究AD的發病機制及治療藥物，根據AD的發病機制假說建立了不同的動物模型，主要歸為衰老模型、轉基因模型、化學及物理損傷模型，其中利用轉基因技術構建的轉基因模型能夠模擬AD的病理特征及行為表現，且具有時間和空間上的可控性，是較為理想的AD動物模型，并且轉基因AD模型也是當前被研究者們廣泛利用的模型?，F將近年來被廣泛使用的轉基因AD動物模型的不同類型、特性及優缺點進行簡要總結，使得研究者們能夠根據其實驗目的及自身情況選擇適合的模型，以早日闡明AD的發病機制，研制出AD的特效治療藥物。

1 單轉基因模型

尹芳等[3]報道，當前已有4個基因被廣泛證明與AD的發病相關，分別是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)基因、早老蛋白(presenilin,PS)基因、載脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因、Tau基因，據此研究者將其作為靶點，建立不同的轉基因動物模型，以探究它們與AD的聯系并利用其尋找AD的治療藥物。

1.1APP轉基因模型 位于第21號染色體上的APP基因與早發型AD相關，其有290 000個堿基，18個外顯子。高雅等[4]報道，APP經α、β和γ分泌酶剪切后形成Aβ多肽,能夠生成大小不同的肽鏈,其中Aβ40占大部分，少數為Aβ42和Aβ43。與正常APP基因相比，其突變可裂解出更多的Aβ42片段，進一步導致Aβ沉積，甚至形成老年斑。由此推測，APP轉基因AD模型具有Aβ增加及Aβ沉積的特點。

1.1.1PD APP轉基因模型 Del Percio等[5]為比較兩種不同的轉基因AD小鼠建立了PD APP轉基因模型(hAPP717v→F突變，人APP基因印第安突變:纈氨酸在殘基717被苯丙氨酸取代)。Beauquis等[6]利用該模型證明了年輕的PD APP小鼠海馬在出現淀粉樣蛋白沉積之前的重要結構和形態，發現小鼠的海馬結構、形態和突觸、神經元發生改變，其海馬體積減小，錐體神經元和顆粒神經元數量減少，報道了該模型小鼠5月齡時，能夠檢測到極低水平的腦Aβ和最小的海馬Aβ沉積，以Aβ40和Aβ42為主，但是沒有老年斑形成，同時在Aβ沉積前存在認知障礙和焦慮指數增加，在行為測試中，小鼠表現出新空間位置識別障礙，考慮與突觸傳遞缺陷密切相關，此外，在實驗中研究者發現星形膠質細胞減少，與一些研究者的觀點相反，考慮由于應用不同方法引起。Gregosa等[7]證明了該模型鼠的大腦皮質和海馬區可見淀粉樣變性顯著增加，且隨著年齡和基因劑量的增加而增加，海馬體的Aβ濃度在4～8月齡時增加了17倍，到18月齡時增加了500倍，較同月齡小鼠腦中顯著增加，且沉積的Aβ絕大多數為Aβ42，10～14月齡的小鼠可觀察到斑塊中磷酸化的神經絲。因此，PD APP轉基因AD模型是一個具有年齡依賴性Aβ42沉積的AD模型，小鼠不僅腦組織內有Aβ沉積，沉積部位以海馬和皮質為主,支持APP/Aβ在AD發生中的主要作用，而且存在行為學異常表現,由于在目前研究中沒有發現NFTs或成對螺旋絲形成，可將該模型作為研究Aβ相關的AD發病機制及以其作為治療靶點的藥物研究模型，或作為AD治療藥物測試的一個臨床前模型。

1.1.2Tg2576轉基因模型 通過構建小鼠過表達人APP的695個氨基酸同種型的突變形式(APPK670/671L)以獲取Tg2576轉基因AD小鼠，Zhang等[8]和Lee等[9]均證明了該模型小鼠3月齡時在空間參照和替代任務中具有正常的學習和記憶力，但是6月齡開始出現記憶喪失、認知功能減退，7～9月齡可見反應性星形細胞增多和小膠質細胞增多，9～10月齡表現出行為缺陷，Zhang等[10]在10～12月齡小鼠中觀察到老年斑的形成，同樣的，其Aβ沉積以Aβ42為主。Nyul-Toth等[11]最新報道了該模型小鼠存在步態功能障礙的早期表現。但是，目前尚無研究表明該模型存在Tau蛋白過度磷酸化以及NFTs形成和廣泛神經元突觸缺失的發生。

綜上所述，Tg2576轉基因模型可作為研究AD的Aβ病理學相關常用動物模型之一，用于治療干預措施的測試。在認知功能方面，Tg2576轉基因模型較PD APP轉基因模型有著更明顯的年齡分段，在進行行為學檢測時不失為一個可選擇模型。此外，目前從步態異常的角度進行人類AD研究的報道較少見，研究者可利用該模型進行行為測試或步態性能的縱向監測，以評估疾病的進展和治療效果。

1.1.3APP23轉基因模型 Sturchler-Pierrat等[12]利用人APP在670/671位點的瑞典雙突變和V717I突變的2倍過度表達構建了APP23轉基因模型，其是一個Aβ沉積隨著年齡的增長而急劇增加的模型，在小鼠18月齡時可見新皮質和海馬存在Aβ沉積及老年斑形成。此后，Inoue等[13]發現該模型鼠可見突觸變性、過度磷酸化的Tau蛋白、大量丟失的神經元、腦淀粉樣血管病變等病理表現，其早期內涵體改變先于淀粉樣變性出現，且隨著年齡的增長，空間記憶能力和認知功能下降，伴隨晝夜節律和活動紊亂。Zhong等[14]在研究中發現APP23AD轉基因小鼠模型呈現出多個神經元亞型特異性轉錄變化，這可能是未來AD研究的新方向。綜上所述，APP23轉基因AD模型能夠模擬AD的重要病理特征，是分析APP/Aβ在AD發病機制中的理想模型之一，但該模型未觀察到NFTs的形成。

1.2PS轉基因模型 第14號染色體上的PS1以及第1號染色體的PS2基因在早發型家族性AD的發病中發揮著重要作用，在PS轉基因AD模型中，能夠觀察到Tau蛋白過度磷酸化和積累，與年齡相關的神經元和突觸缺失、星形膠質細胞增多癥、血管病理、對興奮性毒性損傷的易感性增加，2～4月齡的模型鼠可見Aβ42顯著增加，但該模型鼠未見老年斑形成。研究者推測，PS作為一種多跨膜蛋白，能夠充當部分γ-分泌酶膜內蛋白酶復合物，以水解APP，進一步產生Aβ42。因此，PS轉基因AD模型即使能夠觀察到Aβ42顯著增加、Tau蛋白過度磷酸化和積累，卻沒有Aβ沉積和老年斑、NFTs的形成。該模型更加適用于探究PS與APP/Aβ之間的潛在聯系，以及從PS的角度出發，更深入地進行AD的治療藥物和發病機制研究。

1.3ApoE轉基因模型 除了早發型AD，還存在一些晚發型AD，其與第19號染色體上的ApoE相關，也是AD的重要危險因素之一。Nuriel等[15]通過對ApoE轉基因AD模型進一步研究，發現該模型鼠可觀察到類AD的Aβ沉積和神經營養不良，神經元過度活躍。Liu等[16]發現其有神經突觸缺失，星形細胞的ApoE4的表達增加。Zhang等[17]進一步發現有嗅覺缺失的情況。綜上所述，ApoE轉基因AD模型可以表現出與Aβ相關的典型表現，未見高度磷酸化的Tau蛋白和NFTs，可利用該模型探究ApoE與AD的相關性以及ApoE與APP/Aβ的聯系，以探究AD的發病機制，或考慮從該方向入手進行藥物研究。

1.4Tau轉基因模型 定位于第17號染色體長臂(17q21)的Tau基因,含有16個外顯子。馬登磊等[18]報道，正常情況下，Tau蛋白是一種神經元磷蛋白，參與細胞信號轉導及囊泡運輸，由352～441個氨基酸組成，有促進裝配軸突微管、穩定軸突微管的重要作用。當Tau蛋白與微管的結合能力降低甚至是完全不結合時，Tau蛋白將會過度磷酸化，進一步聚集形成雙螺旋狀細絲，發展成NFTs。因此，分布于神經元軸突中的Tau蛋白是組成NFTs的主要成分,由此推測Tau基因突變可能是導致AD的關鍵因素。Yoshiyama等[19]發現小鼠在沒有任何運動功能障礙的情況下顯示出Tau蛋白的病理改變：NFTs包裹體上的Tau蛋白高度磷酸化，以及類似雙螺旋狀的細絲和輕度的星形膠質改變，其海馬神經元丟失和突觸功能受損以及小膠質細胞活化發生在NFTs形成之前。此外，Ciupek等[20]和Gelman等[21]先后發現該模型鼠在3月齡出現學習延遲，6月齡觀察到絲狀Tau蛋白損傷，7～9月齡可見NFTs形成以及空間記憶能力障礙。Kreilaus等[22]發現小鼠有聽覺驚嚇反應的缺陷和感覺運動受損。Holton等[23]發現其有晝夜節律的改變。因此，Tau轉基因AD模型的典型病理改變是Tau蛋白過度磷酸化和NFTs的形成以及行為學改變，無Aβ沉積和老年斑形成。其是探究與Tau蛋白相關的病理學研究中常用的動物模型之一，也是以Tau蛋白的病理改變為治療靶點進行藥物研究的可選擇模型之一。

2 雙轉基因模型

2.1APP/PS雙轉基因模型 通過構建APP/PS1雙轉基因模型，Willuweit等[24]發現其可見以Aβ42為主要形式的Aβ沉積在小鼠大腦皮質和海馬，且Aβ沉積遠早于它們單一的轉基因模型鼠，約10周大的雙轉基因模型鼠可見Aβ沉積在扣帶皮質，3月齡可見明顯增加的Aβ沉積在額葉皮質，6月齡可見大量Aβ沉積于海馬體和皮質以及大腦其他區域，并伴隨著老年斑形成，29月齡的小鼠Aβ沉積物數量仍在增加，此外，活化的小膠質細胞和星形膠質細胞與Aβ沉積同步增加，Faure等[25]發現海馬區細胞層萎縮和神經元大量丟失；Willuweit等[24]在實驗中可見神經膠質炎癥和神經營養不良以及腦淀粉樣血管病變。石輝等[26]利用攜帶與家族性AD相關的第9個外顯子缺失突變的PS1dE9基因來構建APPswe(APP瑞典突變)/PS1dE9雙轉基因，該模型鼠于6月齡時可見腦內病理改變，但是小鼠的認知功能表現與其他基因型小鼠無明顯區別，直至9月齡時出現認知行為顯著異常，18月齡的模型鼠在所有認知任務中的表現均不如其他基因型小鼠，因此該轉基因模型鼠腦內病理改變早于行為異常。宗園媛等[27]發現該模型小鼠3月齡時出現記憶缺陷，此時，老年斑并未完全形成，16月齡時開始出現視覺空間學習能力受損。Pugh等[28]發現該模型鼠還表現出類AD的神經精神癥狀，如異常運動行為、抑郁、焦慮、體重減輕、易怒和激越。張玲等[29]進一步觀察該模型鼠的超微結構，發現3月齡小鼠腦組織已有線粒體和突觸的損傷，6月齡小鼠出現各種細胞器損傷、微管解聚、血腦屏障損傷與細胞凋亡和自噬等明顯增齡性變化趨勢的超微病理改變，12月齡小鼠超微結構損傷最為嚴重：細胞凋亡顯著增多,微管溶解,細胞器嚴重變性甚至出現胞質空化。Fontana等[30]建立了APP/PS2雙轉基因小鼠模型，在小鼠的大腦區域觀察到嚴重的腦淀粉樣變性，5月齡小鼠可見Aβ沉積及老年斑形成。秦熙和盧艷[31]則發現6月齡AD模型鼠表現出認知功能障礙,且隨著病程的延長病情逐漸加重。胡沿每等[32]通過比較APP/PS1雙轉基因及APP單轉基因小鼠，發現PS1基因的引入導致AD模型鼠的自發活動減少、速度減慢、焦慮和抑郁樣行為以及認知學習和記憶功能障礙增加。綜上所述，APP/PS雙轉基因模型綜合了多種與AD發病相關的因素，能夠同時模擬多種類AD的病理表現，是目前研究AD發病機制較為理想的模型，也是目前研究者廣泛認可及使用較多的AD動物模型之一，研究者可根據其實驗目的選擇相應月齡的模型鼠。但是在該模型小鼠大腦中未見到明顯的Tau蛋白磷酸化及NFTs形成，故該模型可能更多地作為淀粉樣變性AD藥物研究的主要模型，此外，在利用該模型進行研究時，需要考慮到該模型的外源性基因表達缺乏穩定性、造模較困難、造價相對較高?？傊?，該模型可為研究AD的發病機制提供新的視野,也可用于早期發現和診斷AD、監測AD疾病的進展提供幫助。

2.2APP/ApoE雙轉基因模型 楊勇等[33]報道，AD患者血清ApoE4明顯升高，進一步研究發現，ApoE4與Aβ結合后將改變其溶解度，使得Aβ沉積增加，促進了Tau蛋白的磷酸化,最終引起NFTs形成。Zerbinatti等[34]建立APP/ApoE4雙轉基因AD模型發現，缺乏ApoE的PD APP小鼠的細胞內Aβ42沉積減少。Boggs等[35]發現小鼠在6月齡和12月齡表現出休息-活動周期的改變：活動延遲，黑暗早期運動較少、后期運動較多。因此，ApoE4在Aβ沉積、老年斑形成中起著重要的作用，APP/ApoE雙轉基因AD模型鼠能夠表現出許多類AD的病理及行為學表現，但是該模型并沒有觀察到Tau蛋白磷酸化及NFTs形成，因此可利用該模型進一步探索ApoE對Aβ的影響，并進一步尋找ApoE對Aβ42升高的相關危險因素的預防及治療方法，以此對AD進行藥物干預研究。

2.3APP/Tau雙轉基因模型 Lewis等[36]將Tau轉基因小鼠與Tg2576轉基因小鼠雜交，成功構建出能夠觀察到Aβ沉積及NFTs形成的APP/Tau雙轉基因模型，不僅能在該模型鼠的邊緣系統和嗅皮質觀察到Aβ沉積，還可見神經纖維變性和大量神經元丟失。因此，APP/Tau雙轉基因AD模型能夠模擬出Aβ沉積及NFTs形成，以及神經纖維變性和大量神經元丟失等類AD病理改變，即其綜合了這兩種基因突變小鼠的優點，相對地模擬出AD的兩大典型神經病理改變，因此，研究者認為在AD的發病過程中，Aβ蛋白和Tau蛋白可相互促進，但其發揮作用的機制目前還未闡明。該模型可作為進一步探索AD兩大主流發病假說——淀粉樣級聯反應和Tau蛋白磷酸化以及它們之間關系的一種模型，其也是一種較好的研究AD的模型。

3 多轉基因模型

3.1APP/PS1/Tau轉基因模型(3xTg-AD) AD典型的病理學特征是Aβ沉積形成的老年斑和Tau過度磷酸化形成的NFTs，為了更好地模擬出這種神經病理學表現，陳琛等[37]建立一種三重AD轉基因模型——3xTg-AD，該轉基因模型包含單純的APP基因、PS1基因、Tau基因，綜合單個基因突變的特點，加速了老年斑和NFTs出現的時間及程度，表現出與人類AD腦中的發育相似的時態和區域特異性特征，Aβ沉積物首先出現在皮質，并隨著年齡的增長而發展到海馬體，反之，Tau蛋白病理首先出現在海馬體中，然后發展到皮質。隨著病情的進展，3xTg-AD模型鼠的記憶和學習能力逐漸降低,炎癥反應明顯升高,自噬水平呈先升后降的趨勢。而在早期AD病理發生前，Sterniczuk等[38]發現該模型鼠發生晝夜節律改變，Adebakin等[39]發現其甚至有較其他模型鼠更高的恐懼和焦慮水平以及食欲增加和過剩的現象。此外，Yang等[40]發現相較于雄性模型鼠，雌性表現出更顯著的老年斑、NFTs、神經炎癥和空間認知障礙，Kapadia等[41]發現雄性小鼠12月齡時不再表現出斑塊和纏結。因此，3xTg-AD是一個能夠同時表現老年斑、NFTs病理改變、學習記憶障礙、行為異常、神經精神癥狀的類人AD模型，其可作為臨床前干預試驗的一個有效工具，特別是用于評估AD的兩個特征性病變所介導的神經退行性改變。然而，Fertan等[42]認為該模型雖可同時模擬老年斑和NFTs病理學改變，但其神經病理學和認知行為測試結果在各個研究中并不一致，推測可能是由于年齡和性別差異或用于測量認知功能測試難度的差異導致，因此，在對該模型的認知缺陷作評估，或利用該模型進一步研究AD的發病機制、AD的生物標志物和相關靶標分子、AD的藥物干預時，均需要考慮到這些差異因素。

3.25xFAD轉基因模型及5xFADxTg30轉基因模型 Gu等[43]發現，帶有5個家族性基因突變的APP/PS1轉基因模鼠(transgenic mice with five familial AD,5xFAD)，其1月齡時表現出空間記憶功能的不足，2月齡時表現出空間學習能力不足。Girard等[44]發現4月齡時表現出早期認知障礙和海馬依賴性學習記憶損傷。此外，Tang等[45]在進一步的研究中發現該模型小鼠海馬的微結構完整性在早期就已經受損，隨著疾病發展過程，損害變得更加廣泛和嚴重，最終小鼠表現出空間認知行為障礙。不僅如此，5XFAD模型鼠早期存在認知相關腦區(海馬和內嗅皮質)的神經元活性增加,并隨疾病進展明顯加重。Héraud等[46]進一步建立5xFADxTg30小鼠，其表現出更嚴重的運動缺陷，以及明顯的海馬神經元損失，隨著小鼠年齡的增長，大腦中的NFTs顯著增多。與此同時，Tau蛋白磷酸化水平增高，總體上更接近AD的Tau蛋白向雙螺旋細絲改變的特點。因此，5轉基因小鼠模型能夠更真實、更細致地模擬出AD病理表現，其可作為探究AD相關病理機制及治療的有效工具之一，但該模型造價昂貴，建模成功需要技術及能力支持，有一定的失敗率及成功率，目前暫不將其納入主要選擇的模型對象。

4 小 結

AD是一種多基因遺傳疾病，以上所述的AD轉基因動物模型則是依據AD的神經病理學特征所建立的，建模后的小鼠可見類AD的病理學改變：Aβ沉積、老年斑形成、Tau蛋白磷酸化、NFTs形成、神經元丟失、神經膠質細胞增殖、認知功能障礙、精神行為異常等。就目前主要的AD轉基因小鼠模型來看，相比較而言，采用雙基因或多基因動物模型較單基因模型模擬得更全面，也更接近人類AD的病理改變及臨床表現，但仍不能與自然形成的AD病理改變及臨床表現一致。通過比較可以發現各個建模方法均有其相應的適用范圍及利弊，每位研究者可在進行實驗研究時需要根據自己的實驗目的，結合自身情況科學地選擇相應的建模方法。