骨關節炎軟骨代謝相關生物標志物的研究進展

陳宗銳，孫潔，姜萍

(山東中醫藥大學，濟南 250014)

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是最常見的慢性退行性疾病之一，以關節軟骨進行性降解、軟骨下骨增厚和骨贅形成為特征，并最終導致關節活動度和關節功能喪失[1]。全世界約有2.5億人患有膝骨關節炎(knee osteoarthritis，KOA)，其發病率在50歲以上人群中隨年齡增長而顯著增加，且女性發病率高于男性[2]。在全球范圍內，OA已成為重要的致殘原因，居全球致殘原因的第11位[2-3]。OA的危險因素大致可分為個人因素(年齡、性別、肥胖、遺傳等)和關節因素(關節損傷和關節負荷異常等)，其發病機制目前尚未明確，但可以確定的是關節軟骨代謝在OA發病、進展過程中起重要作用。軟骨是一種無血管、神經及淋巴組織分布的結締組織，由軟骨細胞(articular cartilage，AC)和細胞外基質(extracellular matrix，ECM)構成，軟骨代謝主要涉及AC產生纖維(由膠原蛋白和彈性蛋白組成)、蛋白聚糖(主要為聚集蛋白聚糖)和非膠原糖蛋白以構成ECM以及AC合成的蛋白酶、生長因子參與維持ECM的穩態兩大過程[4]。隨著分子生物學的發展，探尋并研究更為敏感且特異的OA生物標志物逐漸受到國內外學者的關注，而在患者體液(血液、尿液和關節液等)中含有許多軟骨代謝產物，這為發現并研究新的OA生物標志物奠定了基礎，也為OA早期確診、診后分期及病情預后的研究提供了理論依據。現就OA軟骨代謝相關生物標志物予以綜述，以期為OA軟骨代謝的機制研究與探索新的生物標志物提供參考。

1 ECM代謝相關生物標志物

ECM是關節軟骨的重要組成成分，其分解代謝增加是OA發生和發展的關鍵因素。Ⅱ型膠原是軟骨中最豐富的蛋白，Ⅱ型膠原C端肽(C-telopeptide of type Ⅱ collagen，CTX-Ⅱ)、Ⅱ型膠原C端裂解新表位(collagen type-Ⅱ C-terminal cleavage neoepitope，C2C)、Ⅱ型膠原螺旋肽(type Ⅱ collagen helical peptide，HELIX-Ⅱ)、肽Coll2-1(peptide Coll2-1，Coll2-1)等均能反映其降解水平，其他ECM衍生的標志物[如軟骨寡聚基質蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfate，CS)-846]則分別反映了非膠原糖蛋白和蛋白聚糖的降解水平，這些標志物參與了ECM的代謝，性質穩定且易于檢出，是有助于識別OA及監測疾病進展的潛在工具。

1.1CTX-Ⅱ 膠原纖維主要由Ⅱ型膠原(占90%以上)構成，而CTX-Ⅱ是Ⅱ型膠原1/4長片段的降解產物。既往研究表明，尿液中CTX-Ⅱ水平可能反映了OA 患者Ⅱ型膠原降解的程度[5]。Liu等[6]對34例KOA患者尿液中的CTX-Ⅱ進行分析發現，臨床KOA患者K-L分級(Kellgren- Lawrence分級)與尿液的CTX-Ⅱ濃度呈正相關，而在KOA進展過程中CTX-Ⅱ的水平顯著升高。一項針對KOA患者和健康對照者尿液CTX-Ⅱ研究的薈萃分析顯示，KOA患者尿液CTX-Ⅱ水平顯著升高，尤以重度KOA和女性KOA患者為著[7]。這些均表明，尿液CTX-Ⅱ水平對KOA具有一定的診斷意義，且其或許能夠反映KOA的疾病嚴重程度。另一項薈萃分析顯示，尿液 CTX-Ⅱ只在K-L分級達到3級及以上時具有顯著的統計學意義，表明尿液CTX-Ⅱ在KOA的早期階段表達不明顯，其在尿液中的出現及水平升高可能是癥狀加重的標志[8]。Bai和Li[9]對成年兔OA病理過程的不同階段進行研究發現，各時間點OA組的Mankin評分及血清CTX-Ⅱ水平均顯著升高，表明血清CTX-Ⅱ水平隨著時間延長及OA病情進展而升高，故檢測血清CTX-Ⅱ水平對早期診斷OA和評價疾病的嚴重程度均有意義。但另有研究認為，與血清CTX-Ⅱ水平相比，尿液CTX-Ⅱ水平對OA的診斷和評估敏感性更高[10]。又因為尿液檢測屬于無創檢測，且CTX-Ⅱ具有良好的穩定性，故以尿液CTX-Ⅱ水平進行OA的診斷和病情評估更加簡便有效，但對于癥狀不明顯的早期KOA患者仍需檢測其血清水平及聯合其他檢查以明確診斷。

1.2C2C C2C是Ⅱ型膠原C端3/4長片段的裂解產物，以小肽形式存在于血液、尿液及關節液中，可反映關節軟骨的降解水平。Conrozier等[11]對髖關節OA患者進行研究發現，C2C和關節間隙狹窄有顯著關系，在評估累及單個關節的軟骨降解患者中具有價值。He等[12]的研究顯示，KOA患者尿液中的C2C水平明顯增高，且C2C水平隨著KOA病情逐漸進展而增加。陸軍帥等[13]的研究結果顯示，尿液C2C水平與KOA患者膝關節K-L分級呈正相關。C2C與OA患者影像學進展關系密切，且尤以尿液樣本更為敏感，故檢測尿液C2C對于評價OA患者影像學改變嚴重程度具有重要意義，可能成為評價OA患者病情進展程度的一種標志物。

1.3HELIX-Ⅱ HELIX-Ⅱ是軟骨膠原通過組織蛋白酶降解產生的Ⅱ型膠原裂解片段，可用于反映軟骨降解情況和OA的病情。Kala?等[14]對Ⅱ型膠原裂解物與KOA的相關性進行研究，結果表明HELIX-Ⅱ在2年內的縱向變化與關節間隙狹窄呈顯著正相關。Wei等[15]通過研究83例接受膝關節鏡或膝關節置換術患者的軟骨損傷程度，發現關節液HELIX-Ⅱ水平與軟骨損傷累積評分和最大評分呈顯著正相關，且HELIX-Ⅱ水平升高與早期軟骨病變相關。這表明，HELIX-Ⅱ在關節軟骨降解過程中具有重要意義，或許是OA軟骨損傷過程的重要環節，其水平在一定程度上反映了病情的嚴重程度，對于早期軟骨破壞和早期OA的判斷具有重要價值。Garnero等[16]研究顯示，尿液HELIX-Ⅱ水平升高與快速破壞性髖關節OA相關，HELIX-Ⅱ單獨或與CTX-Ⅱ聯合檢測可用于髖關節OA患者的臨床研究。這一研究表明，HELIX-Ⅱ水平在髖關節OA的診斷中具有一定價值，可成為判斷髖關節OA嚴重程度的有效標志物，也為兩種或多種標志物聯合檢測以判斷OA病情的進展提供了參考。

1.4Coll2-1 Coll2-1及其硝化形式(Coll2-1NO2)來源于Ⅱ型膠原的三螺旋結構，被認為是OA軟骨降解的潛在標志物[17]。Henrotin等[18]通過前瞻性研究發現，Coll2-1、Coll2-1NO2及Coll2-1NO2/Coll2-1比值與反映Ⅱ型膠原損傷的標志物Ⅱ型前膠原 C端前肽存在顯著相關性，表明其可能參與關節軟骨的降解。另有研究顯示，Coll2-1和Coll2-1NO2具有雙重意義，不僅能反映軟骨降解，還反映了OA的重要特征炎癥和氧化應激[19]。Deberg等[20]研究表明，Coll2-1是一種OA病情的特異性標志物，對單個關節發生的結構變化較為敏感。Rasha等[21]的研究同樣驗證了Coll2-1水平在單側膝關節OA患者中的相關性，并發現其水平在K-L分級≥3級的中晚期KOA患者中較K-L分級<3級的早期KOA患者顯著升高。Hick等[22]對121例KOA患者Coll2-1及Coll2-1NO2水平與磁共振成像之間的關系進行研究發現，血清Coll2-1及Coll2-1NO2水平與滑膜炎、骨磨損及關節下囊腫等均呈顯著正相關，且疼痛惡化者的基線Coll2-1NO2水平高于未進展者。這表明，Coll2-1及Coll2-1NO2與影像學OA的嚴重程度存在一致性，對于OA病情嚴重程度及預后的判斷均具有價值。Coll2-1與Coll2-1NO2是反映OA軟骨分解代謝的特異性標志物，且可能參與炎癥的產生，其有望成為KOA診斷的一種新型生物標志物，但仍需進一步研究。

1.5CS-846 蛋白聚糖是由核心蛋白與1個以上的糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)通過共價鍵形式構成的一種復合糖，GAG約占蛋白聚糖分子量的90%，其由6個亞單位組成，包括CS-4和CS-6、硫酸角質素、透明質酸、硫酸皮膚素和硫酸肝烷。CS-846屬于GAG亞族，能夠促進軟骨的再生與修復。Ma等[23]對大鼠的研究表明，術后10周模型組大鼠的血清CS-846水平較對照組顯著升高，且CS-846 水平與國際骨關節炎研究學會評分呈正相關。表明CS-846作為一種保護性因素，其血清濃度可反映軟骨生成代謝的水平，能一定程度體現OA軟骨損傷后的再生和修復能力，間接反映了OA關節損傷的嚴重程度，故可作為診斷和監測OA進展的生物標志物。張軍鋒等[24]對50例KOA患者進行研究，結果表明血清CS-846水平與疼痛視覺模擬評分法評分及關節間隙狹窄程度呈正相關。Dou等[25]對100例接受膝關節置換術的KOA患者進行研究發現，與健康對照組者相比，KOA患者血清CS-846水平升高，且其水平與視覺模擬評分法評分和關節間隙狹窄也呈正相關；此外他們進行受試者工作特征曲線分析發現，miR-33-3p、COMP和CS-846的聯合檢測對KOA患者具有較高的診斷價值。這些均表明，CS-846在KOA的早期診斷中具有較高的價值，同時若與其他生物標志物聯合應用可作為診斷KOA和評估病情嚴重程度的新的生物標志物。

1.6COMP COMP是一種大的五聚體糖蛋白，為軟骨非膠原糖蛋白的主要組成成分，屬于血小板反應蛋白家族，在軟骨內高表達，有較強的組織特異性。一項研究證明，K-L分級0級或1級的早期OA患者血清COMP水平顯著高于非OA患者，且血清COMP是發現早期OA的獨立因素，并進一步提出其最佳臨界值為152 ng/ml[26]。這一研究為早期OA的診斷提供了有效而具體的證據，表明COMP是診斷OA尤其是早期OA的重要標志物。Akinmade等[27]通過研究COMP水平與臨床分級(Lequesne指數)和放射學分級(K-L分級)的相關性發現，KOA患者的COMP水平顯著高于非疾病患者，且隨KOA嚴重程度的增加而升高，表明COMP不僅可用于OA的診斷，也是評估OA病情嚴重程度的一種標志物。Fernandes等[28]對272例KOA患者的血清COMP水平進行研究發現，有臨床癥狀的KOA患者的血清COMP水平顯著高于健康人群和無癥狀的關節間隙狹窄患者，且有KOA臨床癥狀而無放射學異常(K-L分級0級或1級)的患者血清COMP水平顯著高于健康人群，表明血清COMP水平與OA患者臨床癥狀嚴重程度相關，且對于無明顯放射學異常的臨床癥狀顯著的KOA患者軟骨損傷具有預測價值。Lynch等[29]對髖關節OA患者的生物標志物進行分析，認為COMP是OA的特異性標志物，對OA的診斷和管理具有潛在的實用性。COMP是當前OA生物標志物研究中的熱點，其對OA的診斷、病情程度的評估及病情進展的預測均具有一定價值，較廣泛地用于OA藥物干預或治療后的評估，是OA一種潛在重要的生物標志物。

2 AC合成與分泌相關生物標志物

AC是軟骨中唯一的細胞種類，僅占軟骨組織體積的一小部分，但由于其負責分泌合成ECM的構成成分及軟骨代謝相關蛋白酶、生長因子、炎癥因子等以維持軟骨的完整性，所以AC的破壞及其分泌異常均可能破壞軟骨內穩態并導致OA產生，而AC生成的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、帶有血小板凝血酶敏感蛋白樣模體的解整鏈蛋白金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)與白細胞介素(interleukin，IL)等可誘導炎癥發生和軟骨降解，并反過來導致AC的衰老、破壞，形成惡性循環，進而導致OA的發生和發展。

2.1MMP MMP是一種依賴Ca2+、Zn2+的蛋白酶，主要降解膠原纖維與蛋白聚糖，以維持ECM的穩態。MMP由24個不同的MMP基因和23個不同的MMP蛋白組成，根據其結構域組織、序列相似性及其底物的特異性可分為四類，其中與軟骨損傷相關的有MMP-1、MMP-3、MMP-9和MMP-13等。Bo等[30]在研究發育性髖關節發育不良并發OA大鼠模型中，應用免疫組織化學和實時熒光定量聚合酶鏈反應均檢測到MMP-13的表達增加，表明MMP-13可能是OA早發的一個重要因素。Wilkinson等[31]研究認為，MMP-13與OA的病情進展相關，是OA軟骨破壞發生的關鍵控制點。Ding等[32]研究發現，OA成骨細胞與AC共培養可促進MMP-3、MMP-9、MMP-13蛋白及基因的高表達。Li等[33]對105例KOA患者外周血MMP的研究顯示，早期KOA(Ⅰ級)患者血漿MMP-3、MMP-9水平以及MMP-9信使RNA的轉錄水平均顯著升高，且表達水平與臨床癥狀嚴重程度(Lequesne指數)呈正相關，表明MMP-3、MMP-9水平和MMP-9 信使RNA的轉錄水平在影像學特征不明顯時，可能對早期KOA診斷具有較高的敏感性，且也是判斷KOA臨床癥狀嚴重程度較為客觀的標志物。MMP是近年來OA研究的熱點，其在基因與蛋白水平的表達與OA炎癥產生和軟骨降解均有一定相關性，但特異性不高，可能是預測OA病情進展程度的一種潛在生物標志物，有待更多探索。

2.2ADAMTS ADAMTS家族由19種分泌型鋅金屬蛋白酶組成，并具有幾個不同的模塊，包括前結構域、金屬蛋白酶結構域、解整合素樣結構域和血小板反應蛋白1型基序，均參與ECM的降解過程。Wang等[34]研究顯示，ADAMTS-1、ADAMTS-2、ADAMTS-5基因和蛋白的表達水平在OA的關節軟骨、軟骨下骨和生長板中均有升高，表明其參與了OA的軟骨破壞及骨侵蝕，提示OA病情的進展。Sharma等[35]研究發現，ADAMTS-5介導的軟骨降解中激活了Toll樣受體，從而導致分解代謝酶與炎癥因子的激活，進而導致關節破壞與疼痛，這為更好地理解ADAMTS-5致炎致損的病理機制起了積極作用，也表明ADAMTS-5活性是判斷OA關節損傷和臨床癥狀嚴重程度的有效標志。胡光亮等[36]對100例OA患者相關生物標志物進行研究發現，滑膜中ADAMTS-7蛋白、ADAMTS-7信使RNA的表達水平與OA的病變嚴重度呈正相關，表明ADAMTS-7水平的高低對于判斷OA病情嚴重程度具有重要意義，可作為判斷OA病情程度及預后的一種潛在標志物。

2.3IL IL是與OA發病及病情進展相關的一類炎癥介質，其表達與軟骨的降解損傷和滑膜炎癥密切關聯。Ruan等[37]在一項針對160例KOA患者的橫斷面研究中發現，血清IL-8水平與膝關節癥狀增加、髕下脂肪墊磁共振成像信號強度改變及血清骨和(或)軟骨生物標志物水平呈正相關，表明IL-8可能在KOA中發揮作用。Udomsinprasert等[38]對IL-34在關節炎中的作用進行分析，發現負責軟骨降解的促炎性細胞因子參與調節IL-34表達，而在KOA患者的血清和滑液中IL-34水平顯著升高；同時，他們還發現其水平與影像學嚴重程度呈正相關。Snelling等[39]研究顯示，關節液中測得IL-17的患者骨贅、硬化及最小關節間隙寬度明顯減小，提示關節液中的IL-17可能對具有不同生物學和臨床特征的大量原發性終末期 OA患者亞群的識別具有意義。另有研究證明，IL-1和IL-6作為較為明確的OA生物標志物，可促進ECM的降解和AC的破壞，引起滑膜炎癥反應，進而加重OA的病情程度[40]。以上研究表明，OA的發病及進展均有IL的參與，其中IL-1、IL-6和IL-8參與了OA的軟骨破壞和炎癥過程，其水平的高低反映了OA的炎癥水平，是判斷病情嚴重程度的生物標志物，而IL-17和IL-34多反映晚期OA的關節骨損害，對于判斷病情預后具有較大的價值。

3 結 語

目前，OA的臨床診斷和對病情預后的評估大多依靠X線、磁共振成像或關節鏡檢查，而X線對于早期OA的診斷不敏感，磁共振成像檢查的費用較為昂貴，關節鏡檢查屬于有創性操作，它們對于OA的診斷和預測均有其局限性，故探尋更為敏感、特異、無創或微創而又檢測費用低廉的診斷手段尤為重要。生物標志物可以彌補以上檢查手段的不足，具有獨特優勢，可能成為診斷和評估OA的有效方法。迄今為止，大量生物標志物研究仍未發現可推廣應用于早期臨床診斷、分期及預后的生物標志物，這或許受OA病因、發病機制復雜的影響；此外，目前生物標志物的研究多停留在細胞或分子水平，對于上游信號因子和信號通路亟須探索和完善。軟骨的損傷及修復貫穿OA發病的全過程，故從軟骨代謝的角度探索新的更為敏感及特異的生物標志物，將多種生物標志物聯合應用，將對OA的早期診斷、分期和監測更具意義。