Ras基因及蛋白與甲狀腺癌的關系

付云平，葉暉

(1．貴州醫科大學，貴陽 550001; 2．貴州醫科大學附屬醫院甲狀腺外科，貴陽 550001)

甲狀腺癌為內分泌系統最常見的惡性腫瘤之一，從組織病理方面可分為由上皮細胞來源的乳頭狀甲狀腺癌和濾泡狀甲狀腺癌，以及由濾泡旁C細胞發生的甲狀腺髓樣癌和具有高度侵襲性的甲狀腺未分化癌，且在我國每年將以20%的速度持續增長，2020年居全球女性腫瘤發病率第5位[1-4]，其高發病率與術前分子診斷技術的提高有著密不可分的關系[5]，其中大鼠肉瘤病毒(rat sarcoma virus，Ras)基因是甲狀腺癌中的常見突變基因，僅次于v-Raf小鼠肉瘤病毒癌基因同源體B1(v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1,BRAF)基因[6]，多見于甲狀腺濾泡狀癌，在甲狀腺乳頭狀癌也有發現，且多見于濾泡亞型的甲狀腺乳頭狀癌中[7]。Ras基因的常見位點突變多見于密碼子12、13和61，異常的持續激活使編碼形成RAS蛋白后激活促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)通路[8]。這些通路參與了細胞膜受體酪氨酸激酶信號向細胞核的傳播，并調節多種細胞過程。但Ras基因在甲狀腺癌中的作用機制尚不清楚。Ras基因研究結果可為甲狀腺癌的診斷及風險評估提供參考，為精準醫學及分子研究奠定基礎[9]。現對Ras基因及蛋白與甲狀腺癌的關系予以綜述。

1 Ras基因的發現

Ras突變最先由Harvey[10]在白血病小鼠中發現，將含有常規傳代莫羅尼白血病病毒的小鼠血漿注射到15只新生的BALB/c小鼠體內，第32天發現存活的6只小鼠中有5只在注射部位或注射部位附近長出肉瘤，從而發現了轉化基因Ras。隨后，Kirsten和Mayer[11]、Peters等[12]、Rasheed等[13]分別在1967年、1974年、1978年發現另外3種反轉錄病毒中也有Ras基因突變。Ras基因突變的亞型不同，分別以Harvey和Kirsten兩人名字區分不同亞型的Ras突變，即H-Ras和K-Ras。1983年，Hall等[14]在神經母細胞瘤中發現了另一種從未在反轉錄病毒中發現的Ras突變，命名為N-Ras。至此人們發現了Ras基因突變的3種常見亞型。

1.1Ras基因的結構及功能 Ras基因主要存在于真核生物，其包括3種不同的類型，其中N-Ras位于第1號染色體上(1p22～p32),而H-Ras與K-Ras分別位于第11號染色體(11p15.1～p15.3)上和第12號染色體(12p1.1)上。3種亞型的Ras基因均具有5個外顯子，但其中1個不參與編碼蛋白。K-Ras基因由于第4外顯子變異的不同分為K-RasA和K-RasB[15]，最終編碼后的蛋白表達為一種高度相關的由189個氨基酸殘基組成的分子量為21的G蛋白單體，也稱為p21 Ras蛋白或RAS蛋白,Ras基因將編碼的p21的序列都平均分配在 4個外顯子上[16]。

不同亞型Ras基因在腫瘤中表達大不相同，根據癌癥體細胞突變目錄數據庫報道，K-Ras是所有癌癥中最常見的突變亞型，在結直腸癌中占主導，而在甲狀腺癌中并不同，N-Ras表達高于H-Ras和K-Ras，為甲狀腺癌中最常見的突變亞型，其突變的位點主要發生在密碼子12、13和61。同樣，不同亞型的Ras癌基因的常見突變位點也不相同，K-Ras突變位點主要是密碼子12和13，N-Ras大多突變位于密碼子61，低概率在密碼子12和13[17]。H-Ras在密碼子12的突變率最高，其次是密碼子61和13。另外，學者也發現影響Ras基因其他位點的突變，但頻率很低[18]。因此，這3個密碼子占人類癌癥所有Ras突變的92%～98%。

1.2RAS蛋白的結構及功能 RAS蛋白是一種由Ras原癌基因編碼而成的含有189個氨基酸，位于細胞膜內側與鳥苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)結合的球蛋白，分子量為21,按照蛋白質的一級結構，從N′端開始，可分為1-85(SH1)、86-165(SH2)、166-185(SH3)、186-189(SH4)4個結構域。

其中SH1、SH2結構域氨基酸基本相同，高度保守，稱為G區[19]，主要通過與GTP/鳥苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)結合來調控信號通路，當RAS蛋白與GTP結合時處于激活狀態，而與GDP結合時處于非激活態[20]，兩種狀態之間的轉換依靠Ras-GTP酶活化蛋白和Ras鳥嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)的調節，Ras-GTP酶活化蛋白的作用為水解GTP,將RAS蛋白轉變為與GDP結合的無效狀態，與之相反，RasGEFs的作用是使RAS蛋白處于激活狀態[21]。RAS蛋白作為分子開關，通過與GTP/GDP間的結合轉變充當細胞內信號轉導物，控制著下游信號通路[22]。

而SH3、SH4結構域處于高度可變區域，在SH4結構域的C端(186-189)中含有一個CAAX終端盒子,其中C代表半胱氨酸,A代表脂肪氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、升壓素),X代表任意氨基酸，其通過C端的CAAX終端盒子與類脂結合后將RAS蛋白定位于細胞質膜上，從而引發下游通路的激活，導致腫瘤的發生和發展。

1.3Ras作用通路

1.3.1Ras/Raf/MAPK激酶(MAPK kinase，MEK)/胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路 目前，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路為Ras基因最明確的信號轉導通路，當受到膜外有絲分裂原刺激后，可導致一些整合素的持續上調，使RAS蛋白的SH2區與細胞膜表面的受體型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)作用，進一步通過SH3結構域與GEFs作用結合Ras-GTP，激活Ras[23-24]。活化狀態的RAS蛋白刺激下游的信號因子，發生一系列級聯反應，其中Raf蛋白激酶(ARAF、BRAF和CRF)是主要的RAS蛋白效應器，活化的Raf通過磷酸化MEK上的絲氨酸殘基將其激活,MEK再激活ERK,進而磷酸化與胞質和胞膜相連的底物，磷酸化的ERK被激活后快速地轉運入細胞核內，從而使腫瘤促進因子上調[8，25],如血管內皮生長因子、轉化生長因子-β1、血小板反應蛋白1，誘導細胞從DNA合成前期(G1期)進入DNA合成期(S期)，促進細胞生長和增殖。

1.3.2PI3K-Akt通路 細胞外信號激活細胞膜上的RTK，從而導致RAS激活，隨后使PI3K激活，激活后的PI3K催化4，5-二磷酸肌醇轉變為3，4，5-三磷酸肌醇，3，4，5-三磷酸肌醇使磷酸肌醇依賴蛋白激酶1磷酸化后被激活，從而激活Akt,磷酸化的Akt是Akt的一種活化形式，進入細胞核可誘導腫瘤促進因子水平的上調[26]；在細胞質中，活化的Akt還可激活其他信號分子或通路，其中突出的為哺乳動物雷帕霉素靶蛋白通路[27]，通過促進翻譯在腫瘤發生中起重要意義；另外，活化的Akt還能直接使糖原合成酶激酶-3β磷酸化使其失活。正常情況下，糖原合成酶激酶-3β的作用為抑制β-蛋白，當激活的Akt使糖原合成酶激酶-3β失活后，緩解了其對β-蛋白的負向作用，導致更多的β-蛋白進入核內促進促腫瘤基因的表達。另外，激活的Akt進入核內可使叉頭框蛋白O3(forkhead box O3，FoxO3)磷酸化，磷酸化的FoxO3從核內轉移到胞質中，與14-3-3蛋白結合后存留在胞質中，從而終止FoxO3通路的促凋亡活性[28]。磷酸化的Akt通過以上3種途徑對甲狀腺腫瘤的發生提供了強大的動力。

通過以上途徑，Ras基因的突變誘導了大多數腫瘤的發生，尤其是在結直腸癌、皮膚癌等腫瘤中，在結直腸癌中以K-Ras多見，而在皮膚癌則以N-Ras多見，不管是何種亞型的突變，這些機制的核心都是Ras基因出現了點突變，導致MAPK涉及廣泛的二級分子改變，亦或是使Akt磷酸化激活后發生核位置的改變，而兩者之間協同和放大了致癌活性，從而介導了甲狀腺腫瘤發生。

2 Ras基因與甲狀腺

1988年，Lemoine等[29]首次在甲狀腺腫瘤中發現3種Ras癌基因(N-Ras/K-Ras/H-Ras)的激活突變，從而開始了Ras基因在甲狀腺癌中的科學研究。研究表明，Ras基因突變是甲狀腺癌中僅次于BRAF突變的常見突變[30]，主要發生在30%～45%的濾泡狀甲狀腺癌中，少數乳頭狀甲狀腺癌中也尚有表達，但僅見于濾泡型甲狀腺乳頭狀癌，約10%，而在經典型甲狀腺癌中幾乎不表達[31]。

2.1Ras基因在甲狀腺結節中的診斷作用 甲狀腺癌的臨床治療通常從甲狀腺結節的評估開始，最常見的檢測方式為超聲檢測。隨著科學技術的不斷發展、醫學設備的不斷完善，高分辨率超聲的出現對甲狀腺結節的檢測率得到了大幅度的提高，而超聲引導下細針抽吸活檢技術進一步提高了甲狀腺癌的準確度及特異度，但仍有部分結節不能明確診斷性質，對這類具有中度惡性風險的結節采納何種治療方案，目前仍是個難題。為解決這一難題，多項指南均提出對診斷不明確的甲狀腺結節進行基因檢測，因此分子分型的研究為甲狀腺癌的診斷、治療和預后評估帶來了新的契機[32]。在過去的10年中，人們做出了極大的努力，將Ras突變作為診斷分子標記應用于細針抽吸活檢，特別是針對細胞學不確定的結節，發現Ras突變對甲狀腺癌的靈敏度和特異度較BRAF低，除在濾泡型甲狀腺癌、濾泡型甲狀腺乳頭狀癌及髓樣癌中有突變外，有20%～25%的良性甲狀腺濾泡性腺瘤中也發生Ras突變。Nabhan等[30]通過對多篇文獻進行系統性回顧及Meta分析后發現，不管是對何種類型的Ras突變進行檢測均不能對術前診斷不明確的結節提出有效的臨床管理方法，甚至需要進一步的再次行基因檢測或細針抽吸活檢。而Ras突變作為甲狀腺癌中的第二常見突變，仍是目前基因研究的重點，對Ras突變應用于甲狀腺癌診斷現多是將其與其他分子標記，特別是遺傳標記[BRAF、端粒酶反轉錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、PI3K等]結合使用。Rossi等[33]、Decaussin-Petrucci等[34]表示分子檢測用于不確定的甲狀腺細胞穿刺組織中，可增加診斷敏感性，且對不確定的甲狀腺細針抽吸活檢標本進行輔助分子檢測的應用為患者提供了更好的分層和分類。另一項單中心研究對1 056個不確定細胞學的連續甲狀腺細針抽吸活檢樣本進行前瞻性研究，發現多基因檢測試劑盒對非典型性不確定意義/不確定意義的濾泡性病變和濾泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤的結節診斷靈敏度分別達到了88%、87%。因此，多基因檢測能更準確地對診斷不明確的結節進行評估[35]。目前，細針抽吸活檢是術前對甲狀腺結節性質進行評估的首選檢查，但其仍存在一定的局限性，對于活檢穿刺后意義不明確的非典型病變或濾泡性腫瘤/可疑濾泡性腫瘤的結節，若進一步行BRAF、Ras、TERT等分子檢測，可為臨床醫師提供更多的臨床證據，對指導治療、判斷預后均具有重要價值。而Ras突變是基因診斷的一個重要組成部分，更有助于提高不同類型甲狀腺癌的診斷敏感性，尤其是對具有乳頭樣核特征的非侵襲性甲狀腺濾泡性腫瘤[36]，期待隨著對Ras基因的深入研究，可使含有Ras突變的基因盒劑的診斷效率得到證實和進一步提高。

2.2Ras基因突變對甲狀腺癌的影響 Ras基因是甲狀腺癌中僅次于BRAF基因突變的常見突變，其分子改變主要發生于第12、13、和61密碼子,其中以N-Ras基因61密碼子突變最常見[37]。突變后的Ras基因使編碼產生的RAS蛋白持續處于活化狀態。活化型RAS蛋白能夠同時激活MAPK和PI3K/Akt兩個信號通路，刺激細胞生長、增殖和分化阻礙細胞的凋亡，從而促進腫瘤的發生和發展。

目前認為，Ras基因是濾泡型甲狀腺癌和濾泡型甲狀腺乳頭狀癌發生的早期事件，在腫瘤的發生發展中具有重要作用。Mehrzad等[38]認為，N-Ras基因突變與甲狀腺癌細胞骨轉移及不良生存率有關；Chen等[39]也提出，K-Ras突變是甲狀腺癌生存不良的獨立預測因素，且表示Ras基因分型可能在識別與預后不良相關的甲狀腺亞群方面發揮作用。盡管有研究表示，Ras基因突變可能與更差的預后和腫瘤轉移傾向相關[38]，但Ras基因的預后價值也不十分明確。另有學者認為，Ras基因突變的甲狀腺癌往往并不具備很強的侵襲性[40]。Insilla等[41]通過對145例分化良好的甲狀腺乳頭狀癌患者進行TERT、BRAF、Ras檢測發現，Ras突變在分化型甲狀腺乳頭狀癌患者的侵襲性及淋巴結轉移等相關臨床特征方面差異無統計學意義。Kakarmath等[42]也認為,伴有Ras基因突變的甲狀腺癌超聲特征最常表現為陰性特征,在細胞學上也更多地提示與低風險和“不確定”的特征相關，從而疏忽甲狀腺結節的惡性程度。由此可見，Ras致癌基因的突變雖然增加了腫瘤形成的風險，但具有Ras陽性的這類甲狀腺癌并不屬于高侵襲性腫瘤，可在適當的臨床條件下采取相對保守的治療措施。另有部分學者發現，當Ras基因與BRAF或TERT共突變時，甲狀腺癌具有更高的淋巴結轉移、組織侵犯、復發及惡性風險，使低風險惡性結節轉變為高風險惡性結節[43-44]。Shen等[45]則更進一步指出，BRAF V600E/Ras突變共存和單獨TERT突變的情況下患者預后最差；BRAF V600E和TERT突變患者情況居中；Ras單獨突變和野生型患者預后最好。

綜上所述，目前Ras基因對甲狀腺癌的影響尚無統一定論，需要進行更多的科學研究論證，Ras基因單獨突變時，由于其在不同類型甲狀腺癌臨床結局中的不確定作用，如何恰當地使用它們來協助評估和治療甲狀腺癌尚未明確。但當Ras與BRAF、TERT共突變時，甲狀腺癌周圍組織侵犯、淋巴結轉移及遠處轉移的風險均增大，所以，術前行多基因聯合檢測可為甲狀腺結節的惡性程度評估及治療方案選擇提供幫助。

3 Ras基因突變的分子靶向治療

目前甲狀腺癌的首選治療方式為手術治療，術后行促甲狀腺激素內分泌抑制治療，通過抑制促甲狀腺激素降低對甲狀腺的刺激，從而抑制腫瘤的復發；對于惡性程度高，復發及轉移可能性大的甲狀腺惡性腫瘤，還可術后行131I放射性治療，但對于難治性碘抵抗、低分化及未分化甲狀腺癌，由于攝碘能力較低，故131I放射性治療的效果并不理想，且早期轉移、周圍組織侵犯及術后復發的發生風險更高。因此，基因靶向治療的重要性顯得尤為突出，這也符合目前全球提出的精準醫療的概念。

對于Ras突變型甲狀腺癌而言，Ras基因的產物-RAS蛋白通過對GTP的結合持續活化，進一步誘發MAPK通路和PI3K通路一系列的級聯反應。因此，針對Ras突變的分子治療，主要包括與Ras通路有關的Raf激酶、MEK、ERK的研究以及對RAS蛋白的研究。其中索拉菲尼是一種靶向作用于血管內皮生長因子受體2、3、轉染重排的RTK抑制劑,其通過作用于Raf-MEK-ERK通路后，阻斷腫瘤細胞的增殖和血管生成。美國食品藥品管理局早在2013年已批準索拉菲尼為晚期甲狀腺癌、放射性碘抵抗甲狀腺癌的進展期首選藥物[46]，2017年國家食品藥品監督管理總局也批準了索拉菲尼用于治療難治性分化型甲狀腺癌。一篇有關索拉菲尼對分化型甲狀腺癌、髓樣癌及未分化癌療效的回顧性研究顯示,其對甲狀腺腫瘤的緩解率和穩定率分別為21%和60%[47]。

RTK抑制劑侖伐替尼可以抑制血管內皮生長因子受體的激酶活性，進而抑制細胞增殖和腫瘤生長，從而延緩病情的進展，為腫瘤的晚期挽救治療提供了治療方案。MEK抑制劑SL327與RTK抑制劑舒尼替尼在抑制甲狀腺癌細胞活力、促進腫瘤細胞凋亡、減弱細胞侵襲性等方面具有顯著協同作用[48]。

4 小 結

Ras基因突變是甲狀腺癌發生、發展的重要原癌基因之一。主要通過MAPK通路及PI3K通路誘導腫瘤的發生及發展；也可通過抑制凋亡通路加速細胞周期，促進細胞增殖，尤其是在濾泡型甲狀腺癌中，Ras基因的表達率較高，且當Ras基因與BRAF或TERT基因共突變時，甲狀腺癌轉移復發及侵犯周圍的風險增高，這可幫助一線臨床醫師提供有效的風險評估和合理的治療方案。腫瘤患者的Ras陽性仍是現今腫瘤治療的一大難題，但靶向Raf/MEK/ERK已取得重大進展。針對Ras突變的腫瘤治療能更有效地降低化療藥物的毒性，提高療效，但目前其作用機制及對甲狀腺癌細胞的影響仍然處于探索階段，后期研究仍須進一步闡明腫瘤的發生機制,為腫瘤的早期診斷及分子靶向治療提供可靠依據。