肝纖維化臨床診斷與治療研究進展

郭悅承，陸倫根

1 肝纖維化的定義、流行病學和發生機制

1.1 定義 器官硬化和纖維化不僅是疾病長期進展的結果，也是機體發生衰老的過程，諸如肝、胰腺、腸、肺、腎、心、腦、血管、皮膚和關節等幾乎所有器官均可發生纖維化和硬化。纖維化對機體的影響是一把“雙刃劍”，其雖可以促進組織損傷的修復，但過度的纖維沉積會破壞組織結構并導致血運障礙。在各種因素的作用下，肝內膠原、糖蛋白和蛋白多糖等細胞外基質成分的過度沉積稱為肝纖維化。肝纖維化是可逆的過程，但大多數患者的肝硬化是不可逆的過程。因此，肝纖維化并非等同于肝硬化，不應作為肝硬化的同義詞。

1.2 流行病學 目前，尚不清楚肝硬化的確切患病率，估計為0.15%。在代償期肝硬化患者，無癥狀者占比為30%～40%，常在體格檢查或手術過程中，甚至尸檢時才被發現。有研究表明，1990年～2017年，全球肝硬化病例數增加了 74.5%，其中非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)病例占59.5%，而慢性乙型肝炎(CHB)病例占28.7%[1]。2020年的一項流行病學研究[2]指出，1999年～2017年美國慢性肝病死亡率為12.86/10萬人，肝硬化死亡率為7.96/10萬人。1990年～2016年，我國肝硬化和慢性肝病患病人數從近七百萬人升高至近一千二百萬人，全年齡組患病率升高了44.4%，男性患病率和死亡率均高于女性，年齡標準化患病率下降了5.8%，全年齡組病死率降低了17.6%[3]。

1.3 發生機制 激活的肝星狀細胞(HSC)、骨髓來源的細胞、匯管區成纖維細胞和上皮細胞向間葉細胞轉化(EMT)是肌成纖維細胞的來源。其中，HSC的持續激活是肝纖維化發生發展過程中的關鍵環節。在肝毒性藥物、HBV或HCV感染和氧化應激信號等刺激因子的作用下，肌成纖維細胞被激活，表現為增殖和遷移能力增強，并且對凋亡有相對的抵抗能力[4,5]。在纖維化期間，金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1和TIMP-2增加，基質金屬蛋白酶(MMP)1、8、13減少，膠原合成增加而降解減少，導致了肝纖維化進展，可進展為肝硬化和肝衰竭。

轉化生長因子-β(TGF-β)、血小板衍生生長因子(PDGF)、血管內皮生長因子(VEGF)和結締組織生長因子(CTGF)通過促進HSC增殖和遷移能力誘導細胞外基質的產生，并維持促纖維發生反應，從而加速纖維化進程[4,6]。Hedgehog信號與Notch信號之間串擾也可調節HSC的激活[4,7,8]。此外，HSC的表觀遺傳調控(如miRNA、組蛋白修飾和DNA甲基化)，受體(如Toll樣受體、法尼醇受體、肝X受體、過氧化物酶體增殖物激活受體)介導的HSC調控也參與了纖維化的發生和發展[9-12]。目前，尚不確定遺傳因素在肝纖維化發展進程中的確切作用。有研究報道，含PATATIN樣磷脂酶域蛋白3(PNPLA3)的單核苷酸多態性(SNP)與NAFLD患者的組織學改變有關[4,13]。此外，環境因素，如酒精、咖啡，宿主因素如性別、年齡也可能對肝纖維化進展產生影響。總之，肝纖維化的具體發病機制仍未完全闡明，尤其是關鍵靶點、涉及的細胞和分子還有待進一步研究證實。

2 肝硬化/肝纖維化的診斷和評估

2.1 分期 在病因、病理生理機制、形態特點、預后發展等方面，肝纖維化和肝硬化并不一致。在組織學上，肝纖維化分為I～IV期，其中，IV期肝纖維化為早期肝硬化。在臨床上，肝硬化分為代償期和失代償期。代償期肝硬化患者往往沒有明顯的癥狀。隨著病情進展，發生食管胃靜脈曲張，進而發生腹水、食管靜脈曲張破裂出血、肝性腦病等失代償性并發癥。在肝硬化IV期分期法中，I～II期為代償期，III～IV期為失代償期。I期無食管胃靜脈曲張和腹水，II期存在食管胃靜脈曲張但無腹水，III～IV期發生腹水、食管靜脈曲張破裂出血和肝性腦病等失代償期并發癥。

根據肝靜脈壓力梯度(HVPG)進行分期，可以反映肝硬化發展過程中門靜脈高壓所致的血流動力學異常程度。當HVPG>6 mmHg時，提示往往已經進展至肝硬化；當HVPG>10 mmHg時，存在臨床顯著的門脈高壓，患者發生食管胃靜脈曲張的風險顯著增加；當HVPG>12 mmHg時，提示進展至失代償期肝硬化階段。在生物學上，肝纖維化階段的特征為纖維發生和血管形成，肝硬化階段的特征為瘢痕形成，瘢痕組織增粗增厚，形成肝硬化結節，最終進展至不可逆的瘢痕組織。

2.2 診斷和評估方法 肝穿刺活檢屬于有創性檢查。肝纖維化的非創傷性診斷方法包括病史、癥狀和體征；血液學標志物檢測；超聲、CT、MRI、FibroScan、FibroTouch和磁共振彈性成像(MRE)等瞬時彈性成像檢測以及聲脈沖輻射力(ARFI)和二維剪切波彈性成像(2D-SWE)等影像學檢查方法，或基于上述方法的綜合判斷模型。1)，肝穿病理學檢查。根據肝組織活檢Metavir評分，可以將肝纖維化分為F1～F4期，其中，F4期的特征為彌漫性假小葉形成，可確診肝硬化。Ishak評分系統可應用于評估治療前和治療后配對活檢效果的變化。最近，首都醫科大學賈繼東團隊提出了肝活檢纖維化評估的新分類，即PIR分類[14]，可用于評估肝纖維化或肝硬化的可逆性。該分類根據纖維間隔的形態和寬度，將纖維間隔(Ishak≥3)分為：主要進行性 (P)、不確定性 (I) 和主要退化 (R) 三個亞類。新標準的評估包含了壞死性炎癥評級、纖維化階段分期和 PIR三個部分。病理組織學檢查能直觀地反映肝臟病理學變化及分布特點，目前依然被認為是診斷肝纖維化和肝硬化的“金標準”，但存在一些局限性。約20%～30%患者會發生明顯的疼痛，7%需要藥物止痛治療，0.3%發生臟器出血，0.01%～0.1%發生死亡，患者依從性稍差。并且，活檢所取肝樣本僅僅是全肝的1/50000，存在取樣誤差。在評價肝纖維化時，同一觀察者不同次之間和不同觀察者之間存在10%～20%觀察結果變異，診斷肝硬化存在20%～50%假陰性。非染色成像技術結合數字病理學自動量化系統組織學指數，與病理學評分高度一致，值得進一步研究。2)，門靜脈壓力檢測。HVPG是楔形和游離肝靜脈壓力之差，間接反映了門靜脈壓力。由于門靜脈高壓貫穿于肝硬化發生發展的整個過程，檢測門靜脈壓力也可以對肝纖維化和肝硬化程度進行評估。HVPG可以反映肝功能和組織結構的變化，因此可以作為肝活檢的有效補充[15,16]。目前，HVPG檢測存在一定的缺陷。超聲引導下門靜脈穿刺測壓(PVP)可能出現出血、栓塞等并發癥；通過肝靜脈導管測壓術檢測HVPG具有創傷性。HVPG反映肝竇壓，與肝靜脈壓力有偏差，并且有一定的技術難度，無法廣泛應用。3)，血清標志物檢測。用于評估和診斷肝纖維化的有用參數包括血小板計數、凝血酶原時間、球蛋白、白蛋白/球蛋白比、總膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、谷氨酰轉肽酶(GGT)、α2巨球蛋白、載脂蛋白A1(ApoA1)、膽固醇、甘油三酯、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)、鐵蛋白、肝珠蛋白等常規指標；還有透明質酸、層黏蛋白、III型前膠原蛋白、IV型膠原、MMPs和TIMPs、TGF-β1、人類軟骨糖蛋白(YKL-40，38KD糖蛋白)、N-聚糖蛋白等血清肝纖維化標志物；生化評分系統(無創診斷模型)，如AST/血小板比值指數(APRI)、FIB-4、Fibrotest、Forns指數、S指數、Hui指數和ELF評分等[17]。

近年來，我們課題組致力于篩選肝纖維化血清生化指標并建立和驗證模型，同時進行蛋白和糖組學研究，鑒定與肝纖維化相關的多肽等標志物[18-22]。2005年，我們團隊在Hepatology雜志上報道了一項應用血小板計數(PLT)、α2巨球蛋白、GGT和年齡等指標構建的肝纖維化非創傷診斷模型(FPM)研究[23-25]。在HBeAg陽性慢性乙型肝炎(CHB)患者，該模型預測II～IV期肝纖維化的受試者工作特征曲線下面積(AUROC)為0.84，其診斷的敏感性和特異性分別為94.8%和95.2%。在驗證組，用于預測II～IV期肝纖維化的AUROC為0.77，其敏感性和特異性分別為98.0%和90.4%。我們的另一項研究納入了532例HBeAg陽性或陰性CHB患者，包括建模組386例患者和驗證組146例患者，并且應用GGT、PLT和白蛋白(ALB)等指標建立S指數模型[S指數=1000×GGT/(PLT×ALB2)][22]。在驗證隊列，S指數預測顯著性肝纖維化、進展期肝纖維化和肝硬化的AUROC分別為0.812、0.890和0.890。二羥丙酮激酶片段(m/z 520.3)是一種新型血漿多肽組學指標，可用于CHB患者肝纖維化分期的預測。我們對CHB患者進行多肽組學差異多肽譜分析，發現多肽片段m/z 520.3對于診斷肝纖維化分期具有較高的敏感性和特異性，診斷區分S2～S4期與S0～S1期的AUROC為0.872～0.955，診斷區分S3～S4期與S0～S2期的AUROC分別為0.862～0.932[26]。我們另一項研究納入889例CHB患者，隨機分成建模組489例和驗證組400例，進行常規實驗生化檢查及肝活檢病理學評估(Knodell HAI評分)，應用Logistic回歸方法篩選出ALT、GGT、PT和ALB這4個最具診斷價值的指標組合，從而建立肝組織炎癥無創預測模型[27]。在應用血清模型診斷肝纖維化時，我們仍需要考慮一些其他因素對結果的影響：1)病因差異，單一病因的預測準確性往往優于復合病因，并且單一病毒感染不同基因型(如HCV)或不同狀態(如HBV)也會產生影響；2)血清模型對于F2/F3期肝纖維化的判別較差，F3以上無單獨的臨界值；3)實驗室差異：不同實驗室檢測過程的標準化及正常上限值不一(如PT和PLT)；4)生理因素，如體質指數(BMI)對多種生化指標水平的影響；5)多數模型未得到廣泛認可。

2.3影像學檢查 常規超聲、CT或MRI有助于診斷肝硬化和發現肝占位，但對肝纖維化早期診斷的意義不大。瞬時彈性成像(Fibroscan)測定肝臟瞬時彈性圖譜可反映肝實質硬度，從而判斷肝纖維化的程度和分級。瞬時彈性成像技術(FibroTouch)采用超聲影像精確定位，測量結果更精確，可以作為肝臟組織形態、纖維化程度和脂肪肝程度的一體化評估方法。肝組織彈性分界范圍與肝纖維化分期顯著相關。MRE利用振動裝置在內臟器官中誘發剪切波，由改進的磁共振成像機器檢測，可以準確預測患者肝纖維化分期。檢測的硬度值越高，反映肝纖維化的程度越重。聲脈沖輻射力(ARFI)彈性成像和二維剪切波彈性成像(2D-SWE)等技術尚在技術開發和臨床研究階段。

總之，目前的診斷方法距離臨床應用尚有一定的差距。肝纖維化的非創傷性診斷是今后的發展方向。臨床、生化和影像學等綜合診斷方法已取得很大進展，肝組織炎癥活動度評估仍需要進一步探索。預期在不遠的將來，隨著新方法和新技術的應用，將會找到新的標志物，并應用于臨床和新藥評估。

3 肝纖維化和肝硬化的治療

肝纖維化和肝硬化的治療包括病因治療、肝纖維化治療、肝硬化并發癥治療和肝癌的監測。肝纖維化的病因治療是根本，但是病因治療尚不能完全阻止肝纖維化進展，如酒精性肝病患者在戒酒后，肝病進展還在繼續；慢性乙型和丙型肝炎在接受抗病毒治療后，肝硬化和肝癌仍有可能發生。目前，有些中藥復方制劑已用于肝纖維化和肝硬化的臨床治療，但尚未有美國食品和藥物管理局(FDA)或中國食品藥品監督管理局(CFDA)等官方批準的化學藥物和生物制劑被批準上市。目前，多數運用藥物治療非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、原發性膽汁性膽管炎(PBC)等不同病因導致的肝纖維化的臨床研究仍處于II期或III期臨床試驗階段，如奧貝膽酸、苯扎貝特、Cenicriviroc、辛妥珠單抗等。

2015年7月，我們與首都醫科大學附屬北京地壇醫院成軍牽頭，啟動了一項治療慢性乙型肝炎的隨機、雙盲、安慰劑對照、以恩替卡韋為基礎、多中心、劑量探索的II期臨床試驗(NCT02499562)。該項試驗總共納入222例患者，排除54例不適合入選的患者后，另168例患者被隨機分組至接受恩替卡韋治療43例或恩替卡韋聯合羥尼酮治療125例，其中42例和105例患者已經完成了52周治療和再次肝活檢。以肝纖維化減輕的定義為Ishak評分下降≥1分為標準，研究表明，約50%聯合組患者肝纖維化得到有效減輕。

4 肝纖維化研究的挑戰

在肝纖維化基礎研究領域，尚存在一系列科學研究挑戰，比如肝臟為什么會再生？肝臟的再生反應與其他組織器官有何區別？肝纖維化與再生之間有什么聯系？隨著肝纖維化的進展，肝再生能力減弱，控制這兩種不同反應的機制和可能關聯是什么？肝纖維化與肝癌之間存在何種聯系？肝纖維化向肝癌轉化的潛在機制是什么？干細胞在正常肝、肝纖維化、肝再生和肝癌發生過程中起什么作用？免疫系統在肝纖維化發生發展過程中的作用？

以下一些問題可能是未來肝纖維化臨床研究的熱點：1)肝臟炎癥是肝纖維化進展的驅動力，聯合抗炎、保護肝細胞、抑制HSC激活等機制是研發抗纖維化藥物的發展方向；2)肝纖維化是機體應對損傷的修復過程，早期對機體有利，因而肝臟靶向性治療的時機尚需要更多的證據；3)肝纖維化進程有多種細胞及細胞因子參與，有時單一藥物的療效可能有限，可能需要聯合多種藥物及靶向多靶點進行治療。聯合治療首先需要證據證明聯合治療各個組成部分都有一定的療效；4)藥物臨床試驗仍需要肝活檢來判斷療效，目前尚缺乏理想的生物學指標和影像檢測手段。