肝臟疾病細胞鐵死亡研究進展*

薛 旗，徐琊蕓 綜述，李 婕 審校

慢性肝病是指各種原因導致的慢性肝臟損傷，其發病原因較復雜，乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、代謝紊亂、飲酒等導致的病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)和酒精性肝病及其相關肝硬化、肝癌是我國主要的慢性肝病。我國脂肪性肝病發病率近30%[1]，病毒性肝炎患病人數達9000萬人[2]，酒精性肝病病人接近6200萬人[3]。因此，慢性肝病發病率極高，是殃及我國近5億人的重大公共健康問題。但目前關于慢性肝臟疾病的具體發病機制尚不清楚。鐵死亡(ferroptosis)是一種鐵依賴性的，脂質過氧化誘導的，區別于細胞壞死、自噬等細胞死亡的新型的程序性細胞死亡(programmed cell death，PCD)方式[4]。鐵死亡在多種疾病，包括腫瘤、炎癥的發生發展中發揮重要作用。近期越來越多的研究成果證明鐵死亡在慢性肝病的發生發展過程中亦發揮著重要作用。

1 鐵死亡概述

1.1 鐵死亡的定義 鐵死亡最早于2012年被正式提出并命名，發現小分子化合物erastin觸發了一種獨特的鐵依賴性非凋亡性細胞死亡形式，erastin通過抑制胱氨酸向細胞內轉運，進而導致谷胱甘肽(glutathione，γ-glutamyl-cysteinyl-glycine，GSH)降低和谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)的失活，最終誘導細胞發生死亡[5]。

1.2 鐵死亡的特征 鐵死亡時超微形態學特征表現為細胞膜斷裂和出泡，線粒體萎縮、線粒體脊減少甚至消失、膜密度增加、細胞核形態正常，但缺乏染色質凝集；電鏡下觀察到胞內線粒體變小、膜密度增高[6]。鐵和活性氧(reactive oxygen species，ROS)聚集，激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)系統，通過降低胱氨酸的攝取、耗竭谷胱甘肽，抑制谷氨酸/胱氨酸反向轉運體(glutamate/cystine transporter又稱 Xc antiporter system, system Xc-)和增加還原型酰腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，釋放花生四烯酸等介質是其主要的生物學特征[7]。

鐵死亡在基因水平上主要受核糖體蛋白L8(ribosomal protein，RPL8)、鐵反應元件結合蛋白2(iron responsive element binding-protein 2，IREB2)、三四肽重復結構域35(tetratricopeptide repeat domain 35，TTC35)、檸檬酸合成酶(citrate synthase，CS)、酰基輔酶A合成酶家族成員2(acyl-CoA synthetase family member 2，ACSF2)的調節，代謝、儲存相關基因TFRC、ISCU、FTH1、FTL也參與其調控過程[5]。

1.3 鐵死亡的機制 在二價鐵或酯氧合酶的作用下，催化細胞膜上高表達的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化，即發生細胞內脂質氧化物代謝障礙，脂質活性氧堆積，細胞抗氧化能力減弱，進而誘導細胞死亡；此外，還表現為抗氧化體系(主要是谷胱甘肽系統)的調控核心酶GPX4的降低。GPX4和systemXc-被認為是介導鐵死亡通路的關鍵因子。具體調節機制表現為以下幾個方面：①抑制GPX4從而誘導鐵死亡：GPX4能降解小分子過氧化物和某些脂質過氧化物，抑制脂質過氧化。研究發現，若細胞中GPX4表達下調則會對鐵死亡更敏感；相反，若上調GPX4的表達，則會產生對鐵死亡的耐受。因此，將GPX4抑制后將誘導細胞發生鐵死亡[8]。②抑制systemXc-從而誘導鐵死亡：system Xc-主要介導谷氨酸與胱氨酸以1:1比例交換，胱氨酸轉運到細胞內，同時排出細胞內的谷氨酸；隨后，胱氨酸可以轉化為半胱氨酸，用于內源性抗氧化劑GSH的合成；最后，GPX4 利用GSH清除細胞內過量的ROS[9]。③鐵離子輸入與鐵離子還原會誘導鐵死亡：向細胞中輸入鐵離子，并且保證鐵離子以二價鐵的形式大量存在會誘導鐵死亡，二價鐵離子通過芬頓反應可啟動脂質體過氧化[5]。

2 鐵死亡與肝臟疾病的關系

近年來研究表明鐵死亡與多種疾病相關，包括癌癥[10]、神經退行性疾病[11]和急性腎損傷[12]。此外，鐵死亡的失調也與各種肝臟疾病相關，抑制鐵死亡可以阻止肝臟疾病，如NAFLD的病理生理學進展，加強鐵死亡則可促進索拉非尼誘發的細胞死亡進而為肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的聯合治療提供幫助[13]。

2.1 鐵死亡與NAFLD NAFLD是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關。包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)及其相關肝硬化。早期單純性脂肪變性通常被認為是良性的，而晚期NASH則更具攻擊性，表現為肝細胞死亡和進展為肝纖維化、肝硬化和HCC[1]。鐵死亡可能是NASH炎癥反應的重要觸發因素，通過膽堿缺乏和乙硫氨酸補充(choline-deficient and ethionine-supplemented，CDE)飲食建立NASH小鼠模型，觀察到小鼠在發展為NASH的起始階段肝細胞鐵死亡先于細胞凋亡出現，并且顯示鐵死亡抑制劑幾乎能夠完全逆轉NASH初期的肝細胞死亡，抑制炎癥反應和脂質過氧化反應，改善肝功能[14]。鐵死亡通過調節氧化應激及其相關的脂質過氧化在NASH的發生發展中起主要作用。實驗顯示在用鐵死亡誘導劑處理的甲硫氨酸和膽堿缺乏(methionine/choline-deficient，MCD)飲食喂養的小鼠的肝臟中發現較高的脂質積累[15]。同樣在MCD建立的模型中發現小鼠肝臟內的花生四烯酸代謝上調，進而出現脂質ROS積聚，同時顯著加速了NASH相關的病理改變，包括炎癥反應、氧化應激和NASH早期的細胞損傷[16]。

鐵伴侶蛋白多聚(rC)結合蛋白1(poly rC binding protein 1，PCBP1)可保護小鼠肝臟免遭脂質過氧化和脂肪變性[17]。作為維持肝臟鐵平衡所必需的物質，PCBP1可控制小鼠肝臟中不穩定鐵池(labile iron pool，LIP)的反應性，從而抑制鐵介導的小鼠脂肪變性、脂質過氧化和肝細胞死亡。也有研究發現絲裂素2(mitofusin 2，Mfn2)與IRE1α(inositol-requiring enzyme 1α，肌醇需求酶1α)的相互作用可促進5-HETE的產生，最終導致砷和鐵誘導的NASH，而使用鐵死亡抑制劑可顯著改善砷引起的鐵超載、炎癥反應和脂質積聚，使NASH明顯減輕[18]。發現在高脂肪飲食(high fat diet，HFD)誘導的ApoE-/-小鼠體內和體外實驗中，銀杏內酯B可能通過核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2)信號通路對NAFLD脂質過氧化和氧化應激引起的鐵死亡有抑制作用，通過調節相關蛋白(GPX4、HO-1、TFR1和FTH1)的表達而調節代謝，抑制氧化應激及肝臟脂質過氧化[19]。

2.2 鐵死亡與病毒性肝炎 有研究發現血清鐵調素及其鐵代謝相關指標是評估慢性乙型肝炎嚴重程度的重要指標[20]，亦有學者提出血清鐵水平可以作為判斷慢性乙型病毒性肝炎轉歸和預后評估指標[21]。以往的實驗已經證實乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)可通過調節各種信號通路使肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)激活而誘導肝纖維化。研究發現大黃酚在HBx存在的情況下增加脂質ROS的產生和內質網應激標志物及鐵死亡標記物的表達上調，表明大黃酚可通過誘導鐵死亡而顯著誘導HBx轉染的HSC死亡，從而抑制HSC增生和分泌細胞外基質，以預防肝纖維化[22]。

2.3 鐵死亡與藥物性肝損傷 藥物性肝損傷是急性肝功能衰竭的主要病因，由藥物引起的肝細胞死亡也有多種方式，其中鐵死亡在藥物性肝損傷中的作用機制吸引眾多研究者的關注。有實驗表明，在抗結核藥物的代謝過程中，大量細胞內GSH和GPX4被耗盡，而活性氧和細胞鐵含量均增多，補充GSH可顯著降低脂質過氧化水平和肝損傷風險，補充鐵則增強異煙肼和利福平誘導的脂質過氧化和肝損傷的程度，證實在抗結核藥物導致的藥物性肝損傷期間出現的脂質過氧化和鐵死亡[23]。APAP誘導的肝毒性、脂質過氧化和鐵死亡標記基因的上調被Fer-1和鐵螯合劑顯著阻止也證實該結論[24,25]。(+)-黃皮酰胺則可通過抑制肝細胞鐵死亡來改善藥物性肝損傷，實驗證明(+)-黃皮酰胺可增加肝細胞中GPX4的蛋白水平，還能夠激活Keap 1-Nrf 2途徑，抑制藥物誘導的肝細胞鐵死亡[26]。

2.4 鐵死亡與酒精性肝病 對腸道特異性SIRT1缺失(SIRT1iKO)的基因敲除小鼠和慢性過量乙醇喂養的小鼠進行乙醇喂養研究，結果發現，乙醇給藥后SIRT1iKO小鼠的肝臟炎癥和肝臟損傷指標比對照小鼠顯著減輕，SIRT1iKO 小鼠的這種保護作用可能是由于減輕鐵代謝功能障礙而造成，證明腸道SIRT1缺乏通過減輕鐵死亡從而保護小鼠免受酒精性肝損傷[27]。還有研究者對lipin-1過表達轉基因(Lpin1-TG)和野生型(WT)小鼠使用慢性過量乙醇喂養方案，在慢性酒精過量攻擊后，Lpin1-TG小鼠表現出比WT小鼠更明顯的脂肪變性、炎癥加劇、血清肝酶升高、肝膽損傷和纖維化反應，小鼠脂肪組織lipin-1的過度表達促進肝臟鐵沉積癥的發生，后在酒精暴露下誘導小鼠鐵死亡性肝損傷[28]。

2.5 鐵死亡與肝纖維化 當肝臟受到炎癥或機械刺激等損傷時，HSC被激活，通過增生和分泌細胞外基質進而促進肝纖維化。以往的實驗證實誘導活化的HSC死亡可能是逆轉肝纖維化的關鍵。越來越多的研究結果表明，細胞鐵死亡在肝纖維化的發生和發展中起著重要作用。RNA結合蛋白ELAVL1可通過激活鐵死亡來促進HSC的死亡，erastin或索拉非尼誘導的ELAVL1上調通過與BECN1基因3’-非翻譯區(3’-untranslated region，3’-UTR)的富含AU的元件(AU-rich elements，AREs)結合而促進BECN1/Beclin1的產生，從而觸發鐵自噬體的生成，促進鐵蛋白降解，最終導致鐵超載鐵死亡，進而減輕小鼠肝纖維化[29]。血紅素氧合酶1(HO-1)介導的HSC鐵死亡是異甘草酸鎂(magnesium isoglycyr-rhizinate，MgIG)改善四氯化碳誘導的肝纖維化和HSC活化所必需的[30]。實驗通過在野生型大鼠中注射50%四氯化碳來建立肝纖維化模型，發現MgIG治療通過促進鐵和脂質過氧化物的積累可顯著誘導HSC鐵死亡，而鐵抑制素1(ferrostatin-1，Fer-1)對鐵死亡的抑制完全消除MgIG誘導的抗纖維化作用。另外，實驗結果也確定HO-1位于MgIG誘導的HSC鐵死亡信號通路的上游位置，敲除HO-1可明顯阻斷HSC鐵死亡，進而加重肝纖維化。同樣位于HSC鐵死亡信號通路上游的分子還有腫瘤抑制因子P53，發現P53依賴的HSC鐵死亡對于蒿甲醚(artemether，ART)改善四氯化碳誘導的HSC活化和肝纖維化是必要的。青蒿琥酯也能通過調節鐵死亡信號通路減輕肝纖維化。有研究表明ART的抗肝纖維化作用需要鐵調節蛋白2(iron regulatory protein 2，IRP2)的參與，而鐵死亡在此過程中起著重要作用，實驗結果表明，ART可抑制IRP2與STIP1同源性和含U框蛋白1(STIP1 homology and U-box containing protein 1，STUB1)的結合，減少IRP2的泛素化，促進細胞內IRP2蛋白的積累，從而增加鐵的流入，減少鐵的儲存和輸出，細胞內鐵的積累會產生過量的ROS，最終誘導HSC的鐵死亡。

2.6 鐵死亡與HCC 手術是HCC最主要的治療手段，但是患者術后復發和轉移發生率較高，分子靶向藥物索拉非尼提供的生存益處也有限，因此，進一步了解HCC中調節性細胞死亡(regulated cell death，RCD)的分子機制已成為開發克服索拉非尼耐藥性的新療法的重要一步。與正常生理狀態肝細胞相比，HCC細胞中RAS致癌基因的高表達、鐵離子含量增加，脂質ROS的累積，越來越多的研究結果表明鐵死亡在HCC的發生、發展中扮演著重要角色。異檸檬酸脫氫酶2(isocitrate dehydrogenase 2，IDH2)是產生NADPH的主要酶，而NADPH是線粒體GSH合成的重要來源，這啟發了研究者探索IDH2敲除對體外培養的人HT1080纖維肉瘤和鼠Hepa1-6肝癌細胞以及裸鼠同種異體移植Hepa1-6細胞體內模型中鐵死亡的影響。IDH2基因的下調可增強癌細胞對鐵死亡的敏感性而促進鐵死亡。研究表明，IDH2敲除導致腫瘤生長減少是由于GPX4抑制，最終導致細胞死亡。精氨酸修飾的囊泡狀硅酸錳納米顆粒(arginine-rich manganese silicate nanobubbles，AMSNs)可以作為腫瘤靶向治療的鐵死亡誘導劑，細胞水平結果顯示AMSNs可以高效地消耗細胞內的GSH，從而抑制細胞內GPX4的活性，引起細胞內過氧化脂質的堆積，最終通過鐵死亡的途徑引起腫瘤細胞死亡。也有研究[30]發現p62-Keap1-NRF2抗氧化信號通路是參與HCC細胞ROS和鐵死亡相關基因轉錄激活的關鍵負調節因子，結果表明，p62介導的Keap1降解導致鐵死亡中NRF2活化，NRF2調節基因NQO1、HO1和FTH1通過改變鐵代謝和脂質過氧化而抑制鐵死亡。泛素樣修飾因子激活酶1(ubiquitin-like modifier activating enzyme 1，UBA1)也通過NRF2信號轉導途徑通過調節Huh7表型和鐵死亡參與了HCC的發展[31]。另外，Sigma-1受體(S1R)[32]也被證明是人類HCC細胞中鐵死亡的負調節因子，它調節許多參與活性氧和鐵代謝的靶位，以及最關鍵的鐵死亡靶位GPX4。HIC1-HBA1和HNF4A-STMN1軸通過谷胱甘肽合成中的關鍵酶PSAT1反向調節GSH的產生[33]。在肝癌，鐵死亡由轉錄的差異調節控制。研究鑒定了兩類基因：鐵死亡上調因子(ferroptosis up-regulated factors，FUF)和鐵死亡下調因子(ferroptosis down-regulated factors，FDF)，它們通過影響GSH的合成來促進和抑制鐵死亡，HBA1和STMN1為FUF和FDF的代表因子。FUF由轉錄因子HIC1控制，而FDF由轉錄因子HNF4A控制。賴氨酸-乙酰轉移酶2B(lysineacetyl transferase 2B，KAT2B)通過調節組蛋白和非組蛋白的乙?；脚c腫瘤的發生發展相關，在促進鐵死亡時，KAT2B的解離阻止HNF4A結合到FDF啟動子，這種效應發生在KAT2B募集到FUF啟動子之前，有助于HIC1結合轉錄FUF。破壞HIC1和HNF4A之間的平衡是用erastin處理后誘發鐵死亡的先決條件，刺激HIC1的同時抑制HNF4A 11可能有助于肝癌的治療。

3 小結與展望

鐵死亡參與多種肝病的發生和發展機制。鐵死亡在慢性肝臟疾病發病過程中的作用機制研究非常重要，其在治療領域的臨床意義也逐漸顯現出來。目前，人們對鐵死亡的研究還有許多機制不明，尤其關于鐵死亡與慢性肝病的臨床研究相對較少，對于兩者之間的關系知之甚少，例如通過抑制鐵死亡治療慢性肝病是否具有臨床可行性，鐵死亡在慢性肝病的疾病演變階段，如從炎癥階段、纖維化階段進展到肝硬化或肝癌階段是否發揮作用等問題還有待于進一步基礎和臨床研究的突破。