宏基因組二代測序在結核性腦膜炎早期診斷中的應用

賈立斌，鄭 榜，汪光柱，李潤卓，杜工亮

（1.西安醫學院研究生部，陜西 西安 710021；2.陜西省人民醫院急診外科，陜西 西安 710068）

結核?。╰uberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染性疾病。在2019 年，全球約有1000 萬人感染TB，造成了極大的社會經濟負擔[1]。結核性腦膜炎（tuberculous meningitis，TBM）是MTB 感染腦膜、脊膜誘發的亞急性或慢性非化膿性中樞神經系統感染性疾病[2]，是肺外結核最嚴重的一種類型[3]。TBM 多起病隱匿，早期的臨床表現與其它類型腦膜炎相似，均可出現發熱、頭疼、嘔吐等癥狀，而頸項強直、意識障礙等神經系統癥狀、體征則出現較晚；同時腦脊液抗酸染色涂片（acid-fast bacilli，AFB）、腦脊液MTB培養等方法靈敏度低、消耗時間長[4]。GeneXpert MTB/RIF（簡稱XpertMTB/RIF）是一種基于核酸擴增的肺外結核檢測技術，具有快速、自動及靈敏度較高的優勢，但其特異度較低，不能用做排除診斷[5]，而且這些檢測方法在成人、兒童及合并人體免疫缺陷病毒感染（human immunodeficiency virus infection，HIV）者中的診斷效能亦不盡相同[6]，均給TBM 的早期診斷帶來了極大的挑戰。宏基因組二代測序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）是一種高通量、無偏倚對樣本中所含脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）或核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）進行平行測序，再通過生物信息分析得出病原微生物信息的技術，包括樣本采集、核酸提取、文庫制備、測序、生物信息分析及報告解讀等步驟[7]。近年來，mNGS 逐漸被應用于中樞神經系統感染性疾病的早期診斷[8，9]，并取得了良好的效果。目前關于腦脊液（cerebrospinal fluid，CSF）mNGS 技術在TBM 早期診斷的應用研究雖然不多，但也取得了一些進展，現將腦脊液mNGS 在TBM 早期診斷中的應用綜述如下。

1 mNGS 技術常用原理

自1977 年Sanger F 等[10]發明雙脫氧鏈終止法進行DNA 測序以來，人類開始進入測序時代。核酸測序對生命科學、生物技術和醫學發展的創造性和重要性，推動了人們對更高效、更準確和更低成本技術的不斷探索。近些年來不斷有新的技術平臺誕生，包括核酸測序在內的基因組學在容量、速度及應用方面均有長足的發展[11]。目前，Illumina 公司的HiSeq、MiniSeq、NextSeq 等測序平臺在市場上占主流地位，這些平臺的測序原理均采用合成測序技術（sequencing by synthesis，SBS）[12]。

在DNA 復制過程中，DNA 聚合酶將自由堿基逐個連接，形成一條與DNA 模板鏈互補的新鏈。而SBS 的核心就是對DNA 模板鏈（即待測序DNA）和自由堿基的加工處理，即“DNA 簇”和“可逆性末端終止”技術[13]。DNA 簇是指每個DNA 片段等溫擴增的過程。首先用超聲波把待測序DNA 鏈打斷成若干條都含幾百個堿基的DNA 片段，其次在DNA 片段兩端接入寡核苷酸接頭，通過接頭與寡核苷酸錨配對將片段固定到玻片表面后，解離雙鏈，形成一端固定在玻片上的DNA 單鏈，然后另一端的接頭與錨配對亦連接到玻片上，形成“橋”式結構，最后通過聚合酶鏈式技術（即橋式PCR 技術）制備成單克隆DNA 簇群?？赡嫘阅┒私K止技術是將修飾（含不同顏色熒光標記及可逆性末端終止基團）的脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）作為底物完成單堿基配對、測序的方法，每次反應都包含DNA 聚合酶和修飾dNTP 的滲入、合成鏈延伸一個堿基、單堿基熒光顯微鏡采集熒光信號和已連接dNTP 恢復延伸功能及洗滌熒光標記的過程，重復進行滲入、延伸、采集、恢復4 個步驟，最后通過解讀不同熒光顏色，獲得DNA 的精準序列[14]。

2 腦脊液mNGS 在TBM 早期診斷中的應用

病原菌檢測是目前確診TBM 的主要方法。常用的TBM 病原菌檢測方法有腦脊液AFB、腦脊液MTB 培養及XpertMTB/RIF 方法等。CSF 作為一種無菌性體液，在感染狀態下，MTB 含量較少，AFB 檢測陽性率較低，在Sun WW 等[15]進行的一項臨床試驗中發現其陽性率僅為2.91%；目前，腦脊液MTB 培養仍是TBM 診斷的“金標準”，但由于MTB 細胞壁的脂質含量相對較高，影響了營養素的吸收，導致細菌在培養基中生長緩慢，培養耗時在2～4 周以上，對TBM 早期診斷的價值有限[16]。XpertMTB/RIF 方法是一種快速、高靈敏度的核酸擴增試驗，同時可進行利福平敏感性測驗，2015 年WHO 推薦其用于TBM 的早期診斷，其結果陽性時可用于TBM 的早期診斷，但陰性結果不能用于排除診斷[17]。這些方法均不能滿足臨床診斷的需要，而mNGS 可以對血液、肺泡灌洗液、腦脊液、胸腹水、尿液、糞便、分泌物等多種標本進行細菌、病毒、真菌、寄生蟲及非典型病原微生物的無假設、快速、平行檢測，尤其對培養困難、病情危重的感染性疾病有獨特價值[18]。從2014 年Wilson MR 等[19]首次使用mNGS 診斷1 例鉤端螺旋體腦膜炎的重癥免疫缺陷兒童以來，腦脊液mNGS技術逐漸開始應用于TBM 的早期診斷領域。

2.1 成人TBM 早期診斷 一直以來，TBM 的早期診斷都是困擾臨床醫生的難題，而早期診斷對于減少TBM 患者的致死率和神經系統后遺癥又有相當重要的價值[2]。2020 年Xing XW 等[20]報道的腦脊液mNGS 用于213 例中樞神經系統感染患者診斷的前瞻性病例研究中，在TBM 組中（共44 例TBM 患者），當以屬特異性讀數量≥1 為陽性標準時，mNGS的真陽性率為27.3%，真陰性率為96.4%，總符合率為82.2%，受試者工作曲線的曲線下面積最大（0.619,95%CI=0.516～0.721）；44 例患者的腦脊液AFB 及MTB 培養結果均是陰性，腦脊液Xpert MTB/RIF 陽性率為16.13%；聯合mNGS 和Xpert MTB/RIF 陽性率為29.55%；雖然腦脊液mNGS 的陽性率仍不高，但高于現有的其它檢測手段，且其特異性較高，可用于TBM 的早期診斷和排除診斷。Lin A等[21]報道的一項前瞻性隊列研究顯示，對50 例不合并HIV 的懷疑TBM 成人患者進行腦脊液mNGS 檢測，20 例檢測出MTB；以傳統的診斷方法（包括腦脊液培養和AFB 染色）和Xpert MTB/RIF 為金標準，22 例患者確診為TBM，其中mNGS 的敏感性為63.6%（14/22）；以最終臨床診斷為金標準，在22 例確診TBM 患者和12 例臨床診斷TBM 患者中，mNGS 的敏感性為58.8%（20/34），16 例排除TBM患者中，mNGS 結果均為陰性，特異性為100%，而傳統診斷方法和Xpert MTB/RIF 的敏感性分別為29.4%（10/34）、38.2%（13/34）；mNGS 診斷的敏感性高于傳統診斷方法及Xpert MTB/RIF 法。Sun W 等[22]的關于mNGS 用于診斷肺外結核的回顧性研究顯示，mNGS 對TBM 的敏感性明顯高于其它肺外結核病，達到了84.44%，提示mNGS 對不同類型標本的MTB 診斷效果不同，以腦脊液最佳，而且對比抗結核治療前、后mNGS 的陽性檢出率，提示抗結核治療對mNGS 的敏感性無明顯影響。

2.2 兒童TBM 早期診斷 兒童神經系統、細胞免疫系統發育不完全，導致MTB 侵入兒童中樞神經系統后起病隱匿，早期臨床癥狀多不典型，加之患兒配合程度差，體液量相對較少，及傳統的腦脊液AFB 和MTB 培養法在兒童中的敏感性遠低于成人，這些均給兒童TBM 的早期診斷增加了難度[23]。張芙蓉等[24]報道的1 例以“頭暈1 周、嘔吐4 天”為主訴的10 歲患兒，初步考慮為顱內占位，入院后病情進展迅速，意識障礙加重，完善腦脊液常規、生化檢驗及顱腦MRI 檢查后考慮為中樞神經系統感染，而第1 次結核菌素試驗、結核感染T 細胞試驗、腦脊液AFB 均為陰性，給予抗病毒治療后，患兒癥狀無明顯改善，隨后腦脊液mNGS 檢測，檢測到MTB 基因序列，且未檢出其它病原微生物序列，給予抗結核治療后癥狀很快好轉，最終診斷為TBM 合并血管炎，提示腦脊液mNGS 可應用于兒童不典型TBM 的早期診斷。錢喬喬等[25]收集的5 例9 月齡～13 歲患兒中，臨床表現不典型，腦脊液生化檢驗不是TBM 典型表現，多次行AFB 均為陰性，行腦脊液mNGS 檢查后均檢出MTB，診斷為TBM，其中有1 位患兒因病情危重，家長放棄治療后死亡，余給予抗結核治療后癥狀均明顯好轉，表明mNGS 有助于早期精準診斷TBM，改善患兒預后。

2.3 合并HIV 的TBM 早期診斷 TBM 可以影響所有人群，但在HIV 患者和兒童中尤其常見[26]。由于免疫功能缺陷，HIV 患者合并TBM 的可能性是其他患者的5 倍，病死率可達60%[6]，而早期識別、早期診斷及適當的治療是改善預后的基礎，因而早期診斷TBM 對合并HIV 患者尤為重要。在診斷過程中，應注意患者的免疫功能狀態，因為免疫缺陷對不同診斷方法的敏感度及特異度均有一定的影響。Chen J等[27]對88 例疑似中樞神經系統感染的HIV 患者進行的一項回顧性性研究中，通過腦脊液涂片、培養及mNGS 等方法有73 例最終實現病原微生物的診斷，其中mNGS 診斷50 例，陽性率為56.8%，包括巨細胞性腦炎、單純性皰疹病毒性腦炎、隱球菌性腦膜炎等，同時mNGS 確診患者CD4+T 淋巴細胞計數明顯低于未確診者，mNGS 可能更適合CD4+T 淋巴細胞計數低的患者；在18 例以癥狀、其他實驗室檢測和試驗性治療的效果診斷為中樞神經系統感染的患者中，mNGS 未發現病原體，其中包括8 例臨床懷疑為TBM 患者（AFB 及XpertMTB/RIF 均為陰性），mNGS最常見的漏診疾病是臨床懷疑的TBM；回顧其mNGS 檢測方法，考慮與腦脊液樣本核酸提取方法有關。結核桿菌是一種胞內菌，需要采用特殊的破壁方式，才能提取出結核桿菌DNA。

3 腦脊液mNGS 應用于TBM 早期診斷存在的不足

雖然mNGS 技術在TBM 早期診斷中發揮著愈發重要的作用，但在其使用過程中仍存在很多不足。①樣本離心處理：MTB 是一種較難進行核酸測序的病原菌，其在腦脊液中繁殖速度慢、細菌含量少，導致mNGS 陽性率不高。Ji XC 等[28]對腦脊液樣本進行離心，提取上清液用于測序，減低了人源基因的比例，提高了mNGS 對MTB 的靈敏度。故對高度懷疑TBM 者，先進行腦脊液樣本離心處理，選用離心后上清液進行mNGS，以提高測序靈敏度；②樣本破壁處理：mNGS 首先要盡可能獲得樣本中所含的全部核酸信息，而MTB 作為一種胞內菌，其細胞壁厚，常規破壁方式處理后其核酸釋放效率低，是導致MTB 檢出率低的1 個重要原因，因此，應對臨床上不能排除MTB 感染者，加用特殊破壁方式處理樣本，以提高MTB 檢出率；③測序結果可靠性：測序結果可靠性主要由最小測序深度所決定[14]。最小測序深度是指測序過程中某段序列被檢測到的最少次數，以確保獲得全部基因信息。最小測序深度越大，其可靠性就越高，同時成本亦越高，所以確定不同體液樣本的最佳最小測序深度就尤為重要。目前，腦脊液的最佳測序深度沒有明確的界定，臨床醫生及科研人員應進一步開展大型前瞻性試驗研究，從而明確腦脊液的最佳最小測序深度，從而控制成本，提高腦脊液mNGS 的準確性；④陽性結果的判定：目前檢測結果解讀缺乏統一標準，需要專業的微生物專家根據本實驗室具體情況解讀，帶有一定的誤判率，應建立臨床醫生與微生物專家之間的高效聯絡，尤其是檢測出多種病原菌，在判定致病菌時，從而做出更真實的判定；對MTB 等較難測序的微生物，檢出一條特異序列即可認定為陽性，但仍需根據臨床癥狀及檢測結果判定是否有多重感染可能；⑤指導用藥：mNGS 與培養不同，不能進行細菌體外藥敏試驗，直接指導臨床用藥；但對TBM 患者，診斷耐藥結核分枝桿菌對降低其死亡率至關重要[29]?？蓪z測出的MTB 進行已知耐藥基因靶向測序，篩選出耐藥基因，再根據藥敏檢測表型結果，得出關鍵的耐藥基因，結合藥物的作用機理和耐藥基因的耐藥機理，給出用藥建議，同時可進行體外驗證。

4 總結與展望

近年來隨著社會的進步、醫藥衛生事業的發展，TBM 的發病率較前有所下降，但其對人類健康的危害不容小視，尤其目前TBM 的早期診斷方法仍存在許多不足之處。近年來隨著mNGS 技術的不斷發展，逐漸從實驗室走向臨床應用，其在TBM早期診斷方面表現出許多優勢，但仍需要更多的臨床研究來證明其效用，同時制訂統一的操作標準及結果解讀指南，進一步降低成本，更好的服務臨床。