細胞外基質在女性盆腔器官脫垂手術中的應用進展

翁雨亭，蔣秀秀，方克偉

(1.昆明醫(yī)科大學研究生院，昆明 650000； 2.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院泌尿外科，昆明 650000)

盆腔器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)是指一個或多個盆腔器官(膀胱、直腸、尿道、子宮等)進入陰道或通過陰道向下膨出[1]，通常由盆腔支撐系統(tǒng)無法提供持續(xù)的支撐力所致[2-3]。在重力(如長時間站立、運動后)或非重力作用下(如長時間仰臥)，POP癥狀會加重，且腹肌緊張時癥狀更明顯[4]。POP在成年女性中十分普遍，流行病學顯示，我國成年女性POP患病率約為14.80%，且絕經后患病率隨著年齡增長而明顯升高[5]。POP嚴重影響女性生活質量，給社會帶來巨大經濟負擔[6]。

POP的傳統(tǒng)對癥治療藥物包括三環(huán)類抗抑郁藥[7]、雌激素抑制劑[8]、α腎上腺能激動劑、中藥[9]等，但目前尚無針對POP的特效藥物，臨床常以手術治療作為最終治療手段，約10%的有癥狀患者接受POP手術治療，手術材料常選用單絲聚丙烯網片，但網片與骨盆組織的機械特性不匹配可能導致網片排異、侵蝕以及網片暴露等特定并發(fā)癥[10]，這極可能是POP患者手術治療后復發(fā)率較高的主要原因[11-12]。早在2011年，美國食品藥品管理局發(fā)現經陰道放置網片治療POP存在嚴重的安全性問題，并于2016年將其歸類為“高風險”材料，并建議無癥狀POP患者僅進行常規(guī)護理即可[13]。鑒于此，尋找組織兼容性更好、安全性更高的盆底肌重建材料是降低POP術后并發(fā)癥發(fā)生率的重要影響因素。現就細胞外基質(extracellular matrix，ECM)涂層聚丙烯網的特性、制備技術及其在女性盆底重建中的應用研究和技術改良予以綜述。

1 ECM的特性及分類

ECM是常駐細胞的分泌產物，參與構成復雜的由結構和功能分子組成的獨特的組織特異性三維細胞外微環(huán)境[14]。ECM可調節(jié)細胞的形狀、極性、凋亡、增殖和侵襲，并使其在正常情況下發(fā)揮生物力學性能[15]，成為近年組織再生領域的新型材料。ECM可細分為間質ECM(主要由纖維狀膠原、彈性蛋白和纖連蛋白組成)和專門的細胞黏附性ECM[16]。ECM亞類包括膠原蛋白、蛋白聚糖、糖蛋白、ECM相關蛋白、ECM調節(jié)劑和分泌因子等，其中最重要的是膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ及彈性蛋白，它們是維持結締組織強度及組織完整性的基礎[17]。

影響ECM重塑反應的因素包括募集內源性干細胞和祖細胞、螯合生長因子[18]、降解過程中釋放具有生物活性ECM片段[19]以及調控巨噬細胞表型來調節(jié)先天免疫反應[20]。研究表明，帶有ECM的支架可形成豐富的血管反應，其中血管生成因子(血管內皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和轉化生長因子-β)有利于植入部位的細胞生長及組織愈合[21]。現代技術通過凍干、酶消化等過程將ECM制成室溫下呈液體且37 ℃時呈膠凍樣的溫敏性水凝膠，其可黏附于人體局部組織并持續(xù)發(fā)揮作用[22]。目前，不同組織來源ECM水凝膠的組織重塑性均較強，其作為一種新型支架載體已廣泛應用于組織工程領域。

2 ECM涂層聚丙烯網制備技術

2.1ECM涂層聚丙烯網技術原理 人工合成材料上往往沒有細胞黏附位點，而聚丙烯網片可通過適當的化學方法(如應用一些親水材料或通過改變幾何形貌)提供足夠的細胞黏附力，以利于細胞在這些生物惰性材料上黏附和生長。目前ECM與聚丙烯結合形成的最常見材料為ECM涂層聚丙烯網。ECM中包含的生物活性因子可作為化學引誘劑，通過招募細胞增強細胞反應和生物功能，使主要蛋白質(包括紐蛋白和肌動蛋白)表達增加，以實現快速骨再生和切口愈合[23]。

2.2實驗室ECM涂層的聚丙烯網制備步驟 目前實驗室常用的ECM涂層為豬真皮ECM，其傳統(tǒng)實驗室制備方法為：通過機械分層去除豬全層皮膚的皮下脂肪和表皮，依次用胰蛋白酶處理6 h、70%乙醇處理10 h、3%過氧化氫處理15 min后，將其在含有1% Triton X-100的0.26%乙二胺四乙酸溶液中放置6 h后更換新鮮溶液再放置16 h，隨后在0.1%過氧乙酸4%乙醇浸泡2 h[24]。需要注意的是，每次更換溶液后都用純水沖洗，最后交替使用純水和磷酸鹽緩沖液沖洗，且所有的化學變化均在300 r/min的軌道振動器攪拌下進行。然后，將真皮ECM冷凍、凍干，并粉碎成40目的粉末。將經酶解后的真皮ECM粉溶于胃蛋白酶溶液，48 h后配置成濃度為10 mg ECM/ml的溶液。將溶解后的真皮ECM置于冰上，加入一定體積的磷酸鹽緩沖液與氫氧化鈉，使其達到生理pH值和鹽濃度，然后用磷酸鹽緩沖液進一步稀釋至8 mg ECM/ml，立即將ECM消化液加入預切的聚丙烯網片中，直至凝膠化發(fā)生。處理好的聚丙烯網置于37 ℃孵化器中30～45 min，直到真皮ECM在網狀物周圍和聚丙烯網纖維之間形成水凝膠，隨后將真皮ECM水凝膠包埋網片置于37 ℃環(huán)境風干12 h，完成包覆過程。

3 ECM涂層聚丙烯網在女性POP手術中的優(yōu)勢及應用研究

術后異物反應常與纖維化、組織順應性下降有關，而局部炎癥與聚丙烯不可降解有關，而天然ECM合成的網狀材料可降低纖維化程度，但存在機械強度較低、提供的支撐力有限、在體內降解速率不一等問題[25]。可見，ECM涂層聚丙烯網既不影響網片的機械強度又可減輕術后異物反應。

3.1減少局部炎癥反應 ECM可通過限制破壞性炎癥反應、招募所需細胞群(包括祖細胞)以及支持細胞附著、增殖和基質生產來促進特定位點的功能性組織重塑[26]。哺乳動物的ECM中存在抗菌肽，與合成支架材料相比，豬小腸ECM涂層支架的持續(xù)性細菌感染抵抗力更強，但其作用機制尚不清楚[27]。

Wolf等[24]將傳統(tǒng)聚丙烯網片與豬真皮ECM涂層聚丙烯網分別置于雌性大鼠腹部，分別在不同時間點處死大鼠后進行組織學和力學分析，結果顯示，ECM涂層聚丙烯網可有效減輕典型的異物反應及炎癥反應，且在不降低機械強度的情況下，ECM涂層聚丙烯網片的網狀結構孔徑更大，即通過減少每單位面積纖維累積和纖維組織的沉積增加ECM涂層聚丙烯網片的柔順度，從而預防萎縮。在植入網片后期，已降解涂層被疏松的膠原結締組織代替，減少了初始細胞向網孔區(qū)域的浸潤，即ECM涂層有利于網片植入后短期內的組織重塑。

為探究ECM涂層聚丙烯網片植入部位炎癥反應減輕的原理，有研究采用熒光標記法測量巨噬細胞表型并進行組織學分析發(fā)現，ECM涂層能減弱M1型巨噬細胞的反應，并增加M2/M1與聚丙烯網的比值[28]。Faulk等[29]的動物實驗顯示，在6個月內，ECM涂層不影響網眼內的組織強度，且植入網片部位成熟膠原沉積減少，慢性炎癥反應減輕。Sicari等[30]發(fā)現，與年長動物衍生的支架相比，年幼動物衍生的支架更具建設性，更適合部位的組織重塑反應，這為ECM涂層的優(yōu)化提供了新思路。

3.2促進骨盆及陰道內新生膠原的成熟 盆底新生膠原成熟是影響POP術后恢復的因素之一。在分子間疏水和靜電力的作用下，膠原蛋白分子易在固定溶液環(huán)境中自組裝成原纖維[31]。Darzi等[32]在骨盆解剖和陰道大小與人類相似的羊模型中，比較未修飾的PP網和兩種含膠原網片的長期組織反應，通過免疫染色和形態(tài)計量學定量觀察巨噬細胞表型、對植入網狀物的反應以及血管數量，利用Sirius Red雙折射和形態(tài)計量學定量分析顯示，ECM成分、膠原組織和網狀植入物界面周圍面積百分比的變化在網狀組織界面的微觀分子水平上存在顯著差異；與陰道內植入的未經修飾的聚丙烯網相比，網眼中的膠原蛋白可明顯促進網眼絲周圍膠原纖維的成熟，使涂覆膠原蛋白網片中的總成熟膠原蛋白和未成熟膠原蛋白水平均更接近天然組織。Wang等[33]將制造的仿生膠原蛋白支架應用于大鼠跟腱缺損模型，觀察到納米水平上隨膠原纖維形成而出現平行排列的膠原蛋白原纖維，同時再生肌腱的橫截面也出現膠原蛋白基質沉積和重塑，提示膠原蛋白覆膜網片通過促進新膠原成熟改善生物相容性和愈合反應。

3.3維持陰道平滑肌形態(tài)與功能 ECM涂層聚丙烯網可有效維持陰道平滑肌的功能及形態(tài)，有利于術后盆底功能的恢復。Nagatomi等[34]發(fā)現，神經支配對于維持正常的平滑肌形態(tài)和功能至關重要。Shaffer等[35]在恒河猴模型中比較了傳統(tǒng)聚丙烯網片、雙層ECM復合網片及單純6層ECM生物支架肌束和肌細胞形態(tài)、橫截面直徑和α平滑肌肌動蛋白的表達，并采用神經介導的平滑肌收縮性測試研究神經密度，結果顯示，單獨植入聚丙烯網片可導致局部肌肉形態(tài)紊亂，并可使陰道平滑肌收縮力降低63%、陰道神經密度降低48%、陰道α平滑肌肌動蛋白表達降低68%；與聚丙烯網片植入相比，雙層ECM復合網片及單純6層ECM生物支架植入后陰道平滑肌的肌束更有條理，組織形態(tài)類似于假手術，且陰道α平滑肌肌動蛋白水平升高近2倍，幾乎與假手術無差別。但單純6層ECM生物支架植入會導致陰道平滑肌出現誘導適應性反應，即增加小的平滑肌束數量，而肌細胞大小或收縮功能并未改變。這為探索植入的ECM復合網片在微觀形態(tài)、收縮特性、神經支配方面對陰道平滑肌結構和功能的影響機制提供了重要證據，為ECM復合網片在POP手術中的應用帶來希望。

4 ECM涂層聚丙烯網在女性盆底手術領域的技術改良

4.1組織原位脫細胞法(in situ decellularization of tissue，ISDoT) 脫細胞技術可將ECM從天然細胞和遺傳物質中分離出來，同時保留ECM的固有結構、生物學活性及機械完整性[36]。經脫細胞技術處理的ECM可形成天然支架，防止盆底組織塌陷，且其還可進行再細胞化，以產生功能性組織或器官。

傳統(tǒng)的脫細胞技術無法提高ECM體系結構的體內成像分辨率，且可能影響組織的完整性和生物分子結構。鑒于此，Mayorca-Guiliani等[37]開發(fā)了一種以血管流為導向的脫細胞方法，稱為ISDoT，該方法可通過小鼠的心血管系統(tǒng)將脫細胞試劑有效地遞送至任何器官或組織，其原理是利用天然組織和器官脈管系統(tǒng)有效去除細胞，防止組織塌陷，以維持組織ECM結構的穩(wěn)定；研究者通過二次諧波成像和染色觀察到，ISDoT可實現任何組織或解剖器官系統(tǒng)的完全脫細胞化并保留ECM結構，這為研究天然ECM成分的組成和分布以及繪制健康和患病器官的三維(3D)空間結構圖提供了可能。質譜分析結果表明，ISDoT可用于分析ECM的所有亞類，提示ISDoT可用于多種組織和器官，但不會丟失ECM成分；進一步修改原始程序后，ISDoT可對包含盆底組織的33種不同組織進行脫細胞處理[38]。因此，ISDoT在組織發(fā)育和體內平衡以及疾病發(fā)展過程中發(fā)生的ECM重塑結構的研究中具有巨大潛力，并具有3D成像功能，有利于術后ECM網片的體內定位，避免破壞ECM結構。目前，ISDoT已在小鼠模型中應用，隨著手術領域的擴展，未來ISDoT在女性POP手術中的運用有巨大潛力。

4.2具有可控3D結構的納米電紡纖維ECM 電紡絲利用靜電力從聚合物溶液或熔體中形成直徑通常為1～10 μm的聚合物納米纖維或微纖維墊，其結構與天然的ECM相似，導致基質具有較高的表面積與體積比，在體內植入時可促進細胞黏附與生長[39]。此外，電紡纖維可由多種生物或合成聚合物制成，其具體類型取決于特定的應用和患者的病情[40]。納米纖維生產的靜電紡絲新技術源于工業(yè)，用于生產可降解聚合物，目前生物領域有一種具有大規(guī)模生產納米纖維ECM的新型工業(yè)無針多噴靜電紡絲設備，該納米纖維ECM具有可控的3D形態(tài)。研究表明，在不同加工條件(如電壓、電極距離、旋轉電極速度級電場強度)下，不同濃度明膠聚合物溶液經電紡絲化后均可獲得具有較理想3D形態(tài)的3D結構納米電紡纖維；與傳統(tǒng)平面聚合物材料相比，具有3D結構的納米電紡纖維的生物相容性更強，且其表面附著的間充質干細胞增殖明顯改善；蛋白質印跡分析結果顯示，間充質干細胞中α-微管蛋白和樁蛋白的表達增加[24]。未來，無針多噴靜電紡絲技術可能用于批量生產具有固有生物相容性和干細胞理想整合能力的人工ECM，且其可能在臨床手術中大規(guī)模應用。

4.3添加雌二醇的ECM涂層聚丙烯網 陰道壁中足夠的ECM有助于維持盆底結構，而雌激素通過控制膠原的重塑速度在維持盆底結構中起關鍵作用；另外，雌二醇還具有直接刺激血管內皮細胞以及上調血管內皮生長因子和血管內皮生長因子受體表達的促血管生成作用[41]。臨床中，晚期POP患者陰道成纖維細胞的重塑能力大大降低。Weber等[42]發(fā)現，術前局部使用雌激素能夠有效改善POP患者盆底結構的完整性。Rahn等[43]研究顯示，低濃度雌激素可通過刺激陰道成纖維細胞的分裂以及改善陰道周圍血管的血供來改善盆底結構。有研究者在電紡絲技術的基礎上，將脂溶性17-β-雌二醇添加于PU聚合物溶液中，在人脂肪來源的間充質干細胞接種的聚合物支架上進行為期3個月的雌二醇釋放檢測實驗，結果顯示，從實驗第10天開始，支架連續(xù)3個月釋放有效的低濃度雌二醇，提示添加雌二醇的ECM支架可促進體外細胞模型陰道成纖維細胞的再生、加速盆底血供恢復[2]，但相關體內及臨床試驗尚未開展。

5 目前ECM涂層聚丙烯網用于POP手術的缺點

網狀聚合物的類型、材料重量、細絲結構和孔徑是體內生物相容性的重要決定因素[40]。ECM涂層聚丙烯網在體內的生物相容性明顯提高。由于ECM涂層聚丙烯網無法達到ECM在天然生物組織中的應變值，修補后的組織不能完全達到損傷前的自然狀態(tài)。同時，由于有關ECM涂層聚丙烯網的長期研究較少，其長期有效性及降解后的影響等尚無法評估[24]。目前暫無統(tǒng)一且高效的ECM合成與制備方法，現有制備方法存在難度大、費用高等問題，極大地限制了ECM涂層聚丙烯網的研究和應用[44]，且ECM涂層聚丙烯網的應用大多限于動物模型，其用于女性盆底重建還需要大量安全性研究的證實，故尚未完成臨床應用轉化。嚴謹的動物實驗研究和臨床試驗是ECM涂層生物材料成熟應用于臨床的關鍵。因此，加速生物材料的發(fā)展有助于未來ECM的臨床應用。

6 小 結

女性盆底疾病嚴重影響中老年女性生活質量，手術治療是重度POP的終末治療手段。傳統(tǒng)的單絲聚丙烯網片廣泛存在排異反應，這是引起POP手術復發(fā)率較高的原因，因此需要尋找一種可以減少炎癥及排異反應，且機械硬度不降低、能夠維持正常盆底器官結構及位置的材料。與傳統(tǒng)材料不同，ECM涂層生物材料在保留傳統(tǒng)材料機械硬度的同時具備一定的生物相容性，可抑制炎癥反應、減少巨噬細胞、促進新生膠原成熟，有助于維持平滑肌的形態(tài)與功能。國內動物實驗表明，ECM涂層聚丙烯網可改善POP術后炎癥、排異反應及其并發(fā)癥[45]，但各種來源ECM各具優(yōu)缺點，故ECM涂層聚丙烯網在臨床盆底手術中的推廣應用仍需大量臨床病例對照研究以及長時間隨訪的進一步驗證。未來，可通過各類技術改良使ECM涂層聚丙烯網具有更好的生物學效應，并可通過完善ECM涂層生物材料的功能，提升其體內植入的精確度。