多發性骨髓瘤的CAR-T治療研究進展

賈慶華，馬俊，張富婷，牛廷獻

(聯勤保障部隊第九四〇醫院 a.檢驗科，b.基礎醫學實驗室 甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，蘭州 730050)

多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是骨髓中的一種克隆性漿細胞疾病，其特征是骨髓中的克隆性漿細胞不受控制地增殖且凋亡受阻，產生異常數量的單克隆免疫球蛋白并導致末端器官損傷[1]。MM是第二大常見的血液惡性腫瘤，約占所有癌癥類型的1%，血液腫瘤的13%[2]。MM的發病機制與機體遺傳學異常導致的基因突變、甲基化改變、基因和信使RNA失調以及造血微環境改變有關[3-4]。

隨著蛋白體抑制劑、免疫調節藥物以及單抗隆抗體等新藥物的引入，MM的治療方法顯著增多。雖然MM治療取得一定的進展，但是耐藥性的產生和反復發病導致MM依然無法治愈。嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)治療被認為是近年來最具前景的腫瘤新型療法之一，已成功治療了急性淋巴母細胞白血病和彌漫大B細胞淋巴瘤，CAR-T延長了患者的生存期和緩解期，對部分標準治療失敗的患者也有效[5]。現階段研究的主要方向是提高CAR-T的功效和體內持久性，目前第1代嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)已經被更強大的第2代和第3代CAR所取代。為避免健康組織遭受CAR-T攻擊，CAR-T目標抗原的選擇對于CAR-T的療效非常關鍵。在MM中，CAR-T治療仍處于起步階段。現就MM中CAR-T療法相關抗原的研究進展及現階段所面臨的問題進行綜述，為CAR-T治療MM的基礎研究和臨床應用提供借鑒。

1 CAR-T的結構和作用機制

CAR-T治療又稱細胞免疫治療或細胞過繼免疫治療，是將患者免疫細胞經體外處理，加入特異性抗原并用細胞因子刺激，從而篩選并大量擴增具有高度特異性的免疫效應細胞，然后回輸到患者體內殺滅腫瘤細胞或病毒，臨床應用多以自體免疫細胞為主。為了發揮特異和有效的抗腫瘤效應，T細胞被轉導到一個由4個主要元素組成的結構，分別是單鏈可變片段(single-chain variable fragment，ScFv)、跨膜結構域、共刺激分子和刺激分子[6]。ScFv用于引導T細胞向腫瘤細胞轉移，通常來源于針對腫瘤表面抗原的抗體可變區，其是免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區與短鏈連接的融合蛋白，在CAR-T治療中起著至關重要的作用，決定了CAR-T治療的特異性和有效性[7]。跨膜結構域由CD8、CD28或免疫球蛋白的疏水α-螺旋結構組成，這些疏水α-螺旋結構插入橫跨細胞膜的膜脂雙層中[8]。雖然跨膜結構域的主要功能是將CAR錨定在T細胞膜上，從而增加CAR-T與靶向腫瘤細胞的結合強度，但有證據表明其對T細胞的激活也有作用[8]。刺激和共刺激分子是T細胞完全激活所必需的，這是由經典的雙信號假設定義的，其中信號1是由T細胞受體與抗原呈遞細胞上的肽-主要組織相容性復合物之間的相互作用提供；信號2是T細胞上的共刺激分子CD28和抗原呈遞細胞上的CD80(B7.1)或CD86(B7.2)相互作用介導的共刺激信號[9]。因此，目前CAR-T構建的版本既編碼共刺激分子，也編碼刺激分子。共刺激分子包括一個或多個：CD27、CD28、誘導性協同刺激分子、4-1BB、OX40[10]。目前尚不清楚這些分子的共刺激水平是否不同。目前最常用的刺激分子來自CD3ζ鏈。

2 CAR-T靶向MM抗原目標

識別合適的腫瘤相關靶抗原是CAR-T治療成功的關鍵。一般來說，靶抗原必須同時具備有效性和安全性。首先，抗原必須在腫瘤細胞表面表達。事實上，CAR結合是以一種主要組織相容性復合物獨立的方式發生，降低了人白細胞抗原下調導致的免疫逃逸風險[11]。擴大靶向抗原可以治療更大范圍的腫瘤，因此T細胞受體模擬CAR識別腫瘤抗原/人白細胞抗原復合物逐漸發展起來。其次，抗原在惡性細胞上均勻表達是腫瘤存活的理想條件。最后，靶點幾乎不存在于相關的健康組織中，以最大限度地減少對非腫瘤組織的影響。由于MM細胞遺傳和表型的異質性，同一MM患者細胞表面抗原的表達可能存在變化。靶向抗原應在MM細胞上特異性表達，以避免靶向腫瘤外毒性。但MM特異性抗原尚未被鑒定出來。幾種抗原包括B細胞成熟抗原CD19、CD38、CD138、信號淋巴細胞激活分子家族成員F7 (signal lymphocyte activating molecule family member F7，SLAMF7)、κ輕鏈和B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)已被用作CAR-T治療MM的靶點。目前CAR-T療法尚未被批準用于MM的治療，但有幾種抗原已完成早期臨床試驗或正在進行臨床試驗。

2.1CD19 CD19屬于免疫球蛋白超家族，是成熟B細胞表面多分子復合物的顯性信號成分。靶向CD19治療B淋巴細胞白血病和B細胞性淋巴瘤非常有效[12]。CD19在惡性漿細胞上表達較少，且在少量MM細胞中呈低水平表達，而MM干細胞多表達CD19[12]，MM干細胞是一種具有自我更新能力和耐藥性的腫瘤細胞[13]，CD19可作為MM治療的可靠靶抗原。Garfall等[14]的研究(NCT02135406)評價了抗CD19 CAR-T(CTL019)治療復發難治性MM(relapsed or treatment-refractory multiple myeloma，RRMM)的效果，結果發現，給予高劑量Melphalan和自體造血干細胞移植后，患者藥物耐受良好且病情緩解。

CD19 CAR-T也可與BCMA CAR-T聯合使用。徐州醫科大學附屬醫院開展了一項單中心、單臂Ⅱ期臨床試驗，選取21例RRMM患者行CD19 CAR-T聯合BCMA CAR-T治療，在179 d的中位隨訪時間中，20例患者總體緩解，包括9例嚴格意義的完全緩解、3例完全緩解、5例非常好的部分緩解和3例部分緩解，證實CD19聯合BCMA CAR-T用于RRMM治療的可行性[15]，但其初始治療值需要在隨機試驗中進一步確認。

2.2CD38 CD38又稱環腺苷二磷酸核糖水解酶，是一種存在于多種免疫細胞表面的跨膜糖蛋白，參與細胞的黏附、信號轉導和鈣調控[16]。CD38通常在B細胞、漿細胞、T細胞、自然殺傷細胞以及骨髓前體細胞表達，也在髓系前體細胞、前列腺細胞、肌肉細胞、破骨細胞以及其他細胞表達[17]。以上細胞與正常造血細胞相比CD38表達水平更高，因此被用于MM細胞的檢測[18]。CD38在骨髓瘤細胞和健康造血細胞中均表達，這增加了腫瘤靶向/非靶向毒性的風險[19]。基于免疫治療的方法中，兩種針對MM細胞CD38的單克隆抗體Daratumumab和Isatuximab已經在臨床上進行了測試，顯示能顯著改善復發性或難治性MM患者的預后，也能改變新診斷患者的前期治療前景[20]。Daratumumab作為單藥，治療難治性骨髓瘤的緩解率為36%[21]。早期的臨床前研究顯示，雖然靶向CD38的CAR-T增殖并產生細胞因子，并最終溶解CD38+MM細胞，但由于溶解CD38-骨髓瘤細胞的脫靶效應，毒性風險無法消除[22]。有研究采用親和力優化技術，利用輕鏈交換產生抗CD38抗體，該抗體與CD38的結合親和力與Daratumumab相似，CD38嵌合抗原受體轉導的T細胞也能溶解CD34+造血祖細胞、單核細胞、自然殺傷細胞的CD38+部分，并在較小程度上溶解T細胞和B細胞，但不抑制祖細胞向各種髓系的生長，且都可以被基于Caspase-9的自殺基因有效控制[21]。因此，有研究在Caspase-9的基礎上結合自殺基因改變CAR的結構，以消除CAR-T的毒性[23]。近年，CD38靶向的CAR-T已被用作復發性或難治性MM患者的單一治療(NCT03464916)[24]，部分臨床試驗正在探索CD38靶向CAR-T與其他靶抗原的組合，包括CD19(NCT03125577)和BCMA(NCT03767751)[23-24]。

2.3CD138 CD138是一種黏附分子，與細胞外基質的分子膠原和纖維連接蛋白結合，促進細胞增殖[25]。該蛋白還介導細胞黏附、細胞信號轉導，參與不同階段的癌發生相關，如腫瘤細胞的增殖、轉移、侵襲以及血管生成，一般成熟上皮細胞、部分惡性漿細胞及正常細胞均有CD138表達，但正常T細胞和B細胞不表達CD138[26]。復發或疾病進展患者MM細胞上CD138的表達水平高于新診斷的患者[27]。近年有研究將一種名為BT062(indatuximab)的抗CD138抗體-藥物偶聯物用于32例重度MM患者的治療，治療后75%的患者病情穩定，BT062聯合來那度胺治療的總有效率為83%[28]。研究顯示，抗CD138 CAR-T在體內外均對MM細胞有顯著的抗腫瘤毒性作用。解放軍總醫院首次將抗CD138 CAR-T用于人體試驗研究(NCT01886976)，對5例RRMM患者進行了化療和干細胞移植預處理，結果顯示4例患者病情穩定持續3個月以上，1例晚期漿細胞白血病患者外周血MM細胞從10.5%降至低于3%[29]。該研究的樣本量較小(n=5)，因此結果可能不足以進行有意義的解釋，但可接受的安全性和有限的抗腫瘤活性為進一步研究奠定了基礎。劉宇等[30]構建了靶向CD138的第4代CAR-T(CD138-BBZ-7×19)，結果發現該細胞在體外的生物學功能優于第2代CAR-T(CD138-BBZ)，且在MM動物模型中具有明顯的抗腫瘤作用。盡管CD138作為MM的治療靶點具有一定價值，但CD138 CAR-T從惡性細胞脫落是一個潛在的缺陷。避免皮膚毒性和潛在的聯合治療是未來需要深入研究的方向。

2.4SLAMF7 SLAMF7也被稱為CD319，由SLAMF7基因編碼[31]。SLAMF7廣泛表達于漿細胞、正常B細胞和T細胞亞群、自然殺傷細胞、單核細胞、樹突狀細胞，是單克隆抗體的治療靶點。SLAMF7高表達于95%以上的MM細胞，不僅參與MM細胞的存活、增殖，還參與免疫細胞的調控，表達可能不受疾病階段的影響[32]。靶向于SLAMF7的CAR-T已經顯示出了很好的臨床前活性。埃羅妥珠單抗是與SLAMF7結合的人源化單克隆抗體，與來那度胺聯合可使RRMM患者客觀緩解率大于90%；此外，埃羅妥珠單抗治療還延長了MM患者的無進展生存期[33]。一種新型的抗SLAMF7/BCMA雙特異性CAR-T產品正在進行臨床前開發，目的是增加腫瘤覆蓋和克服抗原丟失。與表達單個CAR-T的細胞相比，帶有單鏈抗體的CAR-T細胞包含兩個配體結合域串聯連接(一個用于SLAMF7，一個用于BCMA)，其表現出更強的活性[32]。BCMA/SLAMF7雙特異性CAR-T細胞與程序性死亡受體1檢查點抑制劑聯合使用，可加速體內腫瘤的清除[34]。

2.5κ輕鏈 輕鏈亞群(κ或λ)可在成熟B細胞上表達，針對其可進行靶向免疫治療。在MM患者中，一個特定的輕鏈子集可以靶向MM腫瘤細胞。雖然不是所有漿細胞都表達細胞表面免疫球蛋白，但MM干細胞上可能有免疫球蛋白表達[35]。Vera等[36]于2006年構建了第1個κ輕鏈CAR-T(κ.CAR-T)，其目的是在不損害體液免疫的情況下靶向B細胞惡性腫瘤。Hutchinson等[37]以κ輕鏈為靶抗原進行研究發現，κ輕鏈對正常B細胞功能抑制作用較輕，不僅減少了低丙種球蛋白血癥的發生，對體液免疫的抑制作用也較弱。成熟B淋巴細胞、成熟B淋巴樣惡性腫瘤細胞和骨髓瘤細胞只表達κ或λ輕鏈，因此針對κ輕鏈可防止B細胞完全消融。Ramos等[38]使用第2代κ.CAR-T進行了一項Ⅰ期臨床試驗(NCT00881920)，7例MM患者接受環磷酰胺治療后注入κ.CAR-T，治療后4例患者病情穩定，持續時間2～17個月，但3例患者治療無反應。另外，κ輕鏈免疫球蛋白分泌到血液中，降低了在MM細胞上的表達，限制了CAR-T治療的作用[38]。

2.6BCMA BCMA屬于腫瘤壞死因子受體超家族，通過與腫瘤微環境中的B細胞活化因子和增殖誘導配體結合，阻止MM細胞凋亡[39]。BCMA表達于MM細胞、惡性漿細胞表面，基本不表達于記憶B細胞、幼稚B細胞、CD34+造血干細胞等其他正常組織細胞[39]。BCMA具有顯著的靶向潛能以及更少的靶向腫瘤毒性，并且在CAR-T的擴增中減少了抗原依賴性，但其潛在的缺點是可溶性BCMA可以從腫瘤釋放或脫落到周圍組織并進入循環[40]。BCMA的表達水平隨著MM病程進展而升高[39]，此表達特征使BCMA成為MM免疫治療的理想靶點。美國國家癌癥研究所進行了BCMA靶向CAR-T的第1個臨床試驗(NCT02215967)，利用小鼠ScFv、信號域CD3ζ和共刺激域CD28作為抗BCMA CAR-T的組成部分，結果顯示使用最小劑量的CAR-T[(0.3～3.0)×106個/kg]觀察到輕微的細胞毒性，總緩解率為20%；注射最高劑量的CAR-T(9×106個/kg)具有顯著的抗腫瘤功能，客觀緩解率達81%，但有嚴重的CRS[41]。

另一項臨床研究(NCT02658929)檢測了由ScFv、CD3和4-1BB結構域組成的抗BCMA CAR-T(bb2121)治療33例RRMM的效果，其中客觀緩解率為85%，主要不良反應為CRS(76%)和神經毒性(42%)[42]。bb21217是繼bb2121之后的新一代抗BCMA CAR-T，除體外培養時添加磷脂酰肌醇-3-激酶抑制劑bb007外，bb21217的結構與bb2121相似，這種增加記憶樣表型T細胞比例的修改促使CAR-T更持久和有效[43]。bb21217 Ⅰ期劑量遞增臨床研究(NCT03274219)顯示，7例RRMM患者用1.5×108個CAR-T處理，CAR-T細胞顯著擴增，有5例患者發生CRS，包括1例3～4級腦病的劑量限制性毒性患者[43]。LCAR-B38M是一種靶向BCMA表位VHH1和VHH2的雙特異性CAR-T產物。使用LCAR-B38M抗BCMA CAR-T治療57例MM患者發現，88%的患者具有整體反應，68%的患者完全緩解，但也存在一些不良反應，包括細胞因子釋放綜合征、白細胞減少、血小板減少以及發熱[44]。P-BCMA-101是一種靶向BCMA的CAR-T產品，包含完全人源化的抗BCMA ScFv胞外結構域、CD3ζ和4-1BB信號域。在Ⅰ期臨床試驗研究(NCT03288493)中評估了P-BCMA-101治療RRMM的有效性和安全性，12例患者中有1例為完全緩解，1例發生2級細胞因子釋放綜合征[45]。

靶向BCMA的CAR-T治療RRMM有效，且嚴重細胞因子釋放綜合征和神經毒性的發生率與CD19 CAR-T相似[46]。目前抗BCMA CAR-T在MM治療方面顯示出相當大的潛力，且不會引起無法控制的細胞因子釋放綜合征或意外毒性，但仍需要進一步研究以確定治療反應的持久性以及最佳的CAR結構和細胞產物組成。

3 CAR-T治療的局限性

靶向骨髓瘤相關抗原的CAR-T治療給MM的治愈帶來了新的希望。隨著治療患者數量的增加，治療相關的毒性和疾病復發提示CAR-T治療的局限性，包括腫瘤外毒性、抗原逃逸、非最佳激活和CAR-T治療持久性不佳等。首先是治療相關毒性，CAR-T治療相關的毒性可分為兩類：①因T細胞對腫瘤細胞的識別和激活以及隨之而來的高水平細胞因子不受控制的釋放而產生的一般毒性(對靶點、對腫瘤的毒性)；②CAR-T與正常細胞表達的靶抗原特異性結合產生的毒性(靶向、非腫瘤毒性)。其次是CAR-T治療后復發，其中最常見的原因是腫瘤細胞的出現以及靶抗原表達缺失或下調。迄今為止，已有多個臨床試驗報道了BCMA CAR-T治療后BCMA丟失或殘余MM細胞BCMA表達下調[47-48]。由于接受治療的MM患者中存在大量的腫瘤亞克隆，治療過程中出現或已存在的BCMA低表達或BCMA陰性亞克隆更有可能發生抗原逃逸。

CAR-T臨床應用的一個潛在限制是患者血清中存在可溶性蛋白抗原。靶抗原可以從細胞膜上釋放進入血液循環，CAR-T可能會因為與可溶性靶抗原結合而導致功能消除。在MM中，CD138細胞外結構域可從細胞表面分離，而CAR-T通過與分離的CD138細胞外結構域結合而導致功能消除，從而導致免疫逃逸[49]。靶抗原的切割并不只針對CD138蛋白，BCMA也可以從MM細胞釋放到血清中[50]。

從MM患者身上獲取足夠數量的T細胞以生產CAR-T可能是可行的。bb2121臨床試驗表明，100%接受白細胞分離的患者都能成功生成BCMA CAR-T[42]。但由于骨髓瘤患者免疫系統惡化，從中收獲的T細胞質量可能是一個重要的限制因素。因此，與骨髓瘤反應相關的最可靠指標是注入CAR-T的體內擴張水平和持久性[51]。另一方面，患者的年齡、既往治療方法和疾病本身都可能限制患者來源T細胞的數量和質量，潛在地影響CAR-T產品的效力和可變性[52-53]。

4 小 結

CAR-T是治療MM的一種有前景的新方法，其能夠殺死對標準療法有抗性的MM細胞。目前CAR-T治療MM正處于改進和提高階段，今后的主要目標是改進CAR-T結構、增加CAR-T安全時效性以及管理CAR-T細胞治療的長期并發癥。首先，最大優化CAR技術主要是通過持續完善不同的共刺激、鉸鏈和跨膜結構域以及降低CAR的免疫原性。其次，為了達到最佳的患者反應需要優化傳統CAR-T，增加其安全性和有效性，并提高制造的可行性。抗原結合域的選擇是CAR設計中克服可溶性蛋白對CAR-T破壞的關鍵因素。最后，對耐藥機制的進一步研究可提高療效的持久性，同時減少腫瘤治療相關的毒性。目前CAR-T治療可能會成為RRMM患者治療的關鍵策略。因此，為MM靶向細胞治療設計最優化的CAR結構，即最大程度地殺傷腫瘤細胞并避免發生細胞因子釋放綜合征、神經毒性等不良反應，是未來MM靶向治療面臨的主要問題。