高遷移率族蛋白B1在結直腸癌中的機制研究

趙威威，原娜，陳安祺，張賢雨，盧秀榮，張志林

(1.河北北方學院研究生學院，河北 張家口 075000； 2.河北北方學院附屬第一醫院放射治療科，河北 張家口 075000)

隨著人們生活水平及生活質量的提高，結直腸癌(colorectal cancer，CRC)已成為危害我國人民生命健康的主要惡性腫瘤之一，由于CRC患者早期癥狀不明顯,就診時有一半以上的患者已經發生遠處轉移。近年對CRC發病機制的深入研究證實，高遷移率族蛋白(high mobility group，HMG)B1與CRC發生發展密切相關[1]。CRC組織中HMGB1的表達明顯升高，而HMGB1表達直接參與CRC的浸潤和遷移過程，且HMGB1表達水平越高，CRC分期越晚。HMGB1是HMG家族的最重要成員，在細胞核內具有高度保守性，主要參與DNA修復、轉錄和基因組穩定，在細胞核外表觀遺傳后具有促進炎癥、免疫、細胞增殖、自噬、凋亡和轉移的作用[2]。體外研究表明，結腸癌LoVo細胞中受翻譯調節的腫瘤蛋白過表達可導致HMGB1從細胞核釋放到細胞質并進入細胞外空間，通過結合Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)/晚期糖基化終末產物受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)而激活核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)通路，進而促進LoVo細胞的侵襲和轉移；同時體內實驗證實，受翻譯調節的腫瘤蛋白在裸鼠內過表達可增強腫瘤組織中HMGB1的表達，并激活NF-κB信號通路中的關鍵蛋白[3]。另外，腫瘤細胞釋放的HMGB1也可通過結合TLR4激活NF-κB信號通路促使白細胞介素(interleukin，IL)-6和腫瘤壞死因子-α分泌，誘導腫瘤發生[4]。早期研究發現，CRC分泌的HMGB1可誘導腫瘤微環境中巨噬細胞凋亡，從而抑制宿主的抗癌免疫系統，且臨床研究證實，HMGB1水平與巨噬細胞數量呈負相關[5]。另有文獻報道，HMGB1向胞外釋放增加可抑制放療的抗腫瘤作用[6]。現就HMGB1在CRC發生發展中的研究進展予以綜述，以期為CRC的臨床診療提供理論依據。

1 HMGB1概述

HMGB1是一種位于細胞核內的多功能非組蛋白，包含兩個結合位點(N端A和中央B)以及一個酸性C端尾巴，這種結構對穩定染色體、維持端粒酶和修復DNA功能起關鍵作用[1]。HMGB1是一種損傷相關分子模式分子，在細胞損傷、感染和炎癥過程中，其從細胞核轉運到細胞質，最終分泌到細胞外[7]。在細胞外，HMGB1以3種互斥的氧化還原狀態存在，分別為全硫醇HMGB1(完全還原)、二硫鍵HMGB1(半氧化)、末端氧化的HMBG1。全硫醇HMGB1具有促使免疫細胞向炎癥部位浸潤的作用；二硫鍵HMGB1具有誘導細胞因子活化的作用，觸發各種細胞因子從鄰近細胞釋放，參與炎癥反應的全過程；而末端氧化的HMGB1可抑制炎癥反應[8]。因此，HMGB1可能因其不同氧化還原狀態在不同疾病的發病機制中發揮不同的作用。HMGB1的主要受體是TLR和RAGE，兩種受體的信號通路不同，但發生應激反應時，兩者最終均可促使NF-κB磷酸化，并可被蛋白酶降解，從而導致細胞增殖、炎癥，甚至誘發腫瘤和促進腫瘤轉移相關靶基因的激活[2]。

2 HMGB1促進CRC發生、發展

2.1HMGB1促進CRC的基因改變 CRC的發生發展是多步驟的涉及多基因改變的復雜過程。腫瘤抑制基因腺瘤性結腸息肉病(adenomatous polyposiscoli，APC)基因突變被認為是CRC中常見的早期突變[9]。APC基因是Wnt信號的關鍵調節劑，在調節腸內穩態中發揮至關重要的作用。在APC基因功能喪失后，一方面，腸上皮細胞內Wnt信號激活，導致HMGB1的主動分泌，且血清HMGB1水平顯著提高，誘導CRC細胞增殖、遷移；另一方面，HMGB1信號可能通過RAGE釋放并促進炎癥激活，進而對正常腸道穩態和干細胞進行反饋調節，導致CRC的發生發展。在中和抗HMGB1抗體后，APC基因喪失相關“缺氧”區域的程度明顯降低，隨之CRC的療效有所提高。

Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因是一種原癌基因，在CRC的發展和治療中起重要作用，其中30%～45%的Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因的12或13位密碼子表達發生突變；Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因主要激活Raf-促分裂原活化的蛋白激酶級聯反應，最終導致促分裂原活化的蛋白激酶底物磷酸化和致癌轉錄因子激活，從而驅動癌細胞的增殖、侵襲和化學耐藥性[10]。研究發現，HMGB1-RAGE可能以Yes相關蛋白依賴的方式觸發Wnt/β聯蛋白信號，通過上調結腸癌HCT-116和SW480細胞中CD44和Sox2的表達促進CRC進展，而應用HMGB1抗體后，結腸癌細胞的增殖明顯受到抑制[11]，故可通過HMGB1探索CRC基因改變的機制。

2.2HMGB1促進CRC的增殖和轉移 CRC浸潤和轉移是導致腫瘤相關死亡的主要原因。HMGB1在促進CRC細胞增殖、侵襲和遷移中起重要作用。有研究表明，沉默HMGB1表達可顯著抑制CRC細胞增殖、侵襲和遷移[12]。一方面，可能與JAK/信號轉導及轉錄活化因子3通路的激活有關；另一方面，可能與RAGE信號通路相關的蛋白質產生及其磷酸化有關。當裂解的胱天蛋白酶3和增殖細胞核抗原表達增加時，HMGB1的表達也相應增加[13]。另外，HMGB1合成的反義寡脫氧核苷酸也減少了胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2、Rac1和蛋白激酶B的磷酸化以及誘導型一氧化氮合酶、NF-κB p65和基質金屬蛋白酶9的產生。因此，HMGB1-RAGE軸可作為抗CRC治療的靶標[14]。綜上，HMGB1可能通過多種途徑促進CRC細胞增殖和遷移，同時上述途徑也可增強HMGB1的作用，可能是抑制CRC轉移的一種方法。

2.3HMGB1誘導CRC的自噬 自噬是一種自我消化機制，可通過消除溶酶體降解受損的細胞器和蛋白質聚集體來促進細胞存活。研究發現，HMGB1可在轉錄水平上調節自噬，且自噬也可能誘導HMGB1的分泌[15]。HMGB1通過誘導CRC自噬并促進其細胞存活，即微管相關蛋白1輕鏈3和Beclin1，促進B細胞淋巴瘤/白血病-2的磷酸化，進而抑制CRC細胞的凋亡。一方面，可能與促分裂原活化的蛋白激酶激酶/ERK信號轉導通路激活導致的化學性耐藥有關；另一方面，可能與c-Jun氨基端激酶通路的激活，從而促進內質網應激誘導的自噬，抑制細胞凋亡有關[16]。此外，氧化氫和超氧化物歧化酶1介導的氧化應激可促進細胞質中HMGB1的表達，并促進其在細胞外釋放。在氧化應激條件下，HMGB1是存在氧化應激的自噬傳感器，可反饋地抑制HMGB1釋放，進而減少人和小鼠細胞系中自溶酶體和自噬通量的數量[17]。腸上皮 HMGB1可直接參與抑制信號轉導及轉錄活化因子3的活化、保護腸道免受細菌感染和其他物質的損傷。當沙門菌感染腸上皮細胞缺乏HMGB1時，信號轉導及轉錄活化因子3重新分布，自噬減少[18]。有證據表明，腫瘤微環境中CRC自噬的增加可加速腫瘤的侵襲，且結腸癌Lewis細胞自分泌的HMGB1與RAGE結合可激活ERK1/2信號通路，促進腫瘤細胞自噬，并抑制其發生細胞凋亡[15]。由此可見，HMGB1導致的自噬可通過限制腫瘤細胞的壞死和炎癥反應增加CRC細胞的損傷，進而發揮促瘤作用[16]。自噬是導致實體瘤轉移和生長的潛在危險因素，故調控自噬中HMGB1的作用可能成為治療CRC的新方法。

2.4HMGB1促進CRC的能量代謝 正常細胞主要以糖酵解和氧化代謝方式供應能量，而癌細胞主要以無氧糖酵解方式滿足能量需求，這可能通過微管相關蛋白1輕鏈3、Beclin1的激活以及其他細胞的自噬實現[17]。在無氧糖酵解過程中，腫瘤細胞可促進肌肉細胞中 HMGB1的表達，其通過識別肌肉細胞RAGE介導丙酮酸激酶的失活，不利于肌肉細胞的能量代謝。另外，由于缺乏糖酵解產生的乙酰輔酶A，HMGB1增加了肌肉細胞內谷氨酰胺的攝取，體內研究發現，腫瘤細胞分泌的HMGB1可將谷氨酰胺整合到乙酰輔酶A中，并誘導肌肉細胞將谷氨酰胺轉移至癌細胞[19]，表明HMGB1可通過谷氨酰胺途徑為腫瘤細胞提供能量，這可能是抑制腫瘤細胞進展的策略之一。

3 HMGB1參與CRC的侵襲和轉移

3.1HMGB1誘導CRC的上皮-間充質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT) EMT在腫瘤進展早期階段的腫瘤細胞侵襲和轉移中起著不可或缺的作用[20]。一方面，HMGB1可能通過RAGE依賴性激活來誘導EMT，參與CRC細胞的遷移。HMGB1與RAGE的相互作用可導致各種蛋白質(Snail蛋白、NF-κB和基質金屬蛋白酶7)上調，而這些蛋白質是EMT啟動的開關[21]。在腫瘤微環境中，癌細胞能夠誘導基質細胞(如成纖維細胞)的活化，活化的成纖維細胞可分泌生長因子和各種基質金屬蛋白酶[22]，進而影響細胞-細胞和細胞-細胞外基質的“交流”，最終促進CRC細胞的遷移[23]。另一方面，CRC細胞釋放的HMGB1可通過激活TLR4誘導成纖維細胞活化，與HMGB1觸發磷脂酰肌醇-3-激酶和促分裂原活化的蛋白激酶通路的激活有關[24]。因此，進一步評估HMGB1結合RAGE和TLR4的方式及其影響因素有助于更好地認識HMGB1在CRC侵襲和轉移中的作用。

3.2HMGB1促進CRC的血管生成 HMGB1的高表達參與腫瘤的血管生成，而血管形成可為腫瘤的生長和轉移提供營養支持[25]。HMGB1可以激活促血管生成信號，促進CRC的血管形成，也可通過自分泌和旁分泌的反饋機制上調其受體RAGE和TLR4的表達，進而導致血管內皮細胞遷移[26]。臨床研究發現，與正常結腸內皮細胞相比，CRC患者結腸內皮細胞HMGB1水平明顯升高，其原因可能為：①HMGB1通過激活NF-κB誘導血管內皮細胞中各種促血管生成基因的表達，包括整合素、基質金屬蛋白酶、E選擇素和促炎性白細胞黏附分子(如血管細胞黏附分子1和細胞間黏附分子1)，其中E選擇素可促進ERK1/2和p38的磷酸化，進而介導CRC細胞的轉移，同時磷酸化的ERK1/2和p38可進一步增強HMGB1的分泌[27]。②HMGB1可釋放血管內皮生長因子A，并上調血管內皮生長因子受體1和2、神經纖毛蛋白1的表達，誘導CRC的血管生成[26]。③HMGB1也可刺激血小板衍生生長因子的表達，后者參與新生血管的生長和發育[28]。此外，HMGB1還可促進CRC淋巴內皮細胞的形成。CRC患者HMGB1的高表達不僅與血管內皮生長因子C有關，還與淋巴微血管密度顯著相關，其機制可能是HMGB1通過激活NF-κB上調血管內皮生長因子C，從而影響淋巴管的浸潤[29]。體內外實驗證實，HMGB1中和抗體可顯著抑制CRC新生血管的形成，RAGE抑制劑也可抑制HMGB1誘導的促血管生成[26]。因此，可通過靶向HMGB1抑制腫瘤細胞與內皮細胞之間的血管生成，進而抑制CRC血管生成。

4 HMGB1與CRC的免疫反應

HMGB1具有抑制宿主免疫系統的作用，在協調免疫和炎癥反應中起關鍵作用。近年研究發現，HMGB1參與腫瘤浸潤淋巴細胞、調節性T細胞、髓源性抑制細胞的形成[6]，并通過與RAGE和TLR4相互作用激活多條信號轉導通路，導致各種促炎介質的產生以及固有免疫反應的激活。HMGB1通過激活RAGE/TLR4增強磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路的傳導，從而破壞調節性T細胞的穩定性[30]。調節性T細胞作為防止免疫系統攻擊自體器官的免疫耐受細胞，可抑制CD8+T細胞、B細胞、自然殺傷細胞和抗原呈遞細胞的活化及增殖，并釋放IL-10抑制性細胞因子，進而促進腫瘤生長[31]。此外，HMGB1通過誘導調節性T細胞產生IL-10來抑制CD8+T細胞的抗腫瘤作用，導致CRC的局部浸潤和擴展[32]。另外，CRC細胞中的HMGB1具有通過結合TLR4誘導單核細胞分泌腫瘤壞死因子-α的能力。HMGB1可通過激活RAGE誘導 NF-κB活化，從而提高癌細胞的存活率[33]。免疫系統可感知腫瘤并募集和激活腫瘤抗原特異性CD8+T細胞，從而抑制腫瘤生長，CD8+T細胞作為腫瘤浸潤淋巴細胞，參與適應性免疫應答，是抗腫瘤免疫的主要作用因子[31]。有研究發現，HMGB1通過抑制樹突狀細胞將腫瘤抗原呈遞給T細胞，從而導致腫瘤逃逸，這不僅與樹突狀細胞的c-Jun氨基端激酶磷酸化顯著減少有關，還與胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶9 的增多有關[34]。另外，HMGB1可通過調節中性粒細胞的活化和自噬促進多形核髓系抑制細胞產生，髓源性抑制細胞不僅可誘導腫瘤血管生成，還可重塑腫瘤微環境[35]。研究發現，腫瘤分泌的HMGB1以劑量依賴的方式誘導庫普弗細胞凋亡[36]。另一項研究發現，CRC中浸潤的細胞毒性T淋巴細胞高表達與腫瘤低復發率和良好預后有關[37]。故認為，HMGB1可通過抑制或減弱先天性和適應性宿主免疫抑制癌細胞進展。

然而，HMGB1也具有增強免疫反應的作用，其可能與免疫球蛋白的增強有關。實驗研究發現，HMGB1具有誘導樹突狀細胞激活和成熟的能力，通過識別樹突狀細胞實現抗原呈遞，進而促進效應T細胞的分化和增殖，增強抗瘤作用[38]。HMGB1通過誘導嗜酸粒細胞脫顆粒增強免疫反應[39]。自然殺傷細胞分泌的HMGB1通過引發代謝性細胞死亡誘導CRC細胞死亡，這與其抑制焦磷酸丙酮酸激酶作用有關[40]，不利于腫瘤細胞的能量代謝。

CRC細胞表達的HMGB1具有趨化白細胞的作用。經HMGB1處理的小鼠巨噬細胞可激活B細胞的NF-κB，進而誘導IL-6、IL-12、CC趨化因子配體5、CC趨化因子配體19、CC趨化因子配體20、粒細胞集落刺激因子和粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的聚集，參與腫瘤的進展[41]。HMGB1在調控腫瘤的免疫反應中具有雙重作用，對其進行深入研究有助于抑制其促癌特性，并保持其抗癌特性。

5 小 結

HMGB1主要通過RAGE/TLR直接作用于腫瘤細胞，加速基因突變，影響代謝及自噬，促進腫瘤細胞的增殖、浸潤、遷移；或通過間接促進腫瘤的EMT、血管形成及腫瘤免疫微環境影響CRC的發生發展，上述機制涉及多種信號通路的激活或失活以及促炎因子的釋放和固有免疫細胞的抑制，甚至誘發抑制性免疫細胞并導致腫瘤逃逸。將基于HMGB1中和抗體的實驗研究以及人源化抗HMGB1單克隆抗體用于CRC發生發展機制的研究和實踐，可能是治療CRC的一種可行方法。