人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA 在宮頸病變中的研究進展△

見永康，吳澤俊，何娟，莊雅麗

安徽醫科大學附屬婦幼保健院婦產科，合肥 230000

宮頸癌是一種婦科常見的惡性腫瘤，近年來，宮頸癌在中國女性中發病率顯著升高，引起了人們對宮頸癌早期篩查的重視。研究表明，高危型人乳頭瘤病毒（high risk-human papilloma virus，HR-HPV）持續感染是導致宮頸癌的最主要因素[1]，在感染過程中，E6/E7 mRNA在宿主細胞中的表達發揮了重要作用。目前已發現的HPV有150多種，其中有40多種可導致宮頸病變。隨著宮頸癌篩查技術的不斷提高，大多數癌前病變能被及時發現并給予相應的治療措施，在早期即可阻斷其發生惡性進展的可能。因此，學習并繼續推動宮頸癌篩查技術的發展有著重要意義。

1 宮頸癌主要早期篩查方法

宮頸癌病因明確，對已有性生活的女性來說，定期進行宮頸癌篩查具有較高的價值。

1.1 巴氏涂片法

巴氏涂片法最早應用于診斷宮頸癌前病變和宮頸癌，自問世以來，許多潛在病變得以被發現，極大地降低了宮頸癌的發病率和病死率[2]。然而，巴氏涂片法存在著較多缺陷，如刮板取材不全、涂片不均勻、細胞堆疊等因素使結果存在誤差，最終導致其假陰性率高，存在著較高的漏診率[3]。

1.2 薄層液基細胞學檢查（thin-prep cytology test，TCT）

近年來，巴氏涂片法逐漸被TCT所取代。TCT使標本采集流程更完善，減少了干擾因素，診斷宮頸病變更加準確，其制片滿意率和陽性檢出率均明顯優于巴氏涂片法[4]。但是，在宮頸病變早期，異常的宮頸鱗狀上皮細胞尚未表現出明顯的形態學變化，可能出現假陰性，這使此項技術存在著一定的誤診率或漏診率。

1.3 HPV檢測法

1.3.1 第二代雜交捕獲法（hybrid captureⅡ，HC2）DNA 檢測 HC2是現今應用最廣泛的一種方法，它以核酸雜交技術為基礎，與傳統的HPV檢查相比具有更高的敏感性。對高級別鱗狀上皮內病 變（high grade squamous intraepithelial lesion，HSIL）的靈敏度（90%）與特異度（88%）均較高[5]。該方法可檢測出13種HR-HPV，但不能區分具體的基因型，僅能對HPV的陽性和陰性進行判定，因此適用于大量人群的篩查[6]。

1.3.2 Cervista HPV檢測 Cervista HPV檢測分為Cervista HR-HPV檢測和Cervista HPV 16/18型檢測，Cervista HR-HPV檢測可以檢出14種HRHPV，對HSIL的靈敏度較高[7]。Cervista HPV 16/18型檢測只能區分HPV 16/18亞型，在高危人群的篩查中有較高價值，可作為一種隨訪手段，在年齡大于30歲的女性患者中，對細胞學檢查正常但HR-HPV檢測結果為陽性的患者進行分流[8]。

1.3.3 Cobas4800系統法 該法以聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術為基礎，可檢測出12種HR-HPV和HPV 16/18亞型，可進行具體分型，對于HSIL的特異度和靈敏度均很高[9]。

1.3.4 Aptima HPV檢測法 Aptima HPV檢測法是一種mRNA檢測技術，能檢測出14種不同的HR-HPV，但不能夠具體分型。與HPV DNA檢測技術相比，Aptima HPV檢測法在保證靈敏度的基礎上，具備更高的特異度[10-11]。與TCT相比，16/18/45分型檢測對≥HSIL的風險預測能力更佳[12]。

目前，HR-HPV DNA+TCT在中國廣泛應用于宮頸癌篩查，此項技術對宮頸早期病變的靈敏度較高，但特異度較低。

2 HPV 的生物學特性

HPV是一種由蛋白質外殼所包裹的雙鏈環形DNA病毒。多數HPV感染機體后能被免疫系統清除，但也有少數HPV感染會轉變為持續性。根據其對人體危害性分為高危型和低危型。其中，低危型HPV感染可無癥狀或引起尋常疣、尖銳濕疣等疾病，極少引起宮頸病變；而HR-HPV的持續感染則與宮頸鱗狀上皮內病變的發生高度相關，若未及時發現病變并給予治療措施，甚至有進展為宮頸癌的可能[13]。

HPV的致癌特性來源于致癌蛋白E6和E7。這兩種病毒致癌蛋白的持續表達是宮頸上皮細胞表型轉化的必要條件[14]，它們促進細胞分化并誘發腫瘤[15]。因此，要預測宮頸早期病變的后續進展或監測宮頸癌根治術后的復發，可監測宮頸脫落細胞中E6/E7蛋白的表達水平。

3 HPVE6/E7mRNA致病機制

幾乎所有的宮頸癌或癌前病變患者都可檢測出HPV感染。HPV E6/E7蛋白可影響正常細胞基因的表達。當E6/E7 mRNA所編碼的蛋白質在細胞中持續存在時，可造成正常細胞的病理改變，引發不典型增生，導致不良預后。

E6蛋白是一種由160個氨基酸所組成的小分子蛋白質，主要通過泛素通路下調抑癌基因p53的表達。當機體存在持續性HR-HPV感染時，E6蛋白過表達，與細胞內的E6相關蛋白（E6-associated protein，E6AP）結合形成復合物，隨之與p53基因結合并快速將其泛素化，使其過度降解。而p53基因在細胞凋亡與細胞老化的過程中發揮了重要作用，它的缺失使細胞在DNA受損后不能終止細胞周期，細胞基因組突變累積，最終導致惡性進展[16-18]。有學者發現，僅HR-HPV E6蛋白能夠降解p53基因，低危型HPV E6蛋白對其親和力較低[19]。

E7是一種酸性磷蛋白，能作用于細胞pRb蛋白而使細胞周期失控。轉錄因子E2F可調節細胞周期和DNA合成，在正常機體中，若DNA發生損傷，pRb基因即與E2F因子結合，使細胞周期停滯。當E7蛋白過表達時，可通過抑制pRb與E2F轉錄因子結合，降低pRb活性，使細胞不受控制地進入細胞周期，最終發生癌變[20]。

4 HPVE6/E7mRNA 在宮頸病變中的預測作用

HPV感染宮頸細胞后，會分化為游離型和整合型。一般來說，低危型HPV感染機體后，所導致的良性病變組織中以游離型HPV居多；而在HSIL患者的病變組織中則可見大量整合型HPV。在患者的HPV DNA檢測陽性的情況下，若僅發現宮頸上皮細胞內存在游離型HPV并不能說明宮頸存在病變，但E6/E7 mRNA檢測陽性表明HPV已將自身基因整合至宿主細胞中，開始了轉錄和翻譯，是宮頸發生早期病變的特異性標志物[21-22]。

當宮頸組織細胞開始發生不典型增生時，通過篩查即可發現早期的病變。單獨應用TCT檢測宮頸病變的靈敏度較低[23]，而HPV-DNA檢測的特異度較低，單獨診斷的準確度都不高[24]。而編碼HPV E6/E7蛋白的mRNA提供了病毒的遺傳信息，其檢測有助于評估宮頸早期病變的嚴重程度。近年來，宮頸癌篩查的重點已由確定是否存在HRHPV感染轉變為確定宮頸上皮細胞是否存在HPV E6/E7 mRNA的轉錄或E6/E7蛋白的表達。有學者發現，在低級別鱗狀上皮內病變（low grade squamous intraepithelial lesion，LSIL）階段即有 HPV E6/E7 mRNA表達，但其表達水平低于HSIL和宮頸癌[25]。

目前許多研究指出，HPV E6/E7 mRNA檢測可以綜合評估宮頸病變和浸潤性宮頸癌發生進展的危險性，可以達到早期預防宮頸癌的目的。Coquillard等[26]研究發現，檢測宮頸鱗狀上皮細胞內是否存在HPV感染時，E6/E7 mRNA定量檢測的靈敏度與HPV-DNA檢測相近，但特異度更高。張莉[27]研究了148例疑似宮頸病變患者，發現HPV E6/E7 mRNA檢測單獨應用時的靈敏度（83.78%）、特異度（82.43%）、準確度（83.11%）、陽性預測值（82.67%）與陰性預測值（83.56%）均較高。劉佳佳等[28]研究了74例宮頸病變患者，發現HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV DNA檢測對HSIL的靈敏度相當，但前者的特異度更高。此外，HPV E6/E7 mRNA檢測對TCT結果為意義未明的不典型鱗狀細胞（atypicai squamous cell of unknown significance，ASC-US）患者具有較高的特異度（91.7%），可作為ASC-US患者分流管理的有效措施。朱遠航等[29]研究了112例ASC-US患者，同時行HPV DNA和HPV E6/E7 mRNA檢測，發現HPV E6/E7 mRNA檢測在受檢患者中對發展為HSIL的靈敏度（94.44%）與HPV DNA檢測相比無明顯差異，而特異度（45.74%）明顯高于HPV DNA檢測（18.89%）。Johansson等[30]隨訪了211例年齡大于35歲的ASC-US患者，發現HPV E6/E7 mRNA檢測結果為陽性的患者，未來4～5年內宮頸病變進展為HSIL的風險高于陰性患者。

HPV E6/E7 mRNA檢測與其他方法聯合應用時，可有效預測癌前病變的轉歸。楊艷[31]發現HPV E6/E7 mRNA檢測結合TCT可以綜合評估HSIL和浸潤性宮頸癌發生進展的危險性。王俊飛等[32]研究了538例可疑宮頸病變的患者，同時行TCT和HPV E6/E7 mRNA檢測，發現二者聯合應用靈敏度和特異度分別為99.68%和39.29%，大幅度提高了靈敏度，有效降低了漏診率。此外，HPV E6/E7 mRNA檢測在與HC2-HPV DNA聯合應用時，診斷宮頸病變的靈敏度為99.3%，特異度為56.7%，且對HSIL的診斷價值高于LSIL[33]。

5 HPVE6/E7mRNA在HSIL和宮頸癌患者術后隨訪中的應用

潛在的宮頸病變不斷發展將大大提高宮頸癌的發病率。過去預防宮頸癌發生的有效方法是防止宮頸進一步病變，對于LSIL可采用藥物保守治療并定期隨訪；LSIL保守治療無效、HSIL及宮頸癌患者以手術切除病變組織作為主要治療手段。然而，手術后患者仍有病變組織殘留或再次復發的可能，因此對術后患者進行隨訪非常重要。目前以TCT、HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA等為主要檢測方法。HPV E6/E7 mRNA檢測正越來越廣泛地被應用于HSIL患者術后的隨訪。

桂定清等[34]發現在檢測宮頸錐切患者殘留病變或診斷其是否存在術后復發時，HPV E6/E7 mRNA檢測與HPV DNA檢測的靈敏度相當，但前者具有更高的特異度，可作為HSIL患者宮頸錐切術后評估其預后的有效方法。方戀等[35]研究了120例宮頸癌術后患者，發現在有病變組織殘留或術后復發的21例患者中，20例患者的HPV E6/E7 mRNA為陽性，其靈敏度為95.23%，特異度、陽性預測值均為100%。Persson等[36]研究了133例宮頸癌根治術后患者得出結論，HPV E6/E7 mRNA檢測對于預測宮頸癌根治術后殘留病灶/復發的特異度高（93.4%）而靈敏度低（57.1%）。Zappacosta等[37]指出，在錐切術后患者的隨訪中，HPV E6/E7 mRNA定量檢測較TCT與HPV DNA聯合檢查的特異度和陽性預測值高。

6 小結與展望

HPV E6/E7基因作為與宮頸癌相關的重要因素，已成為醫務人員研究的熱點方向。作為宮頸癌早期篩查的可靠手段，其診斷的準確度高，對于無HPV感染和宮頸病變的患者，避免了不必要的陰道鏡檢查，簡化了診療流程，減輕了患者的負擔，具有巨大的發展空間。盡管HPV E6/E7 mRNA檢測技術相較于其他檢測方法有著巨大的優勢，但也不能否認其他檢測方法在診斷宮頸癌早期病變與發展中發揮的作用。無論是哪一種檢測方法，單獨檢測都無法達到最佳的篩查效果[38]。恰當選取多種方法聯合應用，可提升其特異度與靈敏度，對宮頸癌的臨床防治和降低宮頸癌病死率具有重要意義。