外泌體在炎性腸病診斷及治療中的作用

范春嬌，黃貴華，高松林，林星陽，黃木圣，邱華

(1.廣西中醫藥大學研究生院，南寧 530001; 2.廣西中醫藥大學第一附屬醫院脾胃肝病科，南寧 530023)

炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是一種以直腸出血、腹部不適、體重減輕為主要癥狀的慢性自身免疫性疾病，以間歇性復發和靜止性炎癥緩解為特征，其中最常見的是潰瘍性結腸炎和克羅恩病。目前IBD的發病機制尚不清楚，較為公認的是遺傳因素、環境因素、腸道微生物、免疫因素相互作用導致免疫系統功能障礙和腸道黏膜損傷，損傷腸黏膜處的微環境發生變化，包括營養物質吸收障礙、局部組織氧供需失衡以及大量活性氮和氧中間體產生，由此產生氧化應激、內質網應激和缺氧應激反應信號等，從而影響腸黏膜屏障的完整性、腸道細胞存活及免疫調節[1]。在IBD的腸道微環境中，免疫細胞和非免疫細胞之間通過分泌的細胞因子進行動態復雜的相互作用，這些細胞因子參與IBD相關炎癥級聯反應的持續和放大[2]。炎癥細胞(如中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞)和適應性免疫細胞(T細胞和B細胞)被招募以響應活躍炎癥部位產生的趨化因子信號,如白細胞介素(interleukin,IL)8、白三烯B4、血小板激活因子、補體因子C5a等[3]。目前，IBD的治療側重于抗炎及腸道黏膜修復，藥物主要有5-氨基水楊酸、類固醇、抗菌藥物、免疫調節劑和單克隆抗體，但這些藥物也存在局限性，隨著治療時間的延長，部分患者無反應。因此，迫切需要尋找新的、有效的、安全的IBD治療方案。研究發現，外泌體通過免疫調節作用在IBD的發生發展及治療中扮演重要角色[4]。現就近年來外泌體蛋白、RNA和脂質對IBD免疫細胞和腸黏膜屏障等的調節作用和外泌體在IBD中作為診斷標志物的潛在價值及不同來源外泌體在IBD發病機制及免疫調節中的作用進行綜述，以為探尋IBD新的診療方案提供依據。

1 外泌體的來源及功能

外泌體是由不同類型的細胞以胞吐形式釋放的大小為30～150 nm的雙層脂質膜囊泡，最初人們認為外泌體是人體內的一種“垃圾”，但近年的研究發現，外泌體通過細胞間傳送的方式清除體內垃圾以及維持細胞間內環境穩定[5]。外泌體內包含多種生物學分子(脂質、蛋白質、核酸、信號轉錄因子、炎癥因子、熱激蛋白等)，且表面攜帶有特殊功能的蛋白(黏附分子、共刺激分子、配體、受體等)，外泌體通過內吞、吞噬、膜融合等機制將以上多種生物學分子從親本細胞傳遞到受體細胞，以促進或抑制細胞基因表達，調控信號轉導，從而影響細胞功能，發揮免疫抑制或免疫激活的作用[6]。外泌體存在于多種活細胞中，尤其是樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)、淋巴細胞、上皮細胞、內皮細胞，另外在血液、尿液、唾液、羊水以及母乳等體液中也可檢測和獲得外泌體[7]。研究發現，外泌體參與內分泌系統疾病[8]、心血管系統疾病[9]、生殖系統疾病[10]以及腫瘤[11]等的發病，并在疾病診斷以及作為藥物載體方面發揮重要作用[12]。

2 外泌體在IBD發病機制中的作用

免疫失衡及過度的炎癥反應是IBD重要的病理變化，目前研究表明，外泌體能夠誘導免疫反應，導致免疫失衡，進而破壞腸黏膜上皮；同時外泌體還能啟動炎癥反應，致使腸道中炎癥因子水平發生變化，進而加重腸黏膜炎性損傷[13-17]。

2.1參與炎癥反應 外泌體中的炎癥介質通過觸發免疫細胞間的免疫反應加重腸道炎癥反應。外泌體可啟動炎癥反應和細胞間通訊。腸黏膜促炎和抗炎作用失衡是IBD發生的主要原因，外泌體作為炎癥介質參與腸黏膜炎癥反應。Li等[13]研究發現，肥大細胞來源的外泌體微RNA(microRNA，miRNA/miR)-223通過介導封閉蛋白8的表達，減少miR-223相關蛋白的表達，破壞腸黏膜屏障，導致腸上皮通透性增加，從而參與IBD的發生發展。也有研究發現，肥大細胞分泌的外泌體能夠誘導DCs成熟，促進腸道炎癥反應[14]。在動物實驗中，從葡聚糖硫酸鈉鹽(dextran sulfate sodium salt，DSS)誘導的IBD大鼠相關的黏附侵襲性大腸埃希菌感染的腸上皮細胞和巨噬細胞中分離出的外泌體，可通過激活核因子κB、胞外信號調節激酶、p38和c-Jun氨基端激酶激活幼稚巨噬細胞，并導致促炎細胞因子腫瘤壞死因子-α和IL-6分泌增加[15]。

2.2誘導免疫反應 外泌體具有強大的免疫激活和免疫抑制作用，它們通過調節免疫反應在免疫系統中發揮關鍵作用[16]。巨噬細胞和2型先天性淋巴細胞作為自然免疫的重要組成部分，在IBD的發病中起重要作用。Lu等[17]嘗試從巨噬細胞及2型先天性淋巴細胞的角度闡述IBD的發病機制，在DSS誘導的IBD小鼠中發現，來源于巨噬細胞的外泌體miR-21a-5p的表達增加，且miR-21a-5p的表達與腸細胞中上皮鈣黏素的表達呈負相關，同時也證實了2型先天性淋巴細胞的表面抑制受體殺傷細胞凝集素樣受體亞家族G成員1通過促進GATA結合蛋白3分泌參與IBD中2型先天性淋巴細胞的過度激活，提示miR-21a-5p可能以上皮鈣黏素為靶點破壞腸黏膜上皮，即異常極化的巨噬細胞通過上皮鈣黏素導致腸黏膜屏障破壞。外泌體為闡明IBD的發病機制和改善治療效果提供了新的理論依據。

3 外泌體對IBD的診斷作用

目前尚無診斷IBD的金標準，診斷主要依據臨床癥狀和胃鏡檢查，同時排除器質性病變。外泌體存在于大部分的體液中，且具有高度穩定性，在病理條件下外泌體含量和外泌體蛋白的表達發生變化，使其可能成為疾病診斷的標志物。Wong等[18]對IBD小鼠的血清外泌體進行蛋白質組學分析，結果共分析出56種蛋白質，其中大部分為急性期蛋白質和免疫球蛋白。血清外泌體對巨噬細胞具有明顯的激活作用，其對于IBD的診斷具有一定價值[19]。Zheng等[19]在17例IBD患者的唾液外泌體中檢測出2 000多種蛋白質，其蛋白含量已遠超過健康人水平，其中8個蛋白質與炎癥、蛋白酶體活性和免疫反應有關。基因本體論分析顯示，蛋白酶體α7型亞單位在IBD患者中的表達明顯高于健康對照組，提示蛋白酶體α7型亞單位有可能成為IBD的生物標志物，為IBD的診斷提供依據[19]。Sch?nauen等[20]研究發現，IBD患者血清中miR-155和miR-223高表達，而miRNA的表達水平與疾病活動性及糞便鈣蛋白、C反應蛋白水平等有關。由此推測，血清和糞便外泌體中miRNA有可能成為IBD診斷的潛在生物標志物。

4 不同來源外泌體對IBD的免疫調節作用

細胞來源的外泌體主要通過抑制腸道炎癥反應以及調節免疫反應，改善IBD的上皮屏障功能，緩解結腸炎腸道損傷。

4.1炎癥細胞來源外泌體 巨噬細胞是抵御疾病的第一道防線，其分泌的外泌體具有抗炎作用。巨噬細胞可分為M1型和M2型，其中M1型巨噬細胞分泌較高水平的促炎細胞因子(腫瘤壞死因子-α、IL-1α、IL-1β、IL-6等)，M2型巨噬細胞具有抗炎作用，并被輔助性T細胞(T helper cell，Th細胞)分泌的細胞因子(IL-4、IL-13和IL-33)所極化[21]。Yang等[22]從巨噬細胞的培養上清液中分離出M2型巨噬細胞(M2a、M2b和M2c型)外泌體，觀察其在IBD中的作用發現，M2型巨噬細胞外泌體可以減輕DSS誘導的結腸炎的嚴重程度，且M2b型巨噬細胞來源的外泌體較M2a和M2c型巨噬細胞來源的外泌體更有效，經M2b型巨噬細胞外泌體治療后，結腸炎小鼠脾臟中調節性T細胞(regulatory T cell，Treg細胞)的數量和IL-4水平均增加。此外，經M2b型巨噬細胞外泌體治療后，與結腸炎相關的細胞因子(IL-1β、IL-6、IL-17A)的表達受到顯著抑制[22]。M2b型巨噬細胞外泌體對DSS誘導的結腸炎有保護作用，其保護作用主要與CC趨化因子受體1/CC趨化因子受體8有關[22]。Cao等[23]通過使用雙靶向納米顆粒將miR-146b運送到腸巨噬細胞中，通過誘導M2型巨噬細胞極化，激活依賴IL-10的信號轉導及轉錄活化因子3通路，從而促進腸道黏膜修復。以上發現為IBD的治療提供了新的途徑。

4.2免疫細胞來源外泌體 T細胞是免疫反應的重要組成部分，DCs則是啟動初級免疫反應的抗原呈遞細胞中最有效、最專業的細胞，具有捕獲和呈遞抗原的功能[24]。DCs來源的外泌體(DCs exosomes,DCs-Exo)具有免疫刺激或抑制作用。經IL-10處理或轉染IL-10基因的DCs-Exo可通過刺激CD4+CD25+Treg細胞抑制三硝基苯磺酸誘導的大鼠結腸炎[25]。外泌體可以用作自身免疫性疾病干預治療的載體。髓源性抑制細胞是調節免疫反應的未成熟髓系細胞的異質性群體，其釋放的外泌體通過抑制Th1細胞增殖和促進Treg細胞增殖，降低DSS誘導的結腸炎的嚴重程度[26]。胱天蛋白酶(caspase)-12是一種促凋亡蛋白，在先天免疫應答過程中被激活，并參與IBD的發病[27]。Liao等[28]研究表明，Treg來源的外泌體(Treg exosomes,Treg-Exo)減輕了DSS誘導的IBD的嚴重程度，其可能是通過促進腸上皮屏障損傷的修復實現，具體是由miR-195a-3p直接靶向caspase-12，負調控caspase-12的表達；進一步研究發現，Treg-Exo miR-195a-3p通過靶向caspase-12促進體外培養的YAMC細胞增殖，抑制細胞凋亡。該研究結果提示，Treg-Exo將miR-195a-3p轉移到腸上皮細胞中，miR-195a-3p通過靶向caspase-12促進腸上皮屏障損傷的修復過程，減輕IBD的嚴重程度[28]。Treg-Exo的使用可能為IBD的治療提供新的途徑。

4.3干細胞來源外泌體 間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有誘導再生、維持一般組織動態平衡和定位于靶部位的能力，其分泌的外泌體具有實現自我更新和修復受損組織的作用[29]。MSCs通過分泌免疫調節因子調節先天免疫反應和獲得性免疫反應，控制IBD的炎癥反應[30]。研究發現，人臍帶MSCs釋放的外泌體(human umbilical cord MSCs exosomes,HucMSC-Exo)通過抑制巨噬細胞中IL-7的高表達減輕DSS誘導的IBD[31]。粒細胞髓系來源的抑制性細胞的功能性外泌體被稱為CD11b+Ly6G+Ly6Clow細胞，其具有粒細胞樣形態，是髓系來源的抑制細胞的主要群體[32]。CD11b+Ly6G+Ly6Clow細胞可通過抑制Th1細胞增殖和促進Treg細胞擴張減輕DSS誘導的結腸炎[33]。在Wang等[34]的研究中，HucMSC-Exo處理可恢復IBD結腸組織結構的完整性，降低促炎細胞因子(IL-1β、IL-6)的水平，而增加抗炎細胞因子(IL-10)的表達。HucMSC-Exo通過修復受損的大腸組織減輕IBD。HucMSC-Exo富含miR-326，在抗炎過程中，miR-326抑制神經前體細胞表達發育下調基因-8與底物蛋白cullin1結合，抑制炎癥反應過程中E1、E2、E3酶的表達，進而抑制核因子κB信號通路激活，達到緩解IBD的目的[34]。嗅外-MSCs(olfactory mucosa MSCs，OM-MSCs)可用于自體移植。OE-MSCs較骨髓MSCs具有更高的增殖能力和更強的抑制能力。Rui等[35]研究發現，嗅外-MSCs來源外泌體(OE-MSCs exosomes,OE-MSCs-Exo)通過調節T細胞反應，改善小鼠膠原誘導的關節炎的嚴重程度，具有較強的免疫調節作用。進一步研究發現，OE-MSCs-Exo通過抑制CD4+T細胞增殖，降低γ干擾素、IL-17的表達，增加轉化生長因子-β、IL-10的表達，發揮免疫抑制作用[35]。在實驗性結腸炎小鼠中，OE-MSCs-Exos治療明顯減輕了疾病的嚴重程度，治療后Th1/Th17亞群顯著減少，Treg細胞明顯增加[36]。

4.4腸上皮來源的外泌體 維持腸黏膜完整性和促進損傷腸上皮修復是預防腸道炎癥進展的重要方式。有研究表明，來自DCs的外泌體miR-146b通過激活核因子κB改善上皮屏障功能，緩解結腸炎腸道損傷[37]。研究顯示，在P物質刺激下結腸上皮細胞中miR-21的表達上調，然后被選擇性地分選到外泌體中，進而促進人結腸細胞和小鼠結腸隱窩細胞的增殖和遷移，從而促進結腸上皮細胞增殖[38]。

4.5寄生蟲來源外泌體 胃腸道寄生蟲通過免疫調節減輕IBD的炎癥，從而起到保護腸黏膜的作用[39]。用鉤蟲來源的外泌體處理潰瘍性結腸炎小鼠發現，參與潰瘍性結腸炎發病的炎癥因子(IL-6、IL-1β、γ干擾素和IL-17A)的表達受到顯著抑制，而抗炎細胞因子(如IL-10)的表達明顯升高，從而對潰瘍性結腸炎小鼠起到保護作用[39]。Eichenberger等[40]發現，日本血吸蟲和曼氏血吸蟲卵來源的外泌體對結腸炎小鼠具有免疫調節作用，此研究還發現，經日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原處理的DCs-Exo治療后，結腸炎小鼠體重增加，疾病活動指數明顯降低，且小鼠結腸長度增加。由此可知，寄生蟲對IBD具有一定免疫調節作用。

5 小 結

隨著研究的深入發現，外泌體與疾病的發病、診斷及治療等聯系緊密：在發病機制方面，外泌體通過炎癥反應和誘導免疫反應參與IBD的發生發展；在診斷方面，外泌體作為一種潛在的生物標志物，能夠在某種程度上反映病情；在免疫調節方面，外泌體以感染的方式成為免疫反應中強大的促炎和抗炎介質。不同來源的外泌體參與維持腸道的內穩態，包括改善上皮屏障功能、發揮Treg細胞抑制作用等。因此，外泌體途徑為IBD的治療提供了另一種選擇。但目前關于外泌體的知識主要來自體外實驗模型，外泌體通路在特定類型免疫細胞中的功能尚未被研究。此外，未來還需要探索外泌體在給藥后的藥動學或生物分布情況。相信隨著科技的不斷發展，在納米技術、基因組學等技術的輔助下，外泌體將被更好地應用于IBD的診斷和治療。