供體巨噬細(xì)胞在心臟移植中的研究進(jìn)展

陳遠(yuǎn)洋 王志維

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管外科，湖北 武漢 430000)

近期研究表明，中國(guó)年齡≥35歲的居民心力衰竭(心衰)患病率為1.3%，即大約有1 370萬(wàn)人患心衰。上一次中國(guó)全國(guó)性的心衰流行病學(xué)調(diào)查是2000年，當(dāng)時(shí)的調(diào)查結(jié)果[1]顯示，在35～74歲的人群中，慢性心衰的患病率為0.9%，男性和女性心衰患病率分別為0.7%和1.0%。自從1967年第一例心臟移植手術(shù)成功以來(lái)，心臟移植一直是心衰晚期患者的最佳治療方法。由于心臟移植的需求不斷增加，如何擴(kuò)大供體器官庫(kù)和增強(qiáng)免疫相容性已成為心臟移植亟需解決的問題[2]。

當(dāng)前對(duì)于移植后免疫抑制的策略是總體上抑制受體的全身免疫反應(yīng)，這會(huì)直接導(dǎo)致許多并發(fā)癥的發(fā)生。如何平衡同種異體移植保護(hù)及防止感染和惡性腫瘤的發(fā)生是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的問題[3]。之前的研究結(jié)果表明在臨床上需探索更好的替代方案，在減少排斥反應(yīng)的同時(shí)也能提高同種異體移植存活率。

最近研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞具有不同的發(fā)育起源，由不同的細(xì)胞類型組成。已有一些研究[4]調(diào)查了巨噬細(xì)胞在實(shí)體器官移植中的作用。巨噬細(xì)胞在誘導(dǎo)同種異體移植損傷和促進(jìn)同種異體移植存活中具有矛盾作用，這些相反的功能反映了單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的復(fù)雜和動(dòng)態(tài)變化。心臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞可最初分為組織常駐巨噬細(xì)胞和浸潤(rùn)單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞。在移植的情況下，巨噬細(xì)胞的分群極有討論的意義，因?yàn)榻M織常駐巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞分別來(lái)自供體和受體。現(xiàn)全面討論心臟組織常駐巨噬細(xì)胞的組成，分析討論組織常駐巨噬細(xì)胞的功能，并強(qiáng)調(diào)組織常駐巨噬細(xì)胞在同種異體移植排斥和耐受中已知和推測(cè)性的作用。

1 心臟移植后的巨噬細(xì)胞種群及其功能

心臟包含不同的巨噬細(xì)胞種群，其起源和功能不同。根據(jù)CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2，CCR2)的表達(dá)，來(lái)區(qū)分出心臟組織中的巨噬細(xì)胞。在正常條件下，成人心臟主要含有CCR2+MHCⅡ+巨噬細(xì)胞、CCR2-MHCⅡ+巨噬細(xì)胞以及CCR2-MHCⅡ-巨噬細(xì)胞[5]。單核細(xì)胞與心臟巨噬細(xì)胞的不同在于，其表面的CCR2高表達(dá)和MHCⅡ低表達(dá)，并且缺乏Mer受體酪氨酸激酶。CCR2-巨噬細(xì)胞來(lái)源于胚胎造血祖細(xì)胞，在胎兒發(fā)育過程中植入心臟，壽命長(zhǎng)，并且在整個(gè)過程中都與單核細(xì)胞輸入無(wú)關(guān)，通過局部擴(kuò)散來(lái)維持發(fā)展。CCR2-巨噬細(xì)胞可通過分泌白介素(interleukin，IL)-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β來(lái)促進(jìn)冠狀血管生成，心肌細(xì)胞增殖，并且CCR2-巨噬細(xì)胞能抑制中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞募集[6]。CCR2+巨噬細(xì)胞來(lái)自循環(huán)單核細(xì)胞，定位于心臟，并通過逐漸募集單核細(xì)胞和局部增殖而得以維持。CCR2+巨噬細(xì)胞可促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞募集。消除CCR2+巨噬細(xì)胞可減少心肌梗死后的梗死面積和不良的心臟重構(gòu)。

移植的心臟包含由供體來(lái)源的CCR2+和CCR2-巨噬細(xì)胞以及受體來(lái)源的嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞。經(jīng)典的受體單核細(xì)胞來(lái)自血液中游離的單核細(xì)胞，并分化為巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，將促進(jìn)免疫排斥反應(yīng)。在鼠模型中，可使用細(xì)胞追蹤技術(shù)、同基因(CD45.1/CD45.2)或分子標(biāo)志技術(shù)，將供體與受體細(xì)胞分開。通過分析性別或等位基因HLA表達(dá)，也有可能在人類中區(qū)分供體和受體免疫細(xì)胞。例如，分析心內(nèi)膜活檢樣本(移植后平均8.8年，無(wú)主動(dòng)排斥反應(yīng)，同種異體移植功能正常)，在女性供體被移植到男性受體中，供體與受體的起源是基于“Y”染色體的存在或不存在[7]。結(jié)合原位雜交和免疫染色揭示了很小比例的CCR2-巨噬細(xì)胞(<2%)中存在Y染色體。相反，在30%的CCR2+巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到Y(jié)染色體，表明心臟CCR2+巨噬細(xì)胞代表了供體和受體衍生細(xì)胞的集合。關(guān)于供體和受體來(lái)源的CCR2+巨噬細(xì)胞在人類功能上是否有所不同所知甚少[8]。但小鼠研究表明，與供體來(lái)源的CCR2+巨噬細(xì)胞相比，受體來(lái)源的CCR2+巨噬細(xì)胞表達(dá)較高水平的炎癥趨化因子(CXCL11、CXCL2、CCL2、CCL7和CCL19)、細(xì)胞因子(IL-1β和IL-10)和不良的心臟重構(gòu)基因(AREG、EREG和GDF3)[9]。供體來(lái)源的CCR2+巨噬細(xì)胞則表達(dá)更高水平的干擾素反應(yīng)基因。總之，駐留在供體心臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞存在于移植物中的時(shí)間較長(zhǎng)，且供體巨噬細(xì)胞構(gòu)成及功能具有獨(dú)特性，可能有助于同種異體移植的存活及預(yù)后。

2 供體巨噬細(xì)胞在缺血再灌注損傷和原發(fā)性移植物功能障礙中的作用

器官移植過程中的一個(gè)關(guān)鍵目標(biāo)是最大程度地縮短缺血時(shí)間，缺血時(shí)間與心臟移植后的臨床結(jié)果緊密相關(guān)。缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)被認(rèn)為是原發(fā)性移植物功能障礙的主要誘因，是早期同種異體移植物功能喪失及死亡的主要原因。最近，器官共享聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)修改了心臟供體的分配系統(tǒng)，以促進(jìn)更廣泛的器官共享并增加對(duì)患病個(gè)體的分配[10]。盡管尚無(wú)全面數(shù)據(jù)，但由于供體和移植中心間的距離增加，會(huì)明顯延長(zhǎng)同種異體移植的缺血時(shí)間。

已有研究[11]觀察到心肌細(xì)胞死亡是由于受體大量中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)到供體心臟中。此外，IRI后駐留在供體心臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞群會(huì)調(diào)節(jié)移植物的炎癥發(fā)生和發(fā)展。移植后，供體心臟中駐留的CCR2+巨噬細(xì)胞的消耗減少，導(dǎo)致受體中性粒細(xì)胞外滲減少和單核細(xì)胞募集到心臟中[11]。在這種情況下，供體CCR2+巨噬細(xì)胞通過Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)9和髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)依賴性機(jī)制調(diào)控中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞趨化因子的生成來(lái)控制受體白細(xì)胞募集。相反，來(lái)自供體心臟的組織駐留CCR2-巨噬細(xì)胞的耗竭導(dǎo)致受體中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞募集顯著增加。這些研究結(jié)果顯示供體巨噬細(xì)胞在IRI后同種異體移植炎癥中的重要性，在移植前對(duì)供體巨噬細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可改善IRI相關(guān)的同種異體移植損傷，并降低原發(fā)性移植物功能障礙的發(fā)生率和嚴(yán)重程度[12]。

那么供體巨噬細(xì)胞是如何改善IRI及免疫排斥的呢？首先，從損傷或?yàn)l死的細(xì)胞中釋放損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)和警報(bào)蛋白被認(rèn)為是將IRI與免疫細(xì)胞活化聯(lián)系起來(lái)的信號(hào)。細(xì)胞壞死和鐵死亡是DAMP和警報(bào)蛋白釋放后引起細(xì)胞死亡的主要形式，雖然之前認(rèn)為壞死主要與同種異體移植免疫細(xì)胞的活化有關(guān)，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，IRI后繼發(fā)的心肌細(xì)胞和心肌成纖維細(xì)胞死亡的最初原因是鐵死亡。用ferrostatin-1(鐵死亡的特異性抑制劑)治療供體心臟可顯著減少初始心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞死亡，并抑制早期中性粒細(xì)胞移植物的浸潤(rùn)[13]。

由肥大性心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞釋放的DAMP/警告蛋白的確切作用仍未明確，但可能與TLR結(jié)合相關(guān)。供體內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4的缺失可防止嗜中性粒細(xì)胞黏附于靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，這是嗜中性粒細(xì)胞外滲的關(guān)鍵上游步驟。在供體巨噬細(xì)胞中消除TLR9和MyD88不會(huì)影響嗜中性粒細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的最初黏附，但會(huì)導(dǎo)致其跨內(nèi)皮遷移能力受損[14]。這些發(fā)現(xiàn)顯示了通過死于心肌細(xì)胞釋放的DAMP/警告蛋白，向多種供體駐留細(xì)胞類型(包括內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)發(fā)出信號(hào)，并引發(fā)同種異體移植炎癥的可能性。需進(jìn)一步的研究來(lái)揭示IRI誘導(dǎo)的同種異體移植炎癥和同種異體移植功能障礙的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。

3 供體巨噬細(xì)胞和同種異體排斥反應(yīng)及移植耐受性

考慮到巨噬細(xì)胞能長(zhǎng)久駐留在移植后的心臟中，因此供體巨噬細(xì)胞可能促進(jìn)同種異體移植排斥。越來(lái)越多的研究[15]表明，巨噬細(xì)胞在急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)(acute cellular rejection，ACR)和抗體介導(dǎo)的排斥反應(yīng)(antibody-mediated rejection，AMR)中均有重要作用。在ACR中，巨噬細(xì)胞通過細(xì)胞因子和活性氧的產(chǎn)生來(lái)促進(jìn)移植物損傷和心肌纖維化。CD16+單核細(xì)胞被認(rèn)為是促進(jìn)腫瘤壞死因子-α和IL-1β表達(dá)升高的強(qiáng)刺激因素。與浸潤(rùn)性單核細(xì)胞的升高一致，觀察到循環(huán)中的CD16+單核細(xì)胞中HLA-DR和CD54的表達(dá)增加，表明其活化狀態(tài)具有增加的遷徙潛力[16]。盡管認(rèn)識(shí)到在ACR期間巨噬細(xì)胞會(huì)積累在同種異體移植物中，但對(duì)巨噬細(xì)胞亞群及其起源尚未了解。AMR的標(biāo)志是嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在血管周圍和血管內(nèi)的蓄積，臨床診斷是根據(jù)血管內(nèi)CD68+單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的組織病理學(xué)來(lái)確定[17]。巨噬細(xì)胞在急性AMR中導(dǎo)致心臟同種異體移植的損傷，主要表現(xiàn)為促炎表型的血管內(nèi)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞促進(jìn)抗原加工/呈遞，細(xì)胞因子產(chǎn)生和組織重塑。

移植免疫學(xué)的金標(biāo)準(zhǔn)是移植接受度或耐受性。目前免疫耐受性主要針對(duì)T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)，因其在移植排斥中的重要作用，但亦有大量證據(jù)表明巨噬細(xì)胞亞群有助于免疫耐受。Braza等[18]的研究結(jié)果表明，移植物會(huì)大量浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞表達(dá)模式識(shí)別受體Dectin-1和TLR4(響應(yīng)DAMP)，當(dāng)敲除對(duì)應(yīng)蛋白的基因后，可降低受體炎性巨噬細(xì)胞的數(shù)量，并促進(jìn)移植耐受性。同時(shí)在該模型中，需通過抑制CD40(T細(xì)胞受體)的共同阻斷來(lái)誘導(dǎo)長(zhǎng)期耐受，這表明T細(xì)胞可能會(huì)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型。

有研究[19]表明，供體單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的敲除可增加移植物中Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)增加同種異體移植物的存活時(shí)間以及減少心肌或血管損傷。Braza等[18]使用高密度脂蛋白納米生物學(xué)靶向mTOR靶標(biāo)(mTOR-HDL)，能更選擇性地靶向髓樣細(xì)胞并抑制T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)免疫耐受性的Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞增殖，并能促進(jìn)產(chǎn)生耐受型巨噬細(xì)胞。從機(jī)制上講，mTOR缺陷的移植物浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞上調(diào)程序性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)，而PD-L1上調(diào)阻止了移植物的急性排斥。盡管這些發(fā)現(xiàn)確定了單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在建立同種異體移植耐受中的作用，但供體巨噬細(xì)胞的確切作用仍有待闡明。

4 供體巨噬細(xì)胞作為治療目標(biāo)

很少有研究表明減少巨噬細(xì)胞活化或抑制其效應(yīng)機(jī)制可減輕IRI和排斥反應(yīng)并提高同種異體移植的存活率。盡管在供體和受體來(lái)源的巨噬細(xì)胞的確切功能方面存在很大差異，但研究數(shù)據(jù)確實(shí)表明，操縱供體巨噬細(xì)胞亞群可證明是有效的。如果確實(shí)必須將供體亞群作為靶標(biāo)，那么CCR2+巨噬細(xì)胞將成為心臟移植的首選靶標(biāo)[20-21]。這些炎性細(xì)胞可被靶向短肽的納米顆粒、標(biāo)準(zhǔn)單克隆抗體(即MLN1202)或新型構(gòu)建體(如雙特異性或多特異性抗體)靶向治療，這些試劑可通過效應(yīng)T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞活化來(lái)促進(jìn)消除炎性細(xì)胞[22-23]。此外，它們還可用于抑制特定細(xì)胞類型(如供體CCR2+巨噬細(xì)胞)上的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。

開發(fā)在移植前直接用于供體器官的療法(在冷藏或常溫灌注過程中)具有巨大的研究前景。此類藥物可將與全身免疫抑制有關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)降至最低，包括威脅生命的感染和惡性腫瘤[24]。針對(duì)引發(fā)同種異體移植炎癥和排斥的浸潤(rùn)性單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的靶向應(yīng)用治療方法，可能比目前阻止下游炎癥機(jī)制的方法更具優(yōu)勢(shì)。

5 結(jié)論與展望

從IRI到同種異體移植排斥和耐受，巨噬細(xì)胞涉及移植的許多方面。在過去的幾年中，范式轉(zhuǎn)換研究提供了關(guān)于巨噬細(xì)胞多樣性和功能重要性的研究證據(jù)。如今正在探索供體巨噬細(xì)胞與受體單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生巨噬細(xì)胞之間的差異作用和相互作用。這些研究提出了在移植前靶向供體巨噬細(xì)胞可能是改善移植結(jié)果途徑的可能性。靶向供體巨噬細(xì)胞需全面了解供體和受體巨噬細(xì)胞在同種異體移植整個(gè)生命周期中的作用。在這一領(lǐng)域，認(rèn)識(shí)還存在很大局限，要解決的關(guān)鍵問題包括：不同的心臟巨噬細(xì)胞亞群在排斥和長(zhǎng)期同種異體移植耐受中的作用；介導(dǎo)心臟巨噬細(xì)胞激活和單核細(xì)胞分化的機(jī)制；供體和募集的單核巨噬細(xì)胞如何相互作用；免疫系統(tǒng)是否會(huì)影響移植結(jié)果。解決這些問題將為安全有效的免疫抑制帶來(lái)新的希望和目標(biāo)。