MRI影像組學術前預測較低級別膠質瘤IDH突變合并MGMT啟動子甲基化亞型的價值

沙永建，王效春，譚艷，張輝，楊國強*

較低級別膠質瘤（lower grade gliomas, LGGs）通常指世界衛生組織(World Health Organization,WHO)分級為2、3 級的膠質瘤。其中，約占全部膠質母細胞瘤8.8%～10%的繼發型是由LGGs 進展而來[1-3]。LGGs 的精準診斷、個體化治療和療效預后評估均與腫瘤分子分型密切相關[2]。LGGs 的異檸檬酸脫氫酶突 變（isocitrate dehydrogenase mutation, IDH mut）合并氧6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶啟動子甲基化（O6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter methylation, MGMT meth）亞型的患者，在異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase, IDH）、氧6-甲基鳥嘌呤DNA 甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase, MGMT）的所有分子亞型中具有更長的總生存期（overall survival, OS）和（或）無進展生存期（progression free surviva, PFS）[4-5]，并從替莫唑胺（temozolomide, TMZ）的治療中獲益[6]。因此，該分子分型的準確預測具有重要的臨床價值。

目前，膠質瘤IDH 和MGMT 分子標記物獲得需采用侵入性的、有創的病理活組織檢查或手術切除方式得以實現，而基于常規MRI 檢查的影像組學方法，相比前者，具有無創性、及時性和價格合理等優點[7-8]。MRI 檢查可以無創地獲取活體內深埋于組織或器官內部腫瘤的靜態結構、動態功能的多維度和多參數的圖像，利用計算機圖像處理和大數據挖掘的影像組學方法，發掘肉眼無法觀察到的紋理、小波等高維度影像特征，從而獲得深層次的映射腫瘤分子標記物的影像組學標記物[9-12]。

然而，應用影像組學的方法對腦膠質瘤分子生物標記物的研究多集中在IDH、MGMT 等單一分子上[13-14]。在多個腫瘤分子標記物結合作為聯合預測因子的研究中，也是根據2016 年WHO 中樞神經系統腫瘤的分子分型，集中在IDH 合并1p/19q 基因型的研究中[15-16]。目前，基于常規MRI 的影像組學方法在膠質瘤的IDH 合并MGMT 狀態的分子亞型的研究卻很少涉及。Zhang 等[17]使用自動機器學習的放射組學方法，對膠質瘤（WHO 2～4 級）IDH mut 和MGMT meth共同發生進行預測研究。這項研究的病例中，WHO 4 級膠質瘤占所有被納入研究的膠質瘤的51.8%，且該研究中作為對照組的亞型包含更廣。因此，該研究的影像組學模型的分類性能更側重于WHO 4 級的膠質瘤。而本研究的對象為LGGs，即WHO 2、3級膠質瘤，且定義的兩個分子亞型更具針對性。由于LGGs的IDH mut 合并MGMT meth 作為聯合的預測因子，預示著良好的OS 和（或）PFS，并能從TMZ 治療中獲益。因此，本研究探討使用基于MRI 的影像組學的方法，建立一個用于預測LGGs 的IDH mut 合并MGMT meth亞型的預測模型，從而為腦膠質瘤的精確診斷、TMZ的臨床決策及生存期預測提供重要的輔助價值。

1 材料與方法

1.1 對象和設備

本研究回顧性分析來自山西醫科大學第一醫院（The First Hospital of Shanxi Medical University,FHSXMU）、山西省人民醫院（Shanxi Provincial People'Hospital,SPPH），以及TCGA/TCIA（The Cancer Genome Atlas和The Cancer Imaging Archive）公共數據庫（TCGA 中包含了膠質瘤患者的臨床和基因信息，網址為：https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga，TCIA 中為與TCGA 對應的患者影像數據，網址為：https://www.cancerimagingarchive.net）的447 例 患 者 數據。FHSXMU和SPPH數據收集通過山西醫科大學倫理委員會批準，免除受試者知情同意，批準文號：2019LL101，收集日期為2011 年10 月至2020 年7 月。TCGA/TCIA 數據為公用數據庫資源，數據上傳和下載已獲得華盛頓大學醫學院倫理委員會批準，免除受試者知情同意，批準文號：201108194，TCGA/TCIA 數據收集日期為2011 年3 月至2019 年10 月。本研究的納入標準：（1）符合2021 新版WHO 中樞神經系統腫瘤分級為2、3 級的膠質瘤患者；（2）術前MRI 圖像包括對比增強后T1 加權序列（post-contrast enhanced T1-weighted, CE-T1）、T2 加權流體衰減反轉恢復序列（T2-weighted fluid attenuation inversion recovery, T2-FLAIR），并且序列完整、圖像清晰；（3）完整的IDH和MGMT 分子信息及臨床信息。最終，158 例患者符合納入標準，其中TCGA/TCIA 數據集86 例，FHSXMU和SPPH數據集72例。

FHSXMU數據采用8通道陣列線圈的3.0 T Scanner（Signa HDxt, GE Healthcare, USA）進行MRI 掃描，SPPH 數據采用8 通道陣列線圈的3.0 T Scanner（Discovery 750, GE Healthcare, USA）進行MRI 掃描。采集協議統一采用CE-T1 序列（TR/TE：195 ms/4.76 ms；FOV：240 mm×240 mm；層厚/層間距：5.0 mm/1.5 mm；矩陣：256×256）和T2-FLAIR 序列（TR/TE：8000 ms/95 ms；FOV：240 mm×240 mm；層厚/層間距：5.0 mm/1.5 mm；矩陣：256×256）。注射0.1 mmol/kg釓螯合對比劑（Omniscan,GE Healthcare,Ireland）后獲得CE-T1圖像。

由于TCGA/TCIA 數據庫的圖像來自不同的MRI設備和采集協議，并且與FHSXMU 數據和SPPH 數據的MRI 設備和采集協議亦存在差異，為使不同設備采集的圖像具有空間分辨率和灰度強度的可比性，我們對所有MRI 圖像進行重采樣，從而消除不同型號MRI設備造成空間分辨率不一致的干擾，并通過最大最小值的歸一化方法對圖像強度進行歸一化處理。此過程使用Python 3.10.4版（https://www.python.org/）的SimpleITK庫實現。

1.2 IDH mut狀態和MGMT meth狀態的檢測

對于TCGA/TCIA 數據集，從數據庫中下載獲得IDH mut 狀態和MGMT meth 狀態的數據。對于FHSXMU和SPPH 數據，IDH mut 狀態通過Sanger 測序確定，采用Simlex OUP?FFPE DNA 核酸提取試劑盒提取DNA，應用Chromas序列分析軟件判定IDH狀態。MGMT meth狀態通過焦磷酸測序進行評估，使用BisulFlash?DNA 修飾試劑盒（Epigentek, USA）對提取的DNA 進行修飾，獲得MGMT啟動子內10個CpG位點數據，平均甲基化≥8%，則認為腫瘤存在甲基化，未甲基化病例平均甲基化＜8%[18]。

1.3 腫瘤感興趣區勾畫

首先將T2-FLAIR 圖像通過FSL 軟件（http://fsl.fMRIb.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FSL）采 用 仿 射變換與相應的CE-T1 圖像進行配準。腫瘤感興趣區（region of interest, ROI）的勾畫利用ITK-SNAP軟件（http://www.itksnap.org）進行。由兩名年資在10 年以上的放射科主治醫生進行雙盲手動勾畫，重疊區作為腫瘤的感興趣區。并最終由一名年資超過20 年的放射科主任醫生審驗。在CE-T1 MRI 的圖像上勾畫出ROI，然后配準到T2-FLAIR圖像上（圖1）。

圖1 腫瘤感興趣區的勾畫。CE-T1：對比增強后T1 加權序列；FLAIR：流體衰減反轉恢復序列。Fig. 1 Delineation of tumor regions of interest. CE-T1: post-contrast enhanced T1-weighted; FLAIR: fluid attenuation inversion recovery.

1.4 影像組學特征提取

從CE-T1 和T2-FLAIR 圖像中提取腫瘤ROI 的1702 個影像組學特征，每個MRI 序列提取851 個特征，包括：18個一階直方圖特征，14個形狀特征，75個紋理特征[包括24 個灰度共生矩陣（gray level co-occurence matrix, GLCM）特征，14個灰度依賴矩陣（gray level dependence matrix, GLDM）特征，16個灰度運行長度矩陣（gray level run length matrix,GLRLM）特征，16 個灰度大小區域矩陣（gray level size zone matrix, GLSZM）特征，5個鄰域灰度依賴矩陣（neighbouring gray tone difference matrix,NGTDM）特征]，以及通過小波濾波后MRI圖像的一階特征和紋理特征得到的744 個小波特征。影像組學特征提取采用開源軟件FAE（http://github.com/salan668/FAE)實現，該軟件基于PyRadiomics 軟件包（https://github.com/Radiomics/pyradiomics）。

1.5 統計學分析

根據IDH mut 狀態下MGMT 啟動子的是否發生甲基 化，將LGGs 分 為IDH mut 合 并MGMT meth 亞 型、IDH mut合并氧6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶啟動子非甲基化（O6-methylguanine-DNA methyltransferase promoter unmethylation, MGMT unmeth）亞型（該亞型簡寫為：IDH mut合并MGMT unmeth亞型）。由于兩種分子亞型的構成比明顯不均衡，為提高模型泛用性，將FHSXMU數據、SPPH數據和TCGA/TCIA數據進行整合，然后以7∶3比例隨機分為訓練集和測試集。統計分析采用R 軟件4.1.2 版本（www.R-project.org）和SPSS軟件23.0版本（https://www.ibm.com/analytics/spss-statistics-software）實現。

1.5.1 臨床資料和分子信息的統計描述

由于本研究兩個分子亞型數據構成比差異明顯，進行組間比較時，使用皮爾遜卡方檢驗或Fisher's確切檢驗。連續變量使用中位數和四分位數間距表示，組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗，雙側P＜0.05表示差異具有統計學意義。

1.5.2 影像組學特征篩選和模型構建驗證

首先，使用Z-score變換對訓練集的影像組學特征進行標準化，單因素邏輯回歸（logistic regression,LR）進行特征初篩，P＜0.05 表示特征具有統計學意義。然后使用最小絕對收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and selection operator,LASSO）回歸進一步進行特征選擇，通過10-fold交叉驗證選擇最佳參數λ，在其值最小時選擇系數非零的影像組學特征。由于數據集的構成比差異明顯，為提高訓練模型的準確性，使用合成少數過采樣技術（synthetic minority over-sampling technique,SMOTE）方法對訓練集少數類樣本進行平衡化，再采用多因素LR進行建模。通過訓練集和測試集的受試者工作特征（receiver operating characteristic curve,ROC）曲線以及校準曲線，對模型性能和擬合優度進行檢驗。繪制列線圖進行可視化風險預測。

2 結果

FHSXMU 數據、SPPH 數據和TCGA/TCIA 數據合并后數據集的兩個分子亞型在訓練集和測試集的臨床特征統計描述如表1 所示。兩種分子亞型在訓練集和測試集的年齡、性別和腫瘤分級的P值均大于0.05，說明兩種分子亞型在訓練集和測試集的不同臨床特征的組間比較差異均無統計學意義。

表1 FHSXMU、SPPH、TCGA/TCIA合并數據集的不同分子亞型在訓練集和測試集一般資料的比較Tab.1 Comparison of general data of the different subtypes of the combined data set including FHSXMU,SPPH and TCGA/TCIA data sets in training set and test set

訓練集經過單因素LR，僅CE-T1序列保留了21個放射組特征，T2-FLAIR序列為0。為了選擇最佳的影像組學特征和解決過擬合問題，采用LASSO算法。最終，在λ值最小時，有7個系數不為零的特征被保留（圖2）。經SMOTE 數據平衡（陽性和陰性樣本例數為99∶99），使用多因素LR建立影像組學模型（圖3）。

圖2 LASSO（最小絕對收縮和選擇算法）的特征選擇。Fig. 2 Features selection of LASSO (least absolute shrinkage and selection operator).

圖3 森林圖顯示了影像組學模型的所有特征，以及每個影像組學特征的優勢比（OR）值及其95%置信區間（95%CI）、P值。Fig. 3 The forestplot shows the features of the radiomics model, the OR of each feature and its 95%CI,P value.

影像組學模型在訓練集和測試集的曲線下面積（area under the curve, AUC）值分別為0.842 和0.935（圖4）。在訓練集的準確率為93.6%、精確率為94.2%、召回率為98.9%、F-Measure 為0.965；在測試集的準確率為89.6%、精確率為93.1%、召回率為95.3%、F-Measure為0.942（表2）。

表2 影像組學模型在訓練集和測試集的評價結果Tab.2 Evaluation results of the radiomics model in the training set and the test set

圖4 訓練集和測試集的受試者工作特征（ROC）曲線。Fig. 4 The receiver operating characteristic curve of the training set and the test set.

訓練集的校準曲線顯示了影像組學模型和實際結果有著較好的一致性，經Hosmer-Lemeshow 檢驗的P值為0.1393（圖5），測試集因為數據過少、且構成比的差異顯著，R 語言的glm 和lrm 函數無法擬合模型，因此無法生成校準曲線。根據模型計算的影像組學評分（radiomics score, Radscore），我們還繪制了列線圖用于風險預測（圖6）。

圖5 訓練集的校準曲線。Fig.5 The calibration curve of the training set.

圖6 影像組學模型計算的影像組學評分的列線圖。Fig.6 The nomogram of radiomcs score calculated by the radiomics model.

3 討論

本研究探討使用基于常規MRI 的無創影像組學方法，建立一個用于預測LGGs 的IDH mut 合并MGMT meth 亞型的影像組學模型，結果顯示模型具有良好的預測性能（訓練集和測試集的AUC 分別為0.842 和0.935）。本研究在LGGs 層面，使用基于常規MRI 的影像組學方法，預測IDH mut 合并MGMT meth 分子亞型為國內外首次被提出。由于LGGs 的IDH mut 合并MGMT meth作為聯合的預測因子，預示著良好的OS和（或）PFS，并能從TMZ治療中獲益。因此，該亞型的準確預測，為LGGs 患者分子分型的精確診斷、TMZ 的臨床決策及生存期預測提供重要的臨床輔助價值。

3.1 與本研究相關的單一腫瘤分子標記物的研究

使用影像組學的方法對膠質瘤IDH 是否發生突變已經進行了廣泛的研究，Wang等[19]通過基于MRI動態增強掃描序列和擴散加權序列，探討了使用影像組學的方法對膠質瘤IDH 狀態的改善價值（AUC 在訓練集和測試集分別為0.939和0.880）。Manikis等[20]也探討了基于動態磁化率對比MRI 的影像組學方法對IDH 狀態的增益價值（AUC 在訓練集和獨立的驗證集的分別為0.678 和0.667）。本研究在LGGs 的IDH mut 的基礎上，結合MGMT 啟動子是否發生甲基化，將其進行分層，并獲得良好的效果（AUC 在訓練集和測試集分別為0.842 和0.935）。而膠質瘤IDH mut 狀態下，MGMT meth 較MGMT unmeth 有著更長的中位OS，且可以從TMZ 的治療中獲益[5]。對于使用影像組學在膠質瘤MGMT meth 研究中，Lohmann 等[21]通過基于正電子發射斷層顯像（PET）/MRI 的影像組學方法，預測了腦膠質瘤MGMT meth 狀態（最高的準確度為83%，而本研究為93.6%）。Huang 等[22]通過一篇Meta分析證明了影像組學在研究膠質瘤MGMT meth 的價值，并計算了多個模型的綜合AUC 值（訓練集和獨立的驗證集分別為0.91 和0.88）。而僅具有MGMT meth 的單一分子標記物的膠質瘤，只能表明它可以從TMZ 的治療中獲益。本研究中，LGGs 的IDH mut 合并MGMT meth 亞型同時具有更好的生存期，以及從TMZ治療獲益的優點。

3.2 與本研究相關的多個腫瘤分子標記物結合的研究比較

在膠質瘤多個分子生物標記物結合的影像組學研究中，Arita 等[23]運用影像組學的方法，構建LGGs包含IDH 合并TERT 基因共同突變亞型的3 種亞型的預測模型，并檢驗其性能。Fan 等[24]使用影像組學的方法，構建了WHO 2 級膠質瘤IDH mut 下是否發生1p/19q 共丟失的預測模型。以上研究證實了使用影像組學的方法在IDH mut 狀態合并其他腫瘤分子標記物的可行性。Zhang 等[17]使用自動機器學習的放射組學方法，對膠質瘤IDH mut 和MGMT meth 共同發生進行預測研究（多個模型的平均AUC=0.951）。與本研究相比，該研究包含了WHO 2～4 的三個級別的膠質瘤，適用范圍更廣。然而，該研究中，作為對照組的其他亞型包含了IDH mut 合并MGMT unmeth 亞型、IDH 野生型合并MGMT meth 和IDH 野生型合并MGMT unmeth 三種亞型，且IDH mut 合并MGMT unmeth 亞型僅為一例，同時，WHO 4 級的膠質瘤占全部膠質瘤的51.8%。而本研究著重于WHO 2、3 級的膠質瘤，并以IDH mut合并MGMT unmeth亞型作為對照組，同時，為解決兩個亞型的構成比不均衡問題，我們使用了SMOTE 算法進行數據平衡化，最終的影像組學模型亦具備良好的預測性能。

3.3 兩個亞型構成比不均衡的解決方法

為解決數據構成比問題，我們引入了SMOTE算法進行數據平衡化，其優點是：相較于過采樣對于原始數據隨機抽取而言，該算法是通過少數樣本中任意單個樣本與其臨近的k個樣本（通常默認為5）進行插值，從而提高分類器泛化能力，同時，與只對多數類進行欠采樣相比，該方法可以實現更好的分類器性能[25-26]。當然，SMOTE 也有缺點，如由于k 近鄰的選擇而產生的噪聲和樣本復制問題[27]。然而，樣本信息能否真實地反映總體，是模型好壞的關鍵。SMOTE 算法在一定程度上解決了樣本均衡問題，這也體現在本研究中的影像組學模型具有較好的性能。

3.4 本研究的局限性

本研究存在以下局限性：（1）由于對照組（即IDH-mut 合并MGMT unmeth 亞型）樣本數量過少導致的構成比不均衡，盡管通過SMOTE算法得以數據平衡化，但畢竟不是真實樣本的反映；（2）缺乏獨立的外部驗證集；（3）由于構成比的顯著差異，導致臨床變量統計學不顯著，未能實現影像組學-臨床結合模型的建立。因此，本研究還需要獲得更多的少數類樣本，在保證少數類樣本足夠豐度的前提下，進一步實現影像組學模型對真實總體的反映。同時，使用獨立外部驗證集進行檢驗可以進一步驗證影像組學模型的普遍適用性。最后，足夠的少數類樣本的獲得也可能使臨床變量具統計學有意義，使影像組學-臨床結合模型的實現成為可能，從而進一步提高模型的性能。

綜上所述，本研究是通過基于術前MRI的影像組學方法，構建了一個用于預測LGGs 的IDH mut 合并MGMT meth 亞型的影像組學模型。結果表明該模型具有良好預測性能，從而為LGGs 患者的分子亞型的精確診斷、化療藥物TMZ 使用的決策、患者OS 和（或）PFS的評估提供重要的臨床輔助價值。

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無利益沖突。