異常凝血酶原在肝細胞肝癌診斷中的臨床價值

柯建飛 項國謙

肝細胞肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是指由肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞發(fā)生的癌腫，死亡率高[1]。肝細胞肝癌的病因和發(fā)病機理尚未明確，起病隱匿，病情發(fā)展迅速，早期手術切除是最有效的治療方法[1-2]。異常凝血酶原（protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ）是指由于維生素K 缺乏或者由于服用維生素K 拮抗劑而產(chǎn)生的異常蛋白質(zhì)。PIVKA-Ⅱ是凝血Ⅱ因子（凝血酶原）的PIVKA體，因此也被稱為異常凝血酶原。PIVKA-Ⅱ可出現(xiàn)在維生素K 缺乏或肝細胞肝癌患者的血清中，是診斷肝細胞肝癌的另一個重要指標，可與血清甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）互為補充。正常個體中無PIVKA-Ⅱ，但在肝病和肝細胞肝癌患者中即便未出現(xiàn)維生素K 缺乏，也可能存在PIVKA-Ⅱ。近年來，多數(shù)學者主張采取PIVKA-Ⅱ聯(lián)合AFP 檢測的方式診斷早期肝細胞肝癌[3-6]，大大提高了早期肝細胞肝癌的檢出率。本文探討PIVKA-Ⅱ在肝細胞肝癌中的診斷價值，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2020 年11 月至2021 年3 月在浙江大學醫(yī)學院附屬杭州市第一人民醫(yī)院確診的肝細胞肝癌患者45 例，肝硬化患者36 例。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》的相關要求。肝細胞肝癌病例診斷符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019 年版）》診斷標準，肝硬化病例診斷符合2010 年中華醫(yī)學會肝病學分會、感染分會制訂的《病毒性肝炎防治指南》中關于病毒性肝炎的診斷標準。所有病例均無維生素K 缺乏、無自身免疫性疾病及血液系統(tǒng)疾病，均未服用維生素K 及維生素K 拮抗劑類藥物。同時選取同時期健康體檢者40 例作為對照組。本研究通過醫(yī)院倫理審查，倫理編號：ZN-20220401-0056-01。

1.2 儀器與試劑 PIVKA-Ⅱ采用美國雅培公司提供的ARCHITECT i2000 全自動免疫分析儀及配套異常凝血酶原測定試劑盒進行檢測（試劑批號：26891LP30）。AFP 采用美國雅培公司提供的ARCHITECT i4000SR 全自動免疫分析儀及配套試劑盒進行檢測（試劑批號：29510FN00）。

1.3 樣本采集 按照要求，靜脈穿刺采取三組研究對象促凝血5 mL。靜置10 min，3000 r/min 離心10 min，觀察血清無溶血。將澄清樣本轉(zhuǎn)移至樣品杯或新試管中，以備檢測。

1.4 PIVKA-Ⅱ檢測 異常凝血酶原（PIVKA-Ⅱ）采用兩步法免疫檢測，運用Chemiflex 技術，即CMIA技術與靈活的檢測模式的結(jié)合，定量檢測人血清PIVKA-Ⅱ。（1）混合樣本、稀釋液和PIVKA-Ⅱ抗體包被的順磁性微粒子。樣本中的PIVKA-Ⅱ與PIVKA-Ⅱ抗體包被的微粒子相結(jié)合。（2）沖洗后進入第二步，加入吖啶酯標記的凝血酶原抗體結(jié)合物，形成反應混合物。（3）再次沖洗后，將預激發(fā)液和激發(fā)液加入到反應混合物中。（4）測量產(chǎn)生的化學發(fā)光反應，以相對發(fā)光單位（RLU）表示。樣本中的PIVKA-Ⅱ含量與發(fā)光系統(tǒng)檢測到的RLU 值之間成正比。血清PIVKA-Ⅱ的參考區(qū)間為≤40 mAU/mL。

1.5 AFP 檢測 AFP 檢測采用直接化學發(fā)光技術的雙抗體夾心法。（1）分配10 μL 樣品到比色杯內(nèi)。（2）分配50 μL 標記試劑和250 μL 固相試劑，在37 ℃條件下孵育7.5 min。（3）分離、吸出未結(jié)合試劑，然后用試劑水洗滌比色杯。（4）配制酸性試劑和堿性試劑各300 μL，啟動化學發(fā)光反應。測量產(chǎn)生的化學發(fā)光反應，以相對發(fā)光單位（RLU）表示。樣本中的AFP 含量與發(fā)光系統(tǒng)檢測到的RLU 值之間存在正比關系。血清AFP 的參考區(qū)間為≤20 ng/mL。

1.6 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗，正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差（）表示。多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩變量之間行相關分析。使用受試者工作特征（ROC）曲線分析血清PIVKA-Ⅱ和AFP 的診斷效能。計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 三組研究對象一般資料比較 肝細胞肝癌組45 例，年齡（59.75±11.41）歲，男34 例（76%），女11例（24%）；肝硬化組36 例，年齡（64.05±7.62）歲，男25 例（69%），女11 例（31%）；對照組40 例，年齡（58.60±14.15）歲，男28 例（70%），女12 例（30%）。三組研究對象年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

2.2 不同組別血清PIVKA-Ⅱ、AFP 水平比較 肝細胞肝癌組血清PIVKA-Ⅱ水平明顯高于肝硬化組和對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。肝硬化組和對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。三組之間AFP 水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組血清PIVKA-Ⅱ表達水平比較（）

表1 各組血清PIVKA-Ⅱ表達水平比較（）

注：PIVKA-Ⅱ為異常凝血酶原；AFP 為甲胎蛋白；與肝硬化組、對照組比較，aP＜0.05

2.3 PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨和聯(lián)合檢測對肝細胞肝癌診斷效能分析 PIVKA-Ⅱ和AFP 單獨檢測的敏感性明顯低于PIVKA-II+AFP 聯(lián)合檢測，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 血清PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨檢測和聯(lián)合檢測對原發(fā)性肝癌診斷效能（%）

2.4 PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨和聯(lián)合檢測肝細胞肝癌時ROC 曲線分析 PIVKA-Ⅱ臨界值為47.715 mAU/mL時，診斷肝細胞肝癌的曲線下面積為0.884；AFP 臨界值為4.35 μg/L 時，診斷肝細胞肝癌的曲線下面積為0.787；PIVKA-Ⅱ+AFP 聯(lián)合檢測時ROC 曲線下面積為0.901，PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨檢測分別與PIVKA-Ⅱ+AFP 聯(lián)合檢測曲線下面積比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05），見圖1。

圖1 PIVKA-Ⅱ、AFP 單獨和聯(lián)合檢測原發(fā)性肝癌時ROC 曲線

2.5 各組PIVKA-Ⅱ、AFP 檢測結(jié)果陽性率比較肝細胞肝癌組血清PIVKA-II 或AFP 檢測結(jié)果陽性率為71.1%（32/45），肝硬化組為11.1%（4/36），對照組為17.5%（7/40），三組數(shù)據(jù)總體均數(shù)存在著統(tǒng)計差異（χ2=39.92，P＜0.001）。肝細胞肝癌組與肝硬化組、對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），肝硬化組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組血清PIVKA-Ⅱ、AFP 檢測結(jié)果陽性率比較[例（%）]

3 討論

肝細胞肝癌是常見的惡性腫瘤，其死亡率高居所有腫瘤死亡率第二位[7-8]。其原因除了缺乏有效的治療方式外，更重要的是肝細胞肝癌早期無明顯的癥狀，發(fā)現(xiàn)時大多已是晚期。肝細胞肝癌晚期的治療方式有限、治療效果也不理想。目前常用的肝癌檢測方法包括超聲檢查結(jié)合血清標志物AFP 測定，但是二者均有不足。超聲檢查不易發(fā)現(xiàn)早期肝癌。血清標志物AFP 是目前最常用的肝癌標志物，但其易受到肝硬化、梗阻性膽道系統(tǒng)疾病等影響。同時AFP 可以在多種腫瘤中表現(xiàn)出較高的濃度，因此它在診斷早期肝癌時的特異性和靈敏性都不理想，漏診率也較高，也無法進行治療后的療效判斷[9-10]。

PIVKA-Ⅱ是維生素K 缺乏或采用華法林或苯丙香豆素進行治療的患者中的一種異常脫羧基凝血酶原（DCP）。由于PCP 不能通過結(jié)合鈣離子與磷脂聯(lián)結(jié)，因此存在功能缺陷。PIVKA 測量可在常規(guī)凝血試驗結(jié)果變化前或出血前便檢出維生素K 缺乏。正常個體中無PIVKA-Ⅱ，但肝病和肝臟惡性腫瘤患者中即便未出現(xiàn)維生素K 缺乏，也可能存在PIVKA-Ⅱ[11]。多項研究表明，PIVKA-Ⅱ?qū)υ\斷肝細胞肝癌的特異性高于AFP，能明顯提高肝細胞肝癌的檢出率，達到早發(fā)現(xiàn)早治療的目標。Parameter、APASL 和JSH等權威指南和共識都推薦將PIVKA-Ⅱ作為肝細胞肝癌篩查、輔助診斷及預后判斷的重要指標。亞太肝病學會及日本肝病學會推薦將其用于高危人群的篩查、肝病的輔助診斷、治療效果的監(jiān)測和預后復發(fā)的預測工具。中華醫(yī)學會肝病學分會最新發(fā)布的《慢性乙肝防治指南》，也推薦使用PIVKA-Ⅱ，與AFP 互為補充，提高肝細胞肝癌的早期診斷率。同時肝癌的早發(fā)現(xiàn)也極大的提高了其疾病的預后，提高了肝癌患者生活質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，PIVKA-Ⅱ既可輔助診斷肝細胞肝癌，也可用于肝細胞肝癌和肝硬化的鑒別診斷，降低肝癌的誤診率和漏診率。PIVKA-Ⅱ水平彌補了AFP特異性差的缺陷，為臨床診斷HCC 提供了新的高特異性的血清學指標。而PIVKA-Ⅱ和AFP 聯(lián)合檢測可提高HCC 檢出的敏感性，有助于肝癌的及早發(fā)現(xiàn)。且血清PIVKA-Ⅱ水平能提示肝細胞肝癌的嚴重程度，為臨床早期診斷提供強有力的支撐條件[12-15]。

綜上所述，PIVKA-Ⅱ不僅有較高的特異性，還可用于肝細胞肝癌和肝硬化的鑒別診斷。通過ROC曲線發(fā)現(xiàn)，PIVKA-Ⅱ和AFP 聯(lián)合檢測肝細胞肝癌的敏感性遠大于單獨檢測，可大幅提升早期肝細胞肝癌的診斷效能。同時也可為肝癌的早期診斷提供新的思路和方向，為患者爭取更多的治療方法和治療時間。本研究由于入選患者不多，樣本量不足，后期還需更多的實驗數(shù)據(jù)予以證實。