非酒精性脂肪性肝病血清標志物研究進展*

黃 蝶，田昊宇 綜述，李異玲 審校

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)指除外酒精、病毒感染及其他明確病因所致的以肝實質細胞脂肪變性和脂肪貯積為主要特征的臨床病理綜合征。NAFLD代表了一系列疾病，包括單純性脂肪變性，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)和肝硬化,甚至可能會發展為肝細胞癌[1-4]。目前，NAFLD的發病機制尚未完全了解清楚，胰島素抵抗、高胰島素血癥、血漿游離脂肪酸升高、脂肪肝、肝細胞損傷、肝臟炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙、促炎性細胞因子失衡和纖維化是NAFLD的特征[5-8]，并且NAFLD常常和肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病、脂代謝紊亂、高血壓等合并存在，使我國NAFLD 的發病率大大提高。所以，NAFLD相關的更多研究是必要而緊急的一項挑戰。

1 NAFLD與MicroRNA(miRNA)

miRNA是長度約為22個核苷酸的小的非編碼RNA，具有通過抑制信使RNA(mRNA)翻譯或促進mRNA降解在轉錄后水平調節基因表達的能力[5]。在轉錄后水平上miRNA控制著許多互補的mRNA靶標，并且它們的失調在廣泛的嚙齒動物和人類病理性肝病(包括NAFLD)中具有很高的預后和預測價值[6]。目前尚不可能通過常規使用的血液和組織生物標志物來預測NAFLD結果，侵入性肝活檢仍是診斷金標準。然而肝活檢存在一定風險，并且不適合進行大規模篩查，因而循環miRNA已經成為用于肝病診斷和分期的有吸引力的候選分子[7]。

1.1 miR-34a 研究表明，與健康對照相比，NAFLD和慢性乙型肝炎患者的miR-34a血清表達水平有差異,并且miR-34a在NAFLD樣品中的表達量增加了約2倍。與丙氨酸轉氨酶和角蛋白-18(cytokeratin-18， CK-18)相比，循環中的miR-34a與肝脂肪變性和炎性活性具有中等相關性，并且顯示出優越的NASH診斷能力。它不僅在NASH診斷中具有重要作用，而且具有良好的疾病特異性，這突出了其作為疾病嚴重程度生物標志物的潛在價值[8]。Torres等研究發現[9]，綠茶(Green tea,GT)補充劑可通過改變脂質代謝，增加參與甘油三酸酯和脂肪酸分解代謝的基因表達以及減少攝取和脂質蓄積來防止NAFLD的發展，并且可防止全身性胰島素抵抗改善肝胰島素敏感性。GT補充劑可有效減少高脂飲食(high -fat diet,HFD)喂養小鼠肝臟中的脂質蓄積，與僅飼喂HFD的小鼠相比，補充了GT的小鼠的NAFLD活性得分較低，且可逆轉HFD誘導的脂質分布變化，從而減少大泡脂肪變性、甘油三酯和膽固醇含量。此外，還觀察到GT的補充可最大程度地減少HFD誘導的肝損傷，而GT改變肝臟代謝的潛在機制可能涉及對miR-34a的表觀遺傳調控，從而控制Sirt1/Ppara/Insig2靶基因的表達。但在NAFLD期間發生miR-34a調節的機制仍然未知。近來，環狀RNA(circRNA)/ miRNA相互作用揭示了表觀遺傳調控的新層，但是靶向miRNA的circRNA在肝脂肪變性中仍然不確定[10]。研究[10]發現circRNA_0046367是miR-34a的內源性調節劑，是肝臟脂肪變性的基礎，而且miR-34a是circRNA_0046367的唯一靶標。在轉錄和翻譯水平，與非脂肪變性對照組(對照組)相比，患有肝細胞脂肪變性的NAFLD患者(脂肪變性組)的特征是肝circRNA_0046367顯著下調，然而其肝臟組織中的miR-34a水平有統計學意義的升高。circRNA_0046367和miR-34a的不一致水平防止它們的互補相互作用并且最終促進miR-34a對PPARα(peroxisomeproliferator-activated receptor α，PPARα)的抑制作用，表明circRNA_0046367/miR-34a/PPARα與脂肪變性有關。一項研究[11]對廣泛用于治療高脂血癥和高血糖癥的絞股藍(gynostemma pentaphylla,GP)進行研究，發現小鼠通過GP處理后可降低一些肝miRNA，例如miR-130a，miR-34a，miR-29a，miR-199a，其中miR-34a的表達與實驗組相比變化了四倍以上。且GP可有效減少肝脂肪變性和保護肝細胞，這可能是通過調節腸道菌群和抑制miR-34a來實現的，但具體機制尚不清楚。

1.2 miR-122 miR-122是肝臟最豐富的miR,在肝臟脂肪代謝中具有重要作用。循環中的miRNA，尤其是miR-122，可能是具有準確性的NAFLD的有前途的診斷生物標志物[12]。通過NAFLD體內體外模型研究[13]發現miR-122表達升高且Sirt1(sirtuin 1)表達降低，miR-122通過與Sirt1的3’-UTR(untranslated region ，UTR)結合來抑制Sirt1因而進一步抑制LKB1(liver kinase B1，LKB1) / AMPK( AMP-activated protein kinase ，AMPK)信號傳導途徑，進而誘導NAFLD的脂肪變性和脂肪生成。因此，沉默miR-122可以通過直接上調肝細胞中的Sirt1來減輕脂質沉積，敲低miR-122可以重新激活LKB1 / AMPK軸，抑制脂質過度產生并減輕NAFLD的嚴重性。這表明miR-122是用于NAFLD診斷的潛在生物標志物，并且是未來NAFLD治療的有吸引力的藥物靶標。Naderi et al[14]發現miR-122在肝脂肪變性中上調。在臨床樣品中，miR-122鑒定出的靶標的蛋白質和RNA水平也被上調，有可能是對高水平miR-122的不成比例的反饋反應。結果表明miR-122的上調可觸發肝硬脂病中LPIN1和CTDNEP1的代償反應。miR-122過度表達可影響肝臟脂質代謝，但是其缺乏也對肝臟有損傷。Sendi[15]使用多細胞3D人肝類器官進行研究突出了miR-122抑制在肝臟炎癥，脂肪纖維化和胰島素信號傳導異常中的作用，發現miR-122抑制導致肝類器官肝細胞死亡、肝纖維化、脂肪變性和胰島素信號傳導失調。由于大多數NAFLD患者具有一定程度的胰島素抵抗，因此此研究結果突出了miR-122在胰島素敏感性中的作用，這表明miR-122模擬物可以在這些患者中逆轉肝臟炎癥，脂肪變性和胰島素抵抗中發揮有益作用。血清miR-122水平與NAFLD的發生發展密切相關，但其與NAFLD患者死亡率之間的關系仍不清楚。

1.3 miR-29 MicroRNA-29(miR-29)已顯示在減輕肝損傷后的炎癥和纖維化中起關鍵作用[16,17]。在高脂飲食(HFD)的小鼠發現miR-29a的過表達對促炎細胞因子IL-6和MCP-1以及脂肪酸轉位酶CD36和PPARγ具有抑制作用，這與脂質代謝的調節有關。miR-29a的過表達不僅減輕了HFD誘導的體重增加，而且減輕了小鼠的皮下，內臟和腸內脂肪蓄積和肝細胞脂肪變性及纖維化，這強調了miR-29a在調節NAFLD中的作用[17]。Yang[18]用蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine-choline-deficient，MCD)飲食誘導的NASH小鼠實驗發現miR-29a的過表達顯著減輕了MCD飲食引起的體重減輕、脂肪變性、纖維化和損傷，并降低了小鼠的天冬氨酸轉氨酶水平。同時miR-29a信號轉導的增加還導致肝臟組織內與脂質代謝相關的DNA甲基轉移酶3b(DNMT3b)，TGF-β，IL-6，血紅素加氧酶-1，p-SMAD3，PI3K和L3BII表達下調。總體而言，此研究表明miR-29a功能的獲得對MCD飲食誘導的NASH具有保護作用。另外，Liu[19]還發現miR-29a可能是肝膽固醇穩態的重要調節劑，其通過研究MCD飲食的小鼠發現miR-29a的表達水平與MCD飲食小鼠模型體內和體外2種脂肪變性肝細胞模型(SMMC-7721和HL-7702細胞)中的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGCR)表達水平呈負相關，而HMGCR是肝臟中膽固醇合成的限速酶。同時發現Dicer1缺乏時肝膽固醇增加。Dicer1是miRNA成熟必不可少的酶，其缺乏癥導致的miRNA丟失在很大程度上促進了許多疾病的發展，包括脂質失調，這對于非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的發展至關重要。該研究表明Dicer1/miR-29/HMGCR軸有助于小鼠NASH中肝游離膽固醇的積累。但HMGCR與Dicer1缺乏癥之間的關系還需進一步探索。因此，miR-29a可用作治療非酒精性脂肪性肝病以及與FC蓄積有關的其他肝病的潛在治療靶標。

1.4 miR-21 從脂肪變性到NASH,NAFLD患者肝臟中miR-21的表達水平顯著增加，miR-21的抑制和法尼醇X受體(FXR)活化可改善肝臟脂肪變性、炎癥及纖維化。miR-21/PPARα軸可能在NAFLD和NASH的發生發展中發揮重要作用[20]。經典的WNT /β-catenin信號傳導途徑已被認為是脂肪分化的關鍵調節劑，并發揮抗脂質形成和抗炎作用，而非經典的WNT信號通路會促進脂肪形成，脂質堆積和炎癥，因此WNT信號通路的失衡與NAFLD密切相關[21]。當經典的WNT/β-catenin信號通路被激活時，β-catenin抑制了CCAAT增強子結合蛋白α(C/EBP-α)和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)的表達。研究表明抑制miR-21的表達通過靶向低密度脂蛋白相關受體6(LRP6)激活WNT/β-catenin信號通路來緩解NAFLD。通過對miRNA-21的抑制或抑制作用恢復PPARα的表達，可減少NASH肝損傷，炎癥和纖維化[22]。然而，有人發現隨著NAFLD病情加重，胰島素抵抗和糖尿病誘導的NAFLD組小鼠肝臟miR-21表達水平進一步下降。下調的miR-21表達水平與上調的過氧化物酶增殖物激活的受體亞型(PPAR-γ和PPAR-α)和脂肪細胞脂肪酸結合蛋白基因表達呈負相關。胰島素抵抗和糖尿病誘導的NAFLD小鼠中miR-21表達下調，而這可能通過調節PPAR亞型的表達參與NAFLD的發病。對miR-21的研究存在差異，未來需更多的研究來證實其在NAFLD中的調控作用。

1.5 miR-155 miR-155的靶基因C/EBP-α，C/EBP-β和PPAR-γ這三個轉錄因子在促進脂肪形成中起著至關重要的作用。抑制miR-155的表達，可使脂肪組織和NAFLD中三個轉錄因子上調，從而參與NAFLD的發生發展。miR-155在動脈粥樣硬化中顯著上調，而在其他高脂血癥相關疾病(NAFLD，肥胖癥和II型糖尿病)中則下降，其促進主動脈內皮細胞激活和動脈粥樣硬化形成，但抑制白色脂肪組織的發展和NAFLD的發病機理。因而miR-155對NAFLD具有保護作用，它的缺乏癥會導致肥胖，但不會引起胰島素抵抗和葡萄糖耐受不良。另外，miR-155抑制高脂飲食引起的血漿脂肪因子瘦素、抵抗素水平，而miR-155敲除的白色脂肪組織中抵抗素的表達增加可能是繼發性發炎狀態在代謝健康肥胖向經典性肥胖過渡中的驅動因素，這與肥胖，NAFLD和無胰島素抵抗的高胰島素血癥，以及動脈粥樣硬化的減少可能有密切關系。

1.6 miR-33 固醇調節元件結合蛋白(sterol-regulatory element binding protein,SREBP)是參與膽固醇/脂質生物合成和運輸的基因的主要調節劑，有SREBP-1和SREBP-2兩型。miR-33a/b分別位于編碼SREBP-2和SREBP-1轉錄因子的基因的內含子中，可抑制膽固醇轉運蛋白的表達(ATP binding cassette transporters A1,ABCA1和ATP binding cassette transporters G1,ABCG1)，所以miR-33是膽固醇/脂質的關鍵調節劑。研究發現在肥胖人群中，miR-33b表達在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)中升高。miR-33b基因表達與脂蛋白分泌相關基因(SREBP2和ABCG1)和脂質氧化相關基因(carnitineO-octanoyltransferase，CROT)的mRNA表達正相關。同時還發現miR-33a的肝表達與PPARα呈正相關，但與ABCG1和CROT之間呈負相關。

1.7 miR-16 研究表明，NAFLD和CHB患者的miR-16血清表達差異。循環miR-16與肝纖維化表現出良好的相關性，但其顯示在診斷NASH中明顯的纖維化方面性能有限，且區分NAFLD中明顯的纖維化方面比FIB-4和APRI稍差[7]。

miRNA是具有調控功能的內源性非編碼RNA，它與NAFLD的脂質代謝、胰島素抵抗、炎癥反應、細胞凋亡、纖維化等環節關系密切。血清miR-34a，-192，-27b，-122，-22，-21，-197，-30c和- 16與NAFLD嚴重程度相關。此外，與藥物性肝損傷患者相比，miR-192，-27b，-22，-197和-30c對NAFLD表現出特異性。總之，經過驗證的循環microRNA具有比常規血清標志物更好的診斷潛力，可以識別NASH患者，并且可以補充和改善當前的纖維化預測算法[28]，對于NAFLD的診斷和治療具有重要作用。

2 NAFLD與preptin

Preptin是新近研究發現的一種34個氨基酸的肽，是胰島素原生長因子II(pro-IGF-II)的衍生物，由胰島β細胞分泌，被認為是胰島素分泌的生理增強劑。迄今為止的研究結果表明，由肥胖，2型糖尿病，多囊卵巢綜合征，非酒精性脂肪肝或心血管疾病等代謝綜合征引起的疾病伴隨著這些肽濃度的顯著變化。研究發現NAFLD 患者血清preptin水平顯著升高，且preptin水平隨著脂肪肝程度的加重而升高，說明preptin水平與脂肪肝嚴重程度相關。而preptin可能通過影響胰島素抵抗參與 NAFLD 的發病機制,其在NAFLD中的作用及其具體機制值得進一步深入研究，將有助于發掘臨床診治 NAFLD 的可能靶點。

3 NAFLD與瘦素

瘦素主要由脂肪細胞分泌的脂肪因子，在脂肪營養不良的患者中顯著減少。瘦素不僅對中樞神經系統具有重要作用，包括誘導能量消耗和飽腹感，而且在激活免疫細胞和調節炎癥反應時也具有重要意義。研究發現瘦素可誘導前脂肪細胞和脂肪細胞中的細胞內信號傳導，從而促進脂肪生成和調節炎癥介質的分泌。研究數據表明血清瘦素水平與NAFLD的嚴重程度有關，尤其是在經典NAFLD患者中，且瘦素水平也與胰島素抵抗穩態模型評估(HOMA-IR)呈正相關。瘦素在NAFLD中起到一定作用，未來對其進一步研究有價值，可能成為治療 NAFLD的潛在靶點。

4 NAFLD與脂聯素

脂聯素(APN)是由脂肪細胞產生的一種激素，在血漿中以三種不同的基本寡聚復合物形式存在：同三聚體低分子量APN，六聚體中分子量APN，和12-18 protomer高分子量APN。Lian發現在NAFLD患者中觀察到總高、中、低分子量APN水平降低，高分子量和中分子量APN可能分別與肝功能和脂質代謝密切相關，可能在NAFLD的發病機理和進程中起重要作用，所以可以被認為是NAFLD的潛在新治療方法。除了對脂聯素本身研究，其受體也可能對NAFLD產生影響。有研究表明適度攝入發酵酒精飲料，例如啤酒，至少會通過與肝臟脂聯素受體1(AdipoR1)表達相關的機制來減弱NAFLD的發育。在兒童NAFLD中，Gulsah et al研究發現患有NAFLD的肥胖兒童的可溶性AdipoR2水平高于沒有NAFLD的肥胖兒童，血漿中可溶性AdipoR2的高水平作為一種非侵入性標志物可能被用作診斷兒童NAFLD。然而，該研究有一定局限性，未來需要更多更廣泛研究探索可溶性AdipoR2水平在NAFLD中重要作用。

5 NAFLD與CK-18

CK-18是肝細胞中大量存在的主要中間絲蛋白，占肝臟蛋白的5%，且是肝細胞凋亡的標志。一項薈萃分析表明血清CK-18和成纖維細胞生長因子21(FGF-21)的水平上調與NASH風險增加相關，可用于診斷NAFLD，尤其是NASH。重要的是，與單一使用相比，兩者組合比能提高準確性，并具有最高的靈敏度和特異性，可能被用作NASH的準確診斷工具。研究發現血清CK-18水平與纖維化、炎癥、脂肪變性、馬洛氏體和非酒精性脂肪肝疾病活動評分(NAS)相關。在研究人群中，平均血清CK-18水平隨NAS值的升高而升高，它已是NAFLD頻譜內NAS≥5的一種非侵入性，簡單且可靠的生物標志物。因而，CK-18在NAFLD進展及治療效果中具有重要作用。有研究證實NASH組CK-18(M30和M56)水平高于單純性脂肪變性[7]。除此之外，血清CK-18和血清ALT之間發現呈顯著正相關，而血清AST與CK18無顯著相關性，這與Alt等研究發現血清CK-18和血清AST之間有相關相矛盾。未來需更多研究證明CK-18的重要作用，或許該蛋白可以用作診斷性生物標志物以及將來疾病進展的標志物。