天麻中腦線粒體靶向化合物的獲取及其神經保護活性研究Δ

余星霖，楊麗萍，陳普，段小花（云南中醫藥大學云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室，昆明 650500）

線粒體在維持大腦活動中發揮著重要作用，不僅是神經細胞的主要能量來源，還參與神經細胞凋亡、產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、調節能量代謝和維持鈣平衡等生理調節[1]。線粒體功能障礙會導致許多神經類疾病，如：腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病等[2]。因此，針對線粒體功能障礙，防止線粒體損傷對治療神經類疾病具有重要意義。

近年來，從中藥中獲取具有線粒體靶向功能的活性成分已成為研究熱點[3]。天麻為蘭科植物天麻Gastro‐dia elataBl.的干燥塊莖，具有抗氧化應激、抗衰老、改善記憶障礙、抗抑郁等藥理作用，用于治療帕金森病、阿爾茨海默病、癲癇、抑郁癥、腦缺血損傷等疾病[4]。目前，在天麻中發現了近百種化合物，包括酚類（如天麻素、對羥基苯甲醇）、有機酸類（如巴利森苷）、甾體類（如β-谷甾醇）等[5]。實驗研究表明，天麻素、巴利森苷等可發揮抗氧應激、抑制細胞凋亡、保護神經細胞的作用[6]。然而，對天麻改善線粒體功能的活性成分尚未確定，這嚴重限制了其神經保護機制的進一步研究。

近年來，有研究者基于超濾離心和高效液相色譜（HPLC）-質譜聯用的方法獲取靶向肝臟、心臟中線粒體的中藥活性成分，并通過藥理實驗證明所獲取成分具有活性作用[7―8]，這是從復雜成分中高效獲取線粒體靶向化合物的有效方法。基于天麻中主要成分已基本被鑒定，本課題組利用超濾離心選擇性分離與腦線粒體結合的天麻成分，并采用HPLC法分析鑒定；最后，通過缺氧缺 糖/復 氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）細胞實驗研究所得化合物的神經保護活性。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有DMi1型倒置生物顯微鏡（上海徠卡儀器有限公司）、FD-1A-50型冷凍干燥機（北京博醫康實驗儀器有限公司）、VariosKan型全波長掃描式多功能酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]、1260型HPLC儀（美國Agilent公司）、ST60-4型微孔板恒溫振蕩器（杭州米歐儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

天麻粉由云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室提供，經云南省傣醫藥與彝醫藥重點實驗室尹子麗副教授鑒定為蘭科植物天麻G.elataBl.的干燥塊莖粉末。對照品對羥基苯甲醇（p-hydroxybenzyl alcohol，HBA）、對羥基苯甲醛（p-hydroxybenzaldehyde，HBD）、尼莫地平、阿莫西林（批號分別為 AF21030253、AF20062752、AF21052851、AF21052807）均購自成都埃法生物科技有限公司，純度均不小于98%；阿司匹林對照品（批號A8830，純度≥98%）、依達拉奉對照品（批號IE0020，純度≥98%）、噻唑藍（MTT）（批號823L051）、線粒體提取試劑盒（批號SM0020）均購自北京索萊寶科技有限公司；中性紅（批號DS300-2）購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；健那綠（批號S19083-5g）購自上海源葉生物科技有限公司；線粒體膜電位（mitochondrial mem‐brane potential，MMP）檢測試劑盒JC-1（批號BL711A）、ROS檢測試劑盒（批號S0033S）、線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）檢測試劑盒（批號C2009S）、乳酸脫氫酶（lactate dehydroge‐nase，LDH）細胞毒性檢測試劑盒（批號C0016）均購自上海碧云天生物技術有限公司；腺苷三磷酸（adenosine tri‐phosphate，ATP）含量測試盒（批號A095-2-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.3 實驗動物和細胞株

20只SPF級雄性SD大鼠，體質量為250～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK（湘）2019-0004。所有涉及動物的程序均符合《醫學實驗動物管理實施細則》的要求，倫理審查編號為R-062021088。HT22海馬神經元細胞購自上海酶研生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 大鼠腦組織中線粒體的提取及其純度、活性評估

2.1.1 線粒體的提取 脫頸處死SD大鼠，快速取出大腦，置于預冷的生理鹽水中（手術均于冰上進行）。根據線粒體提取試劑盒說明書提取腦線粒體，得純化線粒體。

2.1.2 線粒體純度評估 將純化線粒體與非純化線粒體（未經線粒體提取試劑盒中Wash Buffer處理的線粒體，含有其他細胞組織）分別懸浮于200 μL磷酸鹽緩沖溶液中，并加入0.3%健那綠溶液（線粒體專屬染料）和0.15%中性紅溶液（溶酶體、高爾基體染色）各100 μL混合。在室溫下培養10 min后，置于顯微鏡下觀察[7]。結果顯示，非純化線粒體中可見大量的雜色，純化線粒體則為單一的藍綠色，表明經提取的線粒體純度高（圖1）。2.1.3 線粒體活性評估 將實驗分為對照組和羰基氰化物間氯苯腙（carbonyl cyanidem-chlorophenyl hydra‐zone，CCCP）處理組（CCCP可誘導膜電位下降），每組設置4個平行。每組取200 μL純化線粒體懸浮液（1 mg/mL，磷酸鹽緩沖溶液配制，下同），對照組用常規細胞培養液處理，CCCP處理組用含CCCP的細胞培養液（1∶1 000）處理，根據MMP檢測試劑盒JC-1說明書檢測線粒體活性。采用全波長掃描式多功能酶標儀在激發波長為525 nm、發射波長為590 nm時測定熒光值，熒光值越大，MMP越高。實驗數據使用Graphpad Prism 9.0軟件進行統計分析。實驗數據以±s表示，組間比較采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05。結果顯示，與對照組熒光值（154.90±4.05）相比，CCCP處理組熒光值（80.10±4.04）顯著降低（P＜0.05），表明純化線粒體具有活性。

2.2 天麻中腦線粒體靶向化合物的獲取方法可行性驗證

采用超濾離心-HPLC法進行測定。以純化線粒體為對照組；取純化線粒體在沸水中持續加熱2 h，產生失去主要生物學功能的失活線粒體，將其作為實驗組。

2.2.1 溶液的制備 （1）混合標準溶液：參考文獻[7]，采用二甲基亞砜制備阿司匹林、尼莫地平、阿莫西林質量濃度均為2 mg/mL的混合標準溶液。（2）尼莫地平標準溶液：采用二甲基亞砜制備尼莫地平質量濃度為2 mg/mL的標準溶液。（3）實驗組混合標準溶液：精密吸取5 μL混合標準溶液與200 μL失活線粒體懸浮液（1 mg/mL，磷酸鹽緩沖溶液配制，下同），在37 ℃條件下孵育60 min（化合物與線粒體特異性結合）；孵育后置于0.5 mL 10 kDa超濾管中，在4 ℃下以14 000 r/min離心25 min（去除未結合成分）后用乙酸銨緩沖液（50 mmol/L，pH7.5）沖洗3次，每次200 μL（清洗未結合成分）；于超濾管中加入400 μL 80%甲醇超聲（頻率500 W，功率40 kHz，下同）20 min后，在室溫下以14 000 r/min離心25 min（分離結合成分），即得超濾液。將超濾液置于氮氣氣流下干燥，用100 μL 80%甲醇溶解后即得實驗組混合標準溶液[7]。（4）對照組混合標準溶液：精密吸取5 μL混合標準溶液與200 μL純化線粒體懸浮液，按“2.2.1（3）”項下方法制備，即得。（5）實驗組尼莫地平標準溶液：精密吸取5 μL尼莫地平標準溶液與200 μL失活線粒體懸浮液，按“2.2.1（3）”項下方法制備，即得。（6）對照組尼莫地平標準溶液：精密吸取5 μL尼莫地平標準溶液與200 μL純化線粒體懸浮液，按“2.2.1（3）”項下方法制備，即得。（7）尼莫地平對照品溶液：采用80%甲醇制成質量濃度為1 mg/mL的尼莫地平對照品溶液。

2.2.2 色譜條件 以Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱；水（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫程序見表1；柱溫為30 ℃；檢測波長為230 nm；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2.3 實驗驗證 取“2.2.1（3）～（7）”項下溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣分析。當對照組和實驗組的峰面積之差與對照組峰面積的比值（ΔP）＞20%時，表明成分與線粒體能特異性結合[7]。ΔP值計算公式如下：ΔP＝（Pe－Pc）/Pe×100%，其中Pe、Pc分別代表對照組、實驗組的峰面積。由圖2可知，與實驗組混合標準溶液相比，對照組混合標準溶液中尼莫地平峰面積有明顯增加，ΔP為（34.11±1.10）%（＞20%），而阿司匹林和阿莫西林均未能被檢測出（ΔP＜20%）。此外，結果顯示，與實驗組尼莫地平標準溶液相比，對照組尼莫地平標準溶液中尼莫地平峰面積有明顯增加，ΔP為（43.41±6.06）%（＞20%）。有研究表明，阿莫西林和阿司匹林不與線粒體結合[9―10]，尼莫地平可與線粒體特異性結合[11]。因此，上述結果表明超濾離心-HPLC法具有識別分離功能，可用于獲取具有線粒體靶向功能的化合物。

2.3 天麻中腦線粒體靶向化合物的獲取

2.3.1 天麻凍干粉的制備 將50 g天麻粉浸入500 mL 70%甲醇中30 min后，超聲提取60 min，過濾提取液；殘余物加入400 mL 70%甲醇超聲提取60 min，過濾提取液。將2次過濾的提取液通過旋轉蒸發器在45 ?C下減壓濃縮，濃縮物用冷凍干燥機凍干，即得天麻凍干粉，于室溫下儲存在干燥器中備用。

2.3.2 單因素實驗篩選化合物獲取的最佳條件 參考“2.2”項下實驗分組和“2.2.1（3）”項下對照組混合標準溶液制備的方法，以天麻凍干粉的3個質量濃度（150、300、600 g/L）標準溶液，孵育時間為60 min進行操作，按“2.2.2”項下色譜條件進樣分析，每組平行測定3次，考察標準溶液的最佳濃度。結果顯示，質量濃度為300、600 g/L時，天麻提取物有4個峰ΔP＞20%，但質量濃度為600 g/L時與線粒體結合的成分含量更高（表2）。進一步以該質量濃度為標準溶液對孵育時間（30、60、90 min）進行檢測，考察標準溶液的最佳孵育時間。結果顯示，孵育時間為60 min時，孵育效果最好，有4個峰ΔP＞20%（表2）。天麻中線粒體靶向化合物獲取的最佳條件為：天麻凍干粉質量濃度600 g/L，孵育時間60 min。

表2 不同質量濃度、不同孵育時間下天麻中成分與線粒體結合效果（n＝3）

2.3.3 成分指認 取HBA、HBD對照品適量，分別采用80%甲醇制成質量濃度為0.1 mg/mL的對照品溶液，按“2.2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將上述色譜圖與“2.3.2”項下天麻凍干粉質量濃度為600 g/L、孵育時間為60 min時的實驗組線粒體超濾液色譜圖進行比對，指認P2為HBA、P3為HBD，結果見圖3。

2.4 獲得化合物對離體腦線粒體活性的影響

2.4.1 統計學方法 應用Graphpad Prism 9.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊）或非參數秩和檢驗（方差不齊）。檢驗水準α＝0.05。

2.4.2 MMP測定 MMP下降是線粒體活性下降的標志[7]。將純化線粒體分為對照組（僅純化線粒體）、CCCP誘導組、HBA處理組（CCCP+HBA 50、100、150 μmol/L）、HBD處理組（CCCP+HBD 50、100、150 μmol/L），每組設置6個平行。除對照組外，各組按“2.1.3”項下CCCP處理組方法處理并給予相應藥物后，按“2.1.3”項下方法進行MMP檢測。結果（表3）顯示，與對照組比較，CCCP誘導組MMP顯著降低（P＜0.05）；與CCCP誘導組比較，HBA、HBD 處理組 MMP顯著升高（P＜0.05），表明HBA、HBD處理均能使線粒體活性升高。此外，由表3可知，HBA改善MMP的作用優于HBD，而且2020年版《中國藥典》中把HBA列入天麻質量控制的成分之一，因此選取HBA進行后續實驗。

表3 獲得化合物對MMP的影響（±s，n＝6）

表3 獲得化合物對MMP的影響（±s，n＝6）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與CCCP誘導組比較，P＜0.05

組別對照組CCCP誘導組HBA處理組化合物濃度/（μmol/L）MMP 12.49±0.58 5.76±0.47a 10.77±0.60b 11.01±0.49b 10.27±0.86b組別HBD處理組50 100 150化合物濃度/（μmol/L）50 100 150 MMP 9.42±0.40b 9.60±0.61b 10.13±0.59b

2.5 HBA對HT22細胞的神經保護作用

2.5.1 HT22細胞存活率的檢測 采用MTT法進行檢測。取對數生長期的HT22細胞接種于96孔板，細胞密度為1×105個/mL，每孔100 μL，將細胞分為空白對照組（只加培養基，不加細胞）、正常組（正常培養細胞）、不同濃度HBA（25、50、100、200、400 μmol/L）組，每組設置6個復孔。HBA組細胞加入含相應濃度藥物的完全培養基（即含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基，下同），正常組加入完全培養基，于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h。使用酶標儀于490 nm波長處測定吸光度（A），計算各組細胞存活率：細胞存活率（%）＝（AHBA組－A空白對照組）/（A正常組－A空白對照組）×100%。按“2.4.1”項下統計方法計算（下同），結果顯示，與正常組相比，HBA給藥濃度在25～200 μmol/L時，細胞存活率無顯著改變（P＞0.05），分別為（103.70±4.68）%、（99.05±3.66）%、（99.39±5.19）%、（94.50±2.12）%；給藥濃度為400 μmol/L時，細胞存活率[（90.49±2.58）%]顯著下降（P＜0.05）。可見HBA給藥濃度在25、50、100 μmol/L時對細胞存活率影響較小，故選擇上述濃度用于后續實驗。

2.5.2 HBA對OGD/R損傷HT22細胞死亡率與形態學的影響 取對數生長期的HT22細胞接種于6孔板，細胞密度為6.4×104個/mL，每孔2 mL，將細胞分為對照組、模型組、陽性對照組（依達拉奉100 μmol/L[12]）和不同濃度HBA（25、50、100 μmol/L）組，每組設置3個復孔，并設置細胞最大酶活性孔（對照組中正常培養細胞加入試劑盒提供的LDH釋放劑）。HBA組與陽性組細胞加入含相應濃度藥物的完全培養基，對照組加入完全培養基。24 h后，對照組更換新鮮完全培養基，其余各組加入含10 mmol/L 連二亞硫酸鈉（Na2S2O4，常用細胞缺氧誘導劑）的無糖培養基處理細胞2 h進行氧糖剝奪[13]，隨后更換為DMEM高糖培養基復氧2 h建立OGD/R細胞模型。細胞死亡率的檢測根據LDH檢測試劑盒說明書使用酶標儀于490 nm波長下檢測A，計算細胞死亡率：細胞死亡率（%）＝（A給藥組－A對照組）/（A細胞最大酶活性孔－A對照組）×100%。在實驗過程中使用倒置顯微鏡觀察各組HT22細胞的形態并拍攝圖片。結果顯示，模型組細胞死亡率為（16.66±1.57）%，陽性對照組和不同濃度HBA（25、50、100 μmol/L）組的細胞死亡率均顯著低于模型組（P＜0.05），并呈現劑量依賴性，細胞死亡率分別為（3.34±0.29）% 、（12.79±0.57）% 、（10.22±0.17）% 、（4.39±0.24）%，其中100 μmol/L HBA保護作用最佳。細胞形態學觀察如圖4所示，模型組出現大量細胞皺縮，細胞突起減少，胞質凝聚；與模型組比較，HBA組細胞的形態得到改善并呈現劑量依賴性。

2.5.3 HBA對OGD/R損傷HT22細胞ATP、ROS水平的影響 按“2.5.2”項下方法進行細胞分組及處理，每組設置5個復孔。根據試劑盒說明書，測定ATP、ROS水平，使用酶標儀于激發波長488 nm、發射波長525 nm處檢測。結果顯示，與對照組相比，模型組細胞中ATP水平顯著降低、ROS水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組和不同濃度HBA組ATP水平（除 HBA 25 μmol/L組外）均顯著升高、ROS水平均顯著降低（P＜0.05）。結果見表4。

表4 各組細胞ATP、ROS水平比較（±s，n＝5）

表4 各組細胞ATP、ROS水平比較（±s，n＝5）

a：與對照組相比，P＜0.05；b：與模型組相比，P＜0.05

組別對照組模型組陽性對照組ATP 288 996±3 894 115 843±2 410a 155 414±1 992b ROS 2.93±0.02 10.20±0.33a 3.72±0.07b組別HBA25 μmol/L組HBA50 μmol/L組HBA100 μmol/L組ATP 113 991±3 091 181 939±5 081b 142 537±1 742b ROS 8.98±0.12b 8.23±0.09b 6.22±0.08b

2.5.4 HBA對OGD/R損傷HT22細胞線粒體功能的影響 按“2.5.2”項下方法進行細胞分組及處理，每組設置5個復孔。參照MPTP檢測試劑盒使用說明書操作，使用酶標儀以激發光波長494 nm、發射光波長517 nm進行檢測，評估MPTP開放程度，熒光越強，開放程度越低。參照“2.1.3”項下方法檢測MMP。結果顯示，與對照組相比，模型組細胞中MMP水平顯著降低，MPTP開放程度顯著變大（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組和不同濃度HBA組MMP水平顯著升高，MPTP開放程度（除 HBA25 μmol/L組外）顯著降低（P＜0.05）。結果見表5。

表5 各組細胞MMP、MPTP比較（±s，n＝5）

表5 各組細胞MMP、MPTP比較（±s，n＝5）

a：與對照組相比，P＜0.05；b：與模型組相比，P＜0.05

組別對照組模型組陽性對照組MPTP熒光值139.8±10.54 169.4±4.40b 194.2±15.43b MMP 14.82±0.52 3.60±0.06a 10.95±0.22b MPTP熒光值258.4±13.03 127.8±10.33a 225.4±13.92b組別HBA25 μmol/L組HBA50 μmol/L組HBA100 μmol/L組MMP 5.22±0.08b 9.60±0.25b 10.40±0.21b

3 討論

基于超濾離心-HPLC法獲取線粒體靶向化合物的關鍵是獲得大量具有活性和高純度的線粒體。本研究采取線粒體提取試劑盒提取高純度線粒體，用線粒體專屬染料健那綠與中性紅評估線粒體純度[14]。采用CCCP處理、檢測MMP的方法來確定線粒體活性[15]。結果顯示提取的線粒體純度高、活性強，可以用于進一步研究。

本研究采用阿莫西林、阿司匹林、尼莫地平3種成分混合標準溶液，來檢驗超濾離心-HPLC法獲取線粒體靶向化合物的可行性。實驗結果顯示，3種成分混合標準溶液中尼莫地平對照組峰面積顯著增強，而阿司匹林和阿莫西林條件下均未見對照組峰面積增強。且進一步通過尼莫地平標準溶液結合線粒體，結果與混合標準溶液結果一致，尼莫地平對照組峰面積顯著增強，表明超濾離心-HPLC法具有分離和識別能力，可用于獲取線粒體靶向化合物。

線粒體質量濃度、樣品質量濃度和孵育時間是影響本研究的關鍵因素。首先，實驗的靈敏度由線粒體質量濃度決定，質量濃度越高，靈敏度越高，但當線粒體質量濃度大于1.0 g/L會堵塞超濾膜[7]。所以本研究選擇1.0 g/L進行實驗。其次，對天麻提取物的3個質量濃度（150、300、600 g/L）進行檢測，以明確化合物與線粒體結合的最佳質量濃度，并探討隨化合物質量濃度的增加，與線粒體結合的藥物量是否隨之增加。結果顯示，天麻提取物達到300、600 g/L時，有4個峰ΔP＞20%，但其中質量濃度為600 g/L時與線粒體結合成分含量更高。因此，本研究選取600 g/L進行后續研究。最后，對孵育時間（30、60、90 min）進行篩選。當孵育時間較短時，可能會錯過與線粒體松散結合的活性分子，而較長的孵育時間可能會導致結合分子的結構變化。研究結果表明，活性分子在孵育時間為60 min時與線粒體結合化合物的數量最多，達到4個。以上研究結果表明，藥物質量濃度為600 g/L、孵育時間為60 min時，與失活線粒體組相比，純化線粒體組4個峰（P1～P4）的峰面積顯著增強（ΔP＞20%）。這表明4個峰（P1～P4）與活性線粒體具有特異性結合。通過與對照品對比后，鑒定出結合量較大的2個成分（P2為HBA，P3為HBD），并且這2個成分可提高離體MMP，提示P2、P3具有線粒體保護作用。

由于HBA提高MMP的作用強于HBD，而且2020年版《中國藥典》中把HBA列入天麻質量控制成分之一，本研究通過HT22細胞進一步驗證HBA的神經保護作用[13]。本研究結果顯示，OGD/R可引起神經細胞結構損傷和壞死，而HBA能明顯改善這一情況，與之前的報道一致[16]。在本研究中，HBA預處理可以減輕OGD/R誘導的神經細胞病理改變，減少細胞的死亡率，起到神經保護作用。研究發現，當細胞OGD/R時產生大量ROS，線粒體容易受到氧化損傷，線粒體功能發生障礙導致ATP水平降低，MMP去極化，MPTP開放異常并釋放細胞凋亡因子，最終導致細胞凋亡[7]。本研究結果顯示，通過HBA處理逆轉了OGD/R細胞模型中ROS、ATP、MPTP、MMP的異常變化，表明HBA可通過減少氧化損傷，保護線粒體功能，從而發揮神經保護作用。

綜上所述，本實驗成功從天麻中獲取2個腦線粒體靶向化合物（HBA、HBD），并且驗證了結合率最高的HBA對OGD/R誘導的神經細胞損傷有明顯的保護作用，可能是通過線粒體靶向治療而發揮神經保護作用。