蛇床子素對糖尿病腎病模型小鼠腎間質纖維化的預防作用Δ

黃倩，鄭丹丹，黃秋虹，施子祿（.泉州醫學高等專科學校基礎醫學部生理教研室，福建 泉州 3600；.福建醫科大學附屬泉州第一醫院腎內科，福建 泉州 36000）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是一種糖尿病引起的以腎間質發生纖維化為核心病理特征的微血管病變，也是導致糖尿病患者康復率低的重要原因之一[1]。已有研究證實，腎小管上皮細胞間充質轉分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是誘導腎間質發生纖維化的關鍵步驟之一[2]。鋅指轉錄因子1（Snail family transcriptional repressor 1，Snail1）和卵泡抑素樣蛋白1（follistatin-like protein 1，Fstl1）、蛋白激酶B（pro‐tein kinase B，Akt）均在EMT中發揮重要作用[3－4]。

香豆素類衍生物蛇床子素（osthole，OST）廣泛分布于傘形科植物蛇床子中，在抗心肌纖維化[5]和肝臟纖維化[6]方面均有一定作用。本課題組前期研究發現，OST能有效預防單側輸尿管梗阻模型小鼠的腎間質纖維化[7]，在此基礎上，OST在其他腎損傷中，特別是對DN腎間質纖維化是否仍有預防作用值得進一步研究。本研究選用OST對DN模型小鼠進行預防性給藥，觀察其對小鼠腎間質纖維化的影響，并對Fstl1/Akt/Snail1通路中的關鍵蛋白進行測定，旨在為臨床篩選DN防治藥物提供新的思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括逸智F型羅氏逸智血糖儀（德國羅氏診斷有限公司），5810R型高速冷凍式離心機（德國Eppendorf公司），UVmini-1240型紫外-可見分光光度計（日本島津國際貿易上海有限公司），VE-180型垂直電泳儀和Tanon-3500型全自動凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

OST（純度≥95%，批號78889）和鏈脲佐菌素（純度≥98%，批號S0130）均購于美國Sigma公司；肌酐檢測試劑盒和尿素氮檢測試劑盒（批號分別為700460-2、SKT-213-192）均購于武漢艾美捷科技有限公司；尿蛋白檢測試劑盒（批號GD-VN9853）購于上海古朵生物科技有限公司；Masson三色染色試劑盒（批號16071）購于上海源葉生物科技有限公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）免疫組化檢測試劑盒（批號GOY-Y1007）購于上海谷研實業有限公司；波形蛋白（vimentin）免疫組化檢測試劑盒（批號US-132）購于上海研生生化試劑有限公司；兔抗大鼠Fstl1、Snail1、vimentin、Akt、磷酸化Akt（p-Akt）、β-肌動蛋白（β-actin）多克隆抗體和小鼠抗大鼠E-cadherin單克隆抗體（批號分別為ab232777、ab82846、ab137321、ab235958、ab8932、ab8227、ab76055）均購于英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔、小鼠免疫球蛋白G二抗（批號分別為A0208、A0216）均購于上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均為實驗室常用規格，水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

SPF級健康C57BL/6小鼠共50只，雄性，體質量20～24 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，生產許可證號為SCXK（滬）2017-0005。所有小鼠用標準顆粒飼料飼養，自由飲水，燈光照射12 h模擬晝夜交替循環。本實驗在泉州醫學高等專科學校動物實驗中心進行。

2 方法

2.1 DN造模

參考相關文獻[8－9]中的方法，先建立糖尿病小鼠模型，成功后繼續喂養12周，建立DN小鼠模型。具體操作如下：取40只小鼠按120 mg/kg一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素（溶解于臨時配制的pH4.5、0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，無菌），自由飲食飲水，3 d后禁食6 h，斷尾取血測空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L判定為糖尿病造模成功。糖尿病模型小鼠繼續喂養12周，測定24 h尿蛋白＞30 mg，則認為DN造模成功。

2.2 分組與給藥

將造模成功的糖尿病模型小鼠隨機分為模型組和OST低、中、高劑量（20、40、80 mg/kg）組[7]，每組10只。另取10只未造模小鼠為正常對照組。各組小鼠于糖尿病造模成功后開始干預（灌胃處理），每日1次，持續12周。正常對照組和模型組小鼠僅灌胃等體積溶劑，OST各劑量組小鼠灌胃相應劑量的OST，所有溶劑均為0.2%羧甲基纖維素鈉溶液。灌胃12周內小鼠無死亡。

2.3 生化指標的測定

各組小鼠末次灌胃24 h后，禁食6 h后斷尾取血測空腹血糖；收集小鼠24 h尿液和血清，按照相應試劑盒說明書測定24 h尿蛋白、血肌酐（serum creatinine，Scr）和尿素氮水平。

2.4 腎間質纖維化的觀察

收集各小鼠24 h尿液后，處死小鼠，取相同部位的腎皮質，常規石蠟包埋、切片（3 μm），行Masson染色，光鏡下觀察腎間質區域膠原纖維的沉積情況，使用Image J軟件對膠原纖維（染成藍色）進行定量分析。

2.5 腎皮質中E-cadherin和vimentin表達水平的檢測

取各組小鼠腎皮質，經固定、脫水、石蠟包埋、切片（3 μm）后，按免疫組化檢測試劑盒說明書進行腎皮質E-cadherin、vimentin染色，光鏡下觀察腎皮質中E-cadherin和vimentin的分布并對結果進行量化。每張切片任選5個視野拍照，以胞質內出現棕黃色或黃色顆粒且強度大于非特異性背景為陽性表達，使用Image Pro-Plus 6軟件測量陽性表達區域的平均光密度（IOD）。

2.6 腎皮質中 Fstl1、Akt、p-Akt和 Snail1 蛋白表達的檢測

采用Western blot法進行檢測。取各組小鼠腎皮質100 mg，適當研磨后制成勻漿，12 000 r/min離心30 min后收集上清。采用二喹啉甲酸法檢測蛋白濃度，加熱煮沸變性5 min，按每孔100 μg蛋白樣品上樣，隨后電泳分離蛋白、轉膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；洗膜后加入相應一抗（Fstl1 的質量濃度為 1 μg/mL，Akt、p-Akt、Snail1和β-actin的稀釋比例分別為1∶3 000、1∶5 000、1∶500、1∶1 000），4 ℃過夜孵育；洗膜后加入相應二抗（稀釋比例均為1∶2 000），室溫孵育1 h，顯影、成像。使用Image J軟件分析蛋白條帶的光密度，以目標蛋白與內參β-actin的光密度比值反映目標蛋白的表達水平，以p-Akt與Akt的光密度比值反映Akt的磷酸化水平，并進行歸一化處理。

2.7 統計學方法

應用SPSS 17.0軟件進行數據分析，計量資料以±s描述，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 OST對小鼠生化指標的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、Scr和尿素氮水平均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，OST各劑量組小鼠空腹血糖、24 h尿蛋白、Scr和尿素氮水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），結果見表1。

表1 OST對小鼠生化指標的影響（±s，n＝10）

表1 OST對小鼠生化指標的影響（±s，n＝10）

a：與正常對照組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01

組別正常對照組模型組OST低劑量組OST中劑量組OST高劑量組空腹血糖/（mmol/L）5.45±1.23 27.43±3.64a 24.12±2.28b 20.27±2.63b 17.73±1.96c 24 h尿蛋白/（μg/d）10.78±0.23 32.21±1.65a 28.75±1.12b 26.65±1.33b 21.79±1.09c Scr/（μmol/L）7.50±1.28 22.60±3.62a 17.54±2.47b 14.91±1.94b 10.53±1.85c尿素氮/（mmol/L）12.43±1.42 34.15±4.62a 29.86±3.75b 26.72±3.21b 20.53±3.05c

3.2 OST對小鼠腎間質纖維化的影響

正常對照組小鼠腎小管上皮細胞排列整齊、結構清晰，腎臟組織內極少有膠原纖維分布，藍色較淡。模型組小鼠腎間質膠原纖維增多，間質內有明顯藍色深染的膠原纖維，呈灶狀分布，且膠原纖維沉積占比顯著高于正常對照組（P＜0.01）。與模型組比較，OST各劑量組小鼠腎間質藍色深染的膠原纖維沉積占比均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖1。

3.3 OST對小鼠腎皮質中E-cadherin和vimentin表達水平的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腎皮質中E-cadherin表達水平顯著降低（P＜0.01），vimentin表達水平顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，OST各劑量組小鼠腎皮質中E-cadherin表達水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），vimentin表達水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖2、圖3。

3.4 OST對小鼠腎皮質中Fstl1/Akt/Snail1通路關鍵蛋白的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腎皮質中Fstl1、Snail1蛋白表達水平和p-Akt/Akt比值均顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，OST各劑量組小鼠腎皮質中Fstl1、Snail1蛋白表達水平和p-Akt/Akt比值均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。結果見圖4。

4 討論

文獻報道，OST可以降低血糖、改善胰腺功能、緩解腎小球基底膜的增生、增強抗氧化酶活性[10]。OST可能是潛在的抗DN候選藥物。基于此，本研究考察OST預防性用藥對DN模型小鼠的影響，結果顯示，OST可以有效降低DN模型小鼠的空腹血糖、24 h尿蛋白、Scr和尿素氮水平，提示OST具有降血糖作用和保護腎功能的作用。Masson染色結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠腎間質區域內膠原纖維明顯增多，出現典型的腎間質纖維化病理變化，而OST預防性用藥可明顯減少DN模型小鼠腎間質區域膠原纖維的沉積，延緩腎間質纖維化的進程。

EMT是誘導DN腎間質纖維化關鍵步驟之一，為了驗證OST對腎間質纖維化的作用，本研究對EMT標志蛋白E-cadherin和vimentin的表達進行了檢測。結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠腎皮質中E-cadherin表達顯著下調，vimentin表達顯著上調；OST預防性用藥12周后，E-cadherin表達顯著上調，vimentin表達顯著下調，提示OST預防性用藥可有效延緩DN模型小鼠腎小管上皮細胞的EMT和腎間質纖維化。

轉化生長因子 β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是啟動腎小管EMT的重要細胞介質[11]。減少TGF-β1或抑制其下游信號的表達可減少細胞外基質的沉積和改善實驗性腎損傷動物模型中纖維化的進展[12]。Akt蛋白是TGF-β1信號通路的重要下游蛋白和信號分子[13]。Snail1是影響腎小管上皮細胞黏附性的重要信號轉導因子，可直接下調E-cadherin的表達，參與腎小管上皮細胞的表型轉化[14]。Fstl1是由TGF-β1誘導產生的一種新型促纖維化因子，高表達于心、腎、肺和小腸等多個器官中[15]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，模型組小鼠腎皮質中Fstl1、Snail1蛋白表達水平和p-Akt/Akt比值均異常升高，表明Fstl1/Akt/Snail1通路參與了DN狀態下腎間質纖維化的發生；OST預防性用藥12周后，Fstl1、Snail1蛋白表達水平和p-Akt/Akt比值均顯著降低，提示OST預防性用藥可以抑制DN狀態下小鼠腎皮質中Fstl1/Akt/Snail1通路的激活。

綜上所述，OST預防性用藥可有效降低DN模型小鼠的空腹血糖，保護其腎功能，抑制腎小管EMT，延緩腎間質纖維化進程，其作用機制可能與抑制Fstl1/Akt/Snail1通路有關。