芥子堿硫氰酸鹽可溶性微針穴位給藥抗支氣管哮喘的藥效學研究Δ

石佳楠，宋信莉，劉興德，陳歡歡，楊小雙，楊勝磊，沈 麗，萬開龍（貴州中醫藥大學藥學院/國家苗藥工程技術研究中心/貴州中藥炮制與制劑工程技術研究中心，貴陽 550025）

支氣管哮喘（bronchial asthma，BA）是一種受多種細胞和細胞成分影響的下呼吸道異質性慢性炎癥性疾病[1]。BA發病因素較多，主要包括感染、粉塵、自身免疫等，可反復出現喘息、咳嗽、胸悶和呼吸急促等癥狀，具有病程長、癥狀易反復、難以根治的特點[2]。若該疾病反復發作，極易引發心血管疾病及肺疾病等嚴重并發癥，對患者健康造成較大的威脅，對社會造成巨大的疾病負擔，因此，該疾病也被世界衛生組織（WHO）列為四大頑癥之一[3]。目前，現代醫學治療BA主要以藥物為主，如支氣管β2腎上腺素受體激動劑、抗膽堿藥、茶堿類和激素類藥物等。這些藥物雖然能在一定程度上緩解病情，但難以從整體上實現根本性治療，且相關研究發現化學藥對哮喘的控制效果尚不理想，仍易反復發作[4―5]。

白芥子始載于《名醫別錄》，被列為上品，其味辛，性溫，無毒，入肺經，具有溫肺豁痰利氣、散結通絡止痛之功[6]。有研究發現，將白芥子于穴位外用可有效治療BA[7―9]。現代研究表明，白芥子中的芥子堿是抗BA的主要活性成分，其主要存在形式為芥子堿硫氰酸鹽（sinapine thiocyanate，ST）[10]。可溶性微針（dissoluble microneedle，DMN）是一種新型透皮給藥制劑，可突破角質層障礙，使藥物在真皮層中釋放，從而解決傳統穴位外用時大分子化合物或親水性化合物難以透過角質層的問題[11]。基于此，本課題組將ST與DMN技術相結合，制備芥子堿硫氰酸鹽可溶性微針（ST-DMN），并結合網絡藥理學方法和分子對接技術，篩選ST治療哮喘的作用靶點，然后將ST-DMN穴位給藥BA模型大鼠進行動物實驗驗證，以期為后續ST-DMN的開發及臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有微針模具（臺州薇凱生物科技有限公司）、AUY220型萬分之一電子天平（日本Shi‐madzu公司）、AE/240型十萬分之一電子天平（瑞士Met‐tler Toledo公司）、TD5A-120型臺式低速離心機（常州金壇良友儀器有限公司）、KQ-500DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、SPX-70BⅢ型生化培養箱[菲斯福儀器（河北）有限公司]、Multiskan FC型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）、402A1型超聲霧化器（上海魚躍醫療設備有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

ST-DMN由本課題組自制；白芥子散敷貼劑（批號20210720）購自貴州中醫藥大學第一附屬醫院；氫氧化鋁佐劑（批號77161）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；卵清蛋白（批號MB1815）購自大連美侖生物技術有限公司；戊巴比妥鈉（批號P3761）購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液（批號20210911）購自北京索萊寶科技有限公司；前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2）、基質金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、白細胞介素 2（interleukin-2，IL-2）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為E-EL-R3021、E-EL-R0792c、E-EL-R0013c）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；聚乙烯吡咯烷酮K30（批號BSF190822）購自合肥巴斯夫生物科技有限公司；硫酸軟骨素（批號20191028）購自江蘇鑫瑞生物科技有限公司；聚乙烯醇（批號P21501215）購自山東優索化工科技有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，體質量為（220±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物生產許可證號為SCXK（京）2019-0008。本研究所有動物實驗均遵循貴州中醫藥大學有關實驗動物管理和使用的規定，且均符合3R原則。

2 方法

2.1 基于網絡藥理學及分子對接技術篩選ST抗BA的作用靶點

2.1.1 獲取ST靶點 將ST的“sdf”結構輸入Pharm‐Mapper（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫中進行初步的靶點預測，再將這2個數據庫得到的靶點取并集，然后將取并集后的靶點（即ST的預測靶點）輸入UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）中獲取標準化基因名。

2.1.2 獲取BA靶點 將“asthma”“bronchial asthma”分別輸入TTD（http：//db.idrblab.net/web/search/combination）、Genecard（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/）、Drug Bank（https：//www.drugbank.com/）、Disgenet（https：//www.disgenet.org/search）數據庫并以相關性分數的中位值進行篩選，將篩選的靶點（即BA疾病靶點）輸入UniProt數據庫中獲取標準化基因名。

2.1.3 篩選ST與BA的共同靶點 將ST的靶點與BA的靶點分別導入Venny在線網站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）繪制韋恩圖，取交集后，即為ST與BA的共同靶點。

2.1.4 構建ST與BA的蛋白相互作用網絡 將ST和BA的共同靶點導入STRING數據庫（https：//cn.stringdb.org/），設置物種為“homo sapiens”，置信度為“medium confidence≥0.4”，繪制蛋白相互作用（protein-protein in‐teraction，PPI）網絡，然后利用Cytoscape 3.9.0軟件根據degree值大小篩選關鍵靶點，從而確定ST抗BA的核心靶點。

2.1.5 ST與核心靶點的分子對接 將PPI網絡中degree值排名前3位的核心靶點導入PDB數據庫（https：//www.pdbus.org/），下載核心靶點“pdb”格式文件。在TCMSP數據庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中下載ST的“mol2”文件，然后采用Pymol、AutoDock軟件將核心靶點和ST進行去水、加氫等預處理，再通過AutoDock軟件進行分子對接和結合能的計算。

2.2 ST-DMN抗BA的藥效學實驗

根據網絡藥理學方法及分子對接技術篩選的ST抗BA核心靶點進行藥效學驗證。

2.2.1 ST-DMN的制備 根據本課題組前期實驗方法制備ST-DMN[12]。將硫酸軟骨素-聚乙烯吡咯烷酮K30（1∶1，m/m）作為針尖材料充分溶脹于ST水溶液（10 mg/mL）中，然后澆筑在微針模具凹槽表面，再以4 000 r/min離心10 min使其完全填充；刮去多余基質，于干燥器中干燥30 min，作為針尖層；將以ST水溶液充分溶脹的15%聚乙烯醇作為背襯材料，澆筑于上述已填充好針尖層的模具中，以4 000 r/min離心10 min后，于干燥器中干燥24 h，脫模，即得ST載藥量為1 mg/片的ST-DMN。同法制備不載藥的空白微針。

2.2.2 分組、造模與給藥 將30只大鼠隨機分為空白對照組、模型對照組、空白微針組、白芥子散敷貼組（陽性對照組）、ST-DMN組，每組6只。各組大鼠適應性喂養1周后，除空白對照組腹腔注射生理鹽水外，其余各組大鼠分別于第1、8天腹腔注射10%卵清蛋白（含氫氧化鋁佐劑）1 mL致敏，于第15天開始每天霧化吸入1%卵清蛋白，每次30 min，持續4周進行激發哮喘，以復制BA模型[13]。當大鼠出現咳嗽、呼吸急促、點頭運動、抓耳撓腮等行為時，表明造模成功。各組大鼠于每次霧化后進行給藥：空白對照組不處理；模型對照組于大鼠肺俞穴和大椎穴脫毛處理后涂抹生理鹽水；空白微針組、白芥子散敷貼組、ST-DMN組大鼠于相同穴位分別給予空白微針、白芥子散（涂抹面積為1 cm2，給藥量為1.5 g）、STDMN（2個穴位共給了3片）處理，每天1次，連續28 d。

2.2.3 各組大鼠一般癥狀觀察及體質量測定 分別在造模前1 d和造模后第7、14、21、28、35、42天記錄各組大鼠咳嗽、打噴嚏、點頭運動、抓耳撓腮、呼吸加快、毛發色澤的情況，并測量體質量。

2.2.4 樣本采集 末次給藥后第2天，將大鼠麻醉后進行腹主動脈采血；血樣靜置1 h后，以3 000 r/min離心10 min，取上層血清，置于－80 ℃冰箱中保存備用。采血完成后，將各組大鼠氣管暴露，用一次性注射器將2 mL磷酸鹽緩沖液緩慢注入氣管，用手輕輕按揉大鼠肺部，待充分灌洗后回抽緩沖液，反復進行3次，即得支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。將BALF以3 000 r/min離心10 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中保存備用。以上操作完成后，處死大鼠，取肺組織，剪取右肺前葉，裝入EP管中，置于－80 ℃冰箱中保存備用；取左肺，以4%多聚甲醛溶液固定備用。

2.2.5 大鼠肺組織病理形態學觀察 取“2.2.4”項下各組大鼠固定于4%多聚甲醛溶液中的左肺組織，經乙醇脫水、石蠟包埋、切片后，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后置于光學顯微鏡下觀察肺組織病理形態學變化。

2.2.6 大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平的測定 采用ELISA法進行測定。取“2.2.4”項下各組大鼠血清、BALF和肺組織，嚴格按照試劑盒說明書方法檢測其中PTGS2、MMP-9、IL-2的水平。

2.3 統計學方法

采用SPSS 26.0軟件進行統計分析，計量資料采用±s表示。各組間比較采用單因素方差分析；組間兩兩比較，方差齊時采用LSD-t檢驗，方差不齊時采用Dun‐nett’s T3檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 ST抗BA的作用靶點篩選結果

3.1.1 ST靶點的篩選結果 本研究在PharmMapper數據庫中得到ST靶點231個，在Swiss Target Prediction數據庫中得到ST靶點100個，取并集后獲得258個ST靶點。

3.1.2 BA靶點的篩選結果 通過TTD、Genecard、OMIM、Drug Bank、Disgenet數據庫對BA靶點進行篩選，刪除重復項后共獲取靶點677個。

3.1.3 ST與BA共同靶點的篩選結果 將ST靶點與BA靶點共同導入Venny在線網站繪制韋恩圖，得到交集靶點70 個。

3.1.4 ST與BA的PPI網絡構建結果 PPI網絡圖（圖1）顯示，核心靶點排名前10位的蛋白分別為PTGS2、MMP-9、IL-2、EGFR（表皮生長因子受體）、HSP90AA1（熱休克蛋白90AA1）、ALB（白蛋白）、CCL5（趨化因子配體5）、MAPK14（絲裂原活化蛋白激酶14）、MTOR（雷帕霉素靶蛋白）、PGR（孕激素受體）。

3.1.5 ST與核心靶點的分子對接結果 將PPI網絡圖中degree值排名前3位的蛋白作為核心靶點，進行ST與核心靶點的分子對接。結果顯示，ST與PTGS2、MMP-9、IL-2對接的結合能分別為－19.30、－22.44、－16.24 kJ/mol，提示ST與上述3種蛋白具有較好的結合活性[14]。

3.2 ST-DMN抗BA的藥效學實驗結果

3.2.1 大鼠一般癥狀觀察及體質量測定結果 空白對照組大鼠狀態良好，毛色光澤，行為敏捷，呼吸平穩，體質量明顯增加。模型對照組和空白微針組大鼠出現咳嗽、呼吸急促、點頭運動、抓耳撓腮現象，嚴重者出現呼吸減慢或節律不齊、四肢癱軟、行動遲緩、體質量明顯減輕、毛色失去光澤、反應遲鈍現象。白芥子散敷貼組和ST-DMN組大鼠咳嗽減輕，毛色恢復，行為靈敏，呼吸平穩，體質量增加。

3.2.2 大鼠肺組織病理形態學觀察結果 空白對照組大鼠肺組織各級支氣管結構正常，肺泡上皮細胞正常，肺間質未見明顯纖維組織增生和炎癥細胞浸潤。模型對照組和空白微針組大鼠肺泡隔明顯增厚，肺泡上皮細胞增生，細胞成分增多，肺間質可見炎癥細胞浸潤。與模型對照組比較，白芥子散敷貼組和ST-DMN組大鼠肺組織結構、肺泡上皮細胞、肺間質炎癥細胞浸潤等情況均得到不同程度的改善。結果見圖2。

3.2.3 大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平的測定結果 與空白對照組比較，模型對照組和空白微針組大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型對照組比較，白芥子散敷貼組和ST-DMN組大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。白芥子散敷貼組和ST-DMN組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；空白微針組與模型對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

表1 各組大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平的測定結果（±s，n＝6，pg/mL）

表1 各組大鼠血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平的測定結果（±s，n＝6，pg/mL）

a：與空白對照組比較，P＜0.01；b：與空白對照組比較，P＜0.05；c：與模型對照組比較，P＜0.01；d：與模型對照組比較，P＜0.05

組別空白對照組模型對照組空白微針組白芥子散敷貼組ST-DMN組PTGS2 MMP-9 IL-2肺組織79.91±12.42 133.72±25.08b 117.97±27.87b 81.66±16.40d 86.15±20.47d血清749.83±71.40 2 402.08±220.71a 2 185.86±140.91a 1 194.49±109.60c 1 434.82±127.00c BALF 1 026.27±147.86 3 020.88±259.50a 2 684.92±210.92a 1 567.70±245.99c 2 041.84±267.62c肺組織1 956.47±201.54 7 430.86±754.64a 6 430.90±705.63a 3 641.04±521.86c 4 505.17±713.35c血清52.74±8.55 212.40±25.05a 177.96±17.81a 93.11±9.94c 112.43±10.54c BALF 132.75±28.77 306.75±37.61a 268.73±27.31a 185.40±24.96c 214.77±28.43c肺組織151.19±24.78 399.94±30.20a 374.86±20.09a 254.86±34.39c 298.66±29.81c血清55.41±9.16 93.40±10.79a 79.70±6.78a 60.34±7.00c 65.81±6.17c BALF 79.91±12.42 133.72±25.08b 117.97±27.87b 81.66±16.40d 86.15±20.47d

4 討論

本研究采用網絡藥理學方法和分子對接技術篩選ST抗BA的作用靶點，結果發現，ST抗BA的核心靶點主要包括PTGS2、MMP-9、IL-2、EGFR、HSP90AA1等。其中，PTGS2也稱為環氧合酶2，是一種炎癥誘導酶，是花生四烯酸轉化為前列腺素過程中的關鍵酶，主要參與炎癥反應[15]。研究表明，PTGS2的激活可以導致哮喘的發生，抑制PTGS2可通過核因子κB信號通路發揮抗炎、抗哮喘作用[16]。MMP-9是MMP家族的成員，主要由巨噬細胞和中性粒細胞產生，也可由上皮細胞、肥大細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞產生，是氣道壁重塑和細胞外基質代謝的關鍵媒介[17―18]。IL-2主要由活化的T細胞產生，主要功能是促進淋巴細胞的生長、增殖和分化，在免疫應答中發揮重要作用[19]。IL-2不僅能促進體內免疫球蛋白E的合成，還能誘導嗜酸性粒細胞產生大量過氧化物，并使嗜酸性粒細胞和淋巴細胞向炎癥部位趨化，從而破壞支氣管上皮，加重哮喘[20]。由此可知，本研究篩選出的3個核心靶點（PTGS2、MMP-9、IL-2）與BA均有著極大的關聯性，ST抗BA的作用可能與上述3個靶點有關。進一步通過分子對接發現，ST與上述3個靶點之間的結合能均遠小于－5.0 kJ/mol，表明ST與這3個靶點的結合能力較好。

基于網絡藥理學和分子對接的結果，本課題組進一步通過動物實驗探討ST-DMN穴位給藥抗BA的藥效作用。結果發現，經ST-DMN干預后，大鼠咳嗽減輕，毛色恢復，行為靈敏，呼吸平穩，體質量增加，肺組織結構、肺泡上皮細胞、肺間質炎癥細胞浸潤等病理變化均得到不同程度的改善，血清、BALF和肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平均顯著降低，且效果與陽性對照組相當。

綜上所述，ST-DMN穴位給藥抗BA的效果良好，其作用機制可能與下調血清、BALF、肺組織中PTGS2、MMP-9、IL-2水平有關。