藤黃健骨膠囊質控成分定量分析方法建立及潛在作用機制預測Δ

周霖，王肖輝，孫志薛連平金建文，武婧，李曉靜鄭天元張曉堅（.鄭州大學第一附屬醫院藥學部，鄭州 50052；2.中南大學資源加工與生物工程學院，長沙 0000；.鄭州大學第一附屬醫院超聲科，鄭州 50052；.陜西麗彩藥業有限公司，陜西 咸陽 72000）

藤黃健骨膠囊的組方藥材包括骨碎補、淫羊藿、鹿銜草、肉蓯蓉、熟地黃、雞血藤和萊菔子，是在中醫藥理論的指導下經現代工藝提取加工而成的中藥復方制劑[1]，具有補腎、活血、止痛等功效，常用于臨床治療骨質疏松、關節炎等骨質性疾病以及風濕類疾病，療效確切且應用廣泛[2―4]。

質量穩定性是中藥應用安全、有效的前提，然而大多數標準僅對中藥及其復方中個別含量較大的成分進行了規定，忽略了其他成分對質量的影響，致使無法從整體上有效控制中藥及復方的質量[5―7]。本課題組前期采用指紋圖譜結合化學計量學方法對20批藤黃健骨膠囊的質量穩定性進行了考察，經主成分分析發現，其整體質量較為穩定，但存在明顯的批間差異；進一步的偏最小二乘法-判別分析結果表明，對藥物質量差異影響較大的差異性成分有琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素和原兒茶酸。前期研究雖為藤黃健骨膠囊的質控提升奠定了基礎，但并未對上述差異性成分的含量進行準確測定，無法實現質控標準的整體量化。此外，在藤黃健骨膠囊治療疾病時，上述差異性成分是如何相互配合以及通過哪些重要通路治療相關疾病的，也是當前尚未解決的問題。

因此，為解決以上關鍵科學問題，本研究擬采用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）法建立快速、科學、準確的一級全掃描定量分析方法，對藤黃健骨膠囊中的7種主要差異性成分（以下稱“質控成分”）進行含量測定；同時，結合網絡藥理學對各質控成分的關鍵作用靶點和信號通路進行分析，挖掘各成分在骨質疏松、關節炎等骨質性疾病以及風濕類疾病治療中的潛在作用，為全面闡明藤黃健骨膠囊質控成分的科學內涵提供新思路，同時為進一步提升其質控標準奠定基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Q-Exactive型超高效液相色譜-質譜聯用系統（美國Thermo Fisher Scientific公司）、New Classic MS型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、BX7200HP型臺式超聲波清洗器（上海新苗醫療器械制造有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

對照品琥珀酸（批號MUST-17030502）、金絲桃苷（批號MUST-16032113）、沒食子酸（批號MUST-18032801）、山柰酚（批號MUST-16032801）、柚皮苷（批號MUST-18050808）、柚皮素（批號MUST-16032406）和原兒茶酸（批號MUST-16032112）均購自成都曼思特生物科技有限公司，純度均大于99%。甲酸、乙腈、甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

藤黃健骨膠囊（批號分別為170401、170901、170802、180108、180504、180106、170703、170407、170408、170103、170505、170702、170902、180408、170701、170201、180107、170202、170903、180104，編號為S1～S20，規格為每粒裝0.25 g）均購自麗彩甘肅西峰制藥有限公司。

2 方法與結果

2.1 質控成分的定量分析

2.1.1 混合對照品儲備液的制備 分別精密稱取琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸對照品適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、原兒茶酸質量濃度均為100 μg/mL，山柰酚、柚皮素質量濃度均為20 μg/mL，柚皮苷質量濃度為1 000 μg/mL的單一對照品母液。量取各單一對照品母液適量，加甲醇定容至1 mL，制得琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸質量濃度分別為20.45、6.07、10.93、0.55、52.66、0.50、19.47 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取藤黃健骨膠囊內容物1.0 g，置于錐形瓶中，加入甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲（功率200 W，頻率50 kHz）輔助溶解20 min，放冷后，再次稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.1.3 色譜條件與質譜條件 （1）色譜條件：以ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）為色譜柱，乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～1.5 min，5%A；1.5～3.0 min，5%A～20%A；3.0～7.0 min，20%A～100%A；7.0～10.0 min，100%A）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；進樣量為5 μL。

（2）質譜條件：離子源為加熱電噴霧離子源，離子傳輸管溫度為320 ℃；輔助氣溫度為300 ℃，輔助氣流速為10 μL/min；正離子模式下的鞘氣流速為 40 μL/min，噴霧電壓為3.50 kV；負離子模式下的鞘氣流速為38 μL/min，噴霧電壓為2.80 kV；掃描范圍為m/z80～1 200，一級掃描分辨率為70 000。琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸用于定量的一級質譜信息為m/z117.019、463.088、169.014、287.055、579.171、273.075、153.019。

2.1.4 方法學考察 （1）專屬性考察：取“2.1.1”項下混合對照品儲備液、“2.1.2”項下供試品溶液（編號S20）和空白溶液（甲醇），按“2.1.3”項下條件進樣測定。結果顯示，空白溶液對待測成分無干擾，且供試品溶液中7種質控成分的出峰時間與各對照品的出峰時間基本一致，說明方法專屬性較好（見圖1，空白溶液圖略）。

（2）線性關系、定量限和檢測限考察：分別精密量取“2.1.1”項下混合對照品儲備液適量，用甲醇稀釋并定容，依次配制成5個質量濃度的系列工作溶液，其中琥珀酸分別為0.64、1.28、2.56、5.11、10.23 μg/mL，金絲桃苷分別為0.19、0.38、0.76、1.52、3.04 μg/mL，沒食子酸分別為0.34、0.68、1.37、2.73、5.46 μg/mL，山柰酚分別為0.02、0.03、0.07、0.14、0.27 μg/mL，柚皮苷分別為1.65、3.29、6.58、13.17、26.33 μg/mL，柚皮素分別為0.02、0.03、0.06、0.12、0.25 μg/mL，原兒茶酸分別為0.61、1.22、2.43、4.87、9.74 μg/mL。取上述系列工作溶液和混合對照品儲備液，按“2.1.3”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以各待測成分的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，并以信噪比10∶1確定定量限，以信噪比3∶1確定檢測限。結果（表1）顯示，7種質控成分在各自檢測質量濃度范圍內與其峰面積有良好的線性關系（r≥0.999 0），定量限為 0.004～0.901 ng/mL，檢測限為0.001～0.270 ng/mL。

表1 7種質控成分的回歸方程、線性范圍和定量限

（3）精密度考察：取供試品溶液（編號S20），按“2.1.3”項下條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸峰面積的RSD分別為1.89%、1.55%、2.32%、1.56%、2.94%、2.08%、0.40%（n＝6），表明方法精密度良好。

（4）重復性考察：取藤黃健骨膠囊樣品（編號S20），按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6份，按“2.1.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果顯示，琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸含量的RSD分別為1.74%、1.00%、1.14%、1.67%、1.24%、1.94%、1.75%（n＝6），表明方法重復性良好。

（5）穩定性考察：取供試品溶液（編號S20），分別于室溫下放置0、2、6、10、12、24 h時按“2.1.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸峰面積的RSD分別為0.89%、1.50%、1.98%、2.90%、2.53%、1.72%、0.42%（n＝6），表明供試品溶液放置24 h內穩定。

（6）加樣回收率考察：稱取已知含量的藤黃健骨膠囊內容物（編號S20）共9份（每3份為1組），每份約0.5 g。分別按照已知量的50%、100%、150%加入“2.1.1”項下各單一對照品母液適量，加甲醇至50 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸的平均加樣回收率分別為96.77%、98.58%、100.66%、97.99%、98.54%、102.08%、97.61%，RSD分別為2.83%、0.82%、3.42%、3.92%、2.46%、2.28%、3.84%（n＝9），表明方法準確度良好。

（7）樣品含量測定：取20批藤黃健骨膠囊內容物，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液，每批3份，按“2.1.3”項下條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算含量。結果（表2）顯示，20批藤黃健骨膠囊中琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸、山柰酚、柚皮苷、柚皮素、原兒茶酸的平均含量分別為 520.92、67.67、129.48、4.74、397.45、5.66、376.62 μg/g。

表2 7種質控成分的測定結果（n＝3，μg/g）

2.2 質控成分的網絡藥理學分析

2.2.1 作用靶點的獲取 結合PharmMapper數據庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、SwissTarget‐Prediction數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）和STITCH數據庫（http：//stitch.embl.de/）3個權威網站預測琥珀酸（succinic acid）、金絲桃苷（hyperoside）、沒食子酸（gallic acid）、山柰酚（kaempferol）、柚皮苷（narin‐gin）、柚皮素（naringenin）、原兒茶酸（protocatechuic acid）的作用靶點，共獲得662個作用靶點（包括重復靶點）。

2.2.2 “成分-靶點”網絡的構建 基于Cytoscape 3.9.1軟件構建上述7種質控成分的“成分-靶點”相互作用網絡（圖2），刪除重復靶點后，該網絡包含364個節點和662條邊。以中位度值的2倍為篩選條件[8]，獲得62個關鍵作用靶點；頻數較高的靶點基因包括AKT1、TNF、VEGFA、MMP9、PTGS2、CD4、IL2、MMP2等，這些基因與免疫炎癥、疼痛、血管增生以及骨性疾病等密切相關[9―12]。

2.2.3 京都基因和基因組數據庫通路富集分析 將篩選到的62個關鍵作用靶點導入DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行京都基因和基因組數據庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，以P＜0.05為篩選條件，共得到44條通路，經重要性（P值）排序，其中排名前20位的重要通路分別為細胞因子受體相互作用、細胞核因子、腫瘤壞死因子、白細胞介素17、類風濕性關節炎、Toll樣受體等。由此可見，質控成分對應的靶點基因主要富集于炎癥方面的信號通路上，這些通路與骨關節炎、風濕性關節炎等疾病密切相關，與藤黃健骨膠囊的主治疾病契合度較高，表明了本研究對琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸等成分進行定量分析的科學性和合理性。

2.2.4 基因本體生物過程富集分析 將篩選到的62個關鍵作用靶點導入DAVID數據庫進行基因本體（gene ontology，GO）生物過程富集分析，從生物過程、細胞組分和分子功能3個層面進行注釋。GO生物過程富集分析結果顯示，62個關鍵作用靶點主要富集在264個生物過程、69種細胞組分和60種分子功能上。琥珀酸、金絲桃苷、沒食子酸等成分的生物過程主要涉及炎癥反應、信號轉導、蛋白磷酸化等；這些靶點在細胞組分中與胞質、胞膜以及胞核等相關性較大；在分子功能中與酶活性、能量活性、生長因子活性、炎癥因子活性等高度相關。

3 討論

3.1 前處理方法優化

本課題組前期考察了不同提取方法（超聲提取、微波萃取和回流提取）對供試品提取效率的影響。結果發現，當采用超聲提取時，樣品中各質控成分的色譜響應值最高且出峰穩定；而在微波萃取、回流提取條件下，各成分響應值較低，有些成分甚至出現缺失現象，峰形較差，分離效果不佳。其原因可能為藥物中成分對溫度較為敏感，微波萃取和回流提取在溫度過高時可能破壞其結構。因此，本研究采用超聲提取法制備供試品溶液。

3.2 質控成分含量分析

本研究實驗結果表明，不同批次藤黃健骨膠囊中各質控成分的含量具有一定的差異。這可能與藥物生產過程中的關鍵環節有關，如：原藥材的產地不同，原藥材的采收季節不同或者原藥材有效成分的提取方法、工藝差異等。上述因素均有可能導致藥物有效成分含量的變化，提示相關生產廠家在重點環節應優化質控方法及標準，保證原藥材及制劑質量的均一性。

3.3 網絡藥理學分析

本研究基于關鍵質控成分進行了網絡藥理學分析，以期能夠挖掘藤黃健骨膠囊治療疾病的潛在機制。研究結果表明，該制劑中的7種質控成分主要作用于AKT1、TNF、VEGFA等炎癥和血管因子關鍵靶點，從而映射到類風濕性關節炎、Toll樣受體等骨性疾病相關炎癥通路，表明上述質控成分可能是制劑質量控制和療效發揮的關鍵成分。

實驗藥理學表明，山柰酚具有明顯的抗生育、抗骨質疏松、促進成骨細胞增殖和分化以及抗血小板的作用[13―14]，是該藥補腎壯骨、活血功效的重要活性成分之一；柚皮苷及柚皮素具有骨保護和促進骨生長的作用[15]；金絲桃苷具有抗血栓的作用[16]，琥珀酸具有鎮痛的作用[17]；沒食子酸、原兒茶酸具有抗炎的作用[18―19]。以上質控成分在藤黃健骨膠囊治療骨性疾病的過程中可從不同角度發揮著抗炎、緩解疼痛、促進骨形成、防止骨質丟失等骨保護作用。

綜上所述，本研究建立的方法可用于藤黃健骨膠囊質控成分的定量分析，為藥物質量標準的制定和提升奠定了前期基礎；同時，基于網絡藥理學研究發現，藤黃健骨膠囊的7種質控成分可能通過作用于AKT1、TNF、VEGFA等炎癥和血管因子關鍵靶點，繼而調節類風濕性關節炎、Toll樣受體等骨性疾病相關炎癥通路，最終發揮抗炎、鎮痛及健骨等作用。