蒲藍利咽合劑的指紋圖譜建立及含量測定Δ

王博，于曉濤，劉玉萍，赫振玉，王瑞，3#（.漯河市中心醫院藥學部，河南 漯河 462000；2.河南省中藥制劑與加工中醫藥重點實驗室，河南 漯河 462000；3.河南省中藥制劑現代化技術研發與臨床應用工程研究中心，河南 漯河 462000）

蒲藍利咽合劑由蒲公英、黃芩、木蝴蝶、忍冬藤等6味藥材組成，由《千家妙方》記載的“復方蒲公英湯”[1]加減化裁而來，能透泄里熱壅盛之邪，具有清熱解毒、涼血利咽之效，主要用于治療上呼吸道感染引起的發熱、咽喉腫痛等癥。方中蒲公英為君藥，清熱解毒、消腫散結[2]；黃芩為臣藥，善清上焦之火，可治火毒熾盛的瘡癰腫毒、咽喉腫痛[3]；木蝴蝶、忍冬藤等為佐使藥，疏風通絡、清肺利咽[4―5]；諸藥共奏清熱解毒、抗炎消腫之效。蒲藍利咽合劑主要含有酚酸類、黃酮類、萜類、揮發油等成分，其中綠原酸、咖啡酸、菊苣酸為君藥蒲公英中酚酸類成分，具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用[6―8]；黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷為臣藥黃芩中黃酮類成分，具有抗病毒、神經保護等作用[9]；馬錢苷為佐藥忍冬藤中環烯醚萜類成分，具有抗氧化、抗菌及增強免疫功能等作用[10]；木蝴蝶苷B為使藥木蝴蝶的特征性成分，具有抗菌、抗炎等作用[11]。目前，對蒲藍利咽合劑的質量控制僅限于薄層鑒別及相關檢查項，尚缺少定量控制的方法。

由于中藥成分復雜，對一種或幾種成分的定量研究不能全面反映中藥制劑的整體質量。中藥指紋圖譜所含化學成分信息量大、特征性強，能對中藥質量進行整體描述和評價[12]，結合化學模式識別能對指紋圖譜的整體性和模糊性進行更加科學合理的評價[13]。基于此，本研究建立了蒲藍利咽合劑的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進行化學模式識別分析；同時采用相同的HPLC法測定該制劑中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷共8種活性成分的含量，旨在為蒲藍利咽合劑的質量評價提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有LC-20A型HPLC儀、AUW-120D型十萬分之一天平（日本Shimadzu公司），Milli-Q型純水儀（美國Millipore公司），KQ-300E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

對照品綠原酸（批號110753-202119，純度96.8%）、咖啡酸（批號110885-201703，純度99.7%）、黃芩苷（批號110715-202122，純度95.4%）、漢黃芩苷（批號112002-201702，純度98.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（批號DSTDQ-004001，純度98.49%）、馬錢苷（批號DSTDM003801，純度99.31%）、菊苣酸（批號DSTDJ003901，純度98.23%）、木蝴蝶苷B（批號DSTDM002901，純度98.39%）均購自成都德思特生物科技有限公司；乙腈、甲酸均為色譜純，水為純化水。

11批蒲藍利咽合劑[規格為每毫升含生藥0.52 g（100 mL/瓶），編號 S1～S11，批號分別為 20210621、20220214、20220216、20220218、20220221、20220223、20220225、20220228、20220302、20220304、20220307]均為漯河市中心醫院自制。

黃芩飲片（批號20201201）、忍冬藤飲片（批號20191101）、木蝴蝶飲片（批號20201001）均購自安徽桐花堂中藥飲片科技有限公司，蒲公英飲片（批號180601）購自亳州市萬草堂中藥飲片有限公司，均經漯河市中心醫院制劑室于曉濤副主任中藥師鑒定為真品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

以 Shimadzu Shim-pack GIST C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～7 min，7%B；7～15 min，7%B→8%B；15～27 min，8%B→10%B；27～32 min，10%B→15%B；32～45 min，15%B；45～55 min，15%B→19%B；55～60 min，19%B→22%B；60～80 min，22%B→25%B；80～85 min，25%B→40%B；85～100 min，40%B→50%B；100～105 min，50%B→90%B）；柱溫為25 ℃；流速為1.0 mL/min；進樣量為5 μL；指紋圖譜檢測波長為254 nm；含量測定檢測波長為237 nm（馬錢苷）、280 nm（木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷）、327 nm（綠原酸、咖啡酸、菊苣酸）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷對照品適量，置于10 mL容量瓶中，加50%甲醇制成上述各成分質量濃度分別為68.400、30.000、250.625、237.600、105.600、2 204.800、289.300、408.000 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取蒲藍利咽合劑1 mL，加水稀釋至10 mL，以14 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 按蒲藍利咽合劑處方工藝分別制備缺黃芩或蒲公英或忍冬藤或木蝴蝶以及同時缺蒲公英和忍冬藤（因兩者均含有咖啡酸）、黃芩和木蝴蝶（因兩者均含有黃芩苷）的陰性樣品，按“2.2.2”項下方法制備各陰性樣品溶液。

2.3 蒲藍利咽合劑HPLC指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 精密量取編號為S11的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。以黃芩苷為參照峰，結果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.010%～0.234%、0.083%～2.935%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 精密量取編號為S11的樣品，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。以黃芩苷為參照峰，結果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.025%～0.481%、0.140%～2.777%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 精密量取編號為S11的供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。以黃芩苷為參照峰，結果顯示，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別為0.034%～0.630%、0.272%～2.865%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.3.4 指紋圖譜的生成和相似度評價 取11批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜峰。將所得的色譜圖采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）》軟件進行分析，以峰面積適中的S11樣品為對照圖譜，選擇中位數計算，采用多點校正生成HPLC疊加指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）。結果顯示，11批樣品共有20個共有峰，詳見圖1。11批樣品的相似度分別為0.988、0.990、0.991、0.985、0.991、0.989、0.973、0.981、0.989、0.994、0.993。

2.3.5 共有峰指認 經過與相應對照品圖譜（圖2）比對，共指認出8個色譜峰，分別為綠原酸（5號峰）、咖啡酸（7號峰）、馬錢苷（8號峰）、菊苣酸（9號峰）、木蝴蝶苷B（13號峰）、黃芩苷（14號峰，由于其保留時間居中，將其作為參照峰）、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（17號峰）、漢黃芩苷（18號峰）。

2.4 HPLC指紋圖譜的化學模式識別分析

2.4.1 聚類分析 將11批樣品的20個共有峰相對峰面積導入SPSS 20.0軟件，采用組間聯結法，以平方歐氏距離為區間進行聚類分析。結果顯示，當平方歐氏距離為10時，11批樣品分為2大類，其中S3、S10～S11為一類，其余為一類。結果見圖3。

2.4.2 主成分分析 以11批樣品的20個共有峰相對峰面積為變量，運用SPSS 20.0 軟件進行主成分分析（表1）。結果顯示，前4個主成分的累計方差貢獻率為95.546%，表明這4個主成分能夠反映指紋圖譜共有峰的主要信息。采用SIMCA14.1軟件進行無監督模式的主成分建模分析（圖4）。結果顯示，11批樣品分為2類，S3、S10～S11為一類，其余為一類，與聚類分析結果一致。

表1 4個主成分因子的特征值和方差貢獻率

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析 以11批樣品的20個共有峰相對峰面積為變量，運用SIMCA14.1軟件進行正交偏最小二乘法-判別分析（圖5）。結果顯示，所得模型參數RX2＝0.891，RY2＝0.963，Q2＝0.899＞0.5，表明模型穩定，預測能力良好。

以變量重要性投影（variable importance in projec‐tion，VIP）值大于1[14]為指標篩選對樣品分類貢獻較大的成分（圖6）。結果顯示，15、14（黃芩苷）、10、18（漢黃芩苷）、11、17（千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸）、4、20、16、12、7（咖啡酸）、19號峰的VIP值大于1，表明這12個共有峰對應的成分可能是影響蒲藍利咽合劑質量的標志物。

2.5 蒲藍利咽合劑中綠原酸等8種成分的含量測定

采用相同的HPLC法測定蒲藍利咽合劑中綠原酸等8種活性成分的含量。

2.5.1 專屬性試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液（編號S11）、各陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖（圖2，陰性樣品圖略）。結果顯示，各成分分離度良好，陰性樣品無干擾。

2.5.2 線性關系考察 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，分別置于5 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋，得系列濃度工作溶液。取系列濃度工作溶液及混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜峰。以各待測成分質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸。結果見表2。

表2 綠原酸等8種成分的回歸方程與線性范圍

2.5.3 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為0.60%、0.67%、0.65%、0.60%、0.47%、0.54%、0.52%、0.54%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5.4 重復性試驗 精密吸取樣品（編號S11），共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷含量的RSD分別為0.79%、0.27%、0.22%、0.12%、0.68%、0.49%、0.08%、0.12%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.5.5 穩定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液（編號S11），分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。結果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷峰面積的RSD分別為1.02%、0.69%、0.54%、0.35%、0.16%、0.32%、0.30%、0.26%（n＝6），表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定。

2.5.6 加樣回收率試驗 精密量取樣品（編號S11）0.5 mL，共6份，按1∶1加入混合對照品溶液，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷的平均加樣回收率分別為100.69%、98.50%、101.86%、99.97%、104.34%、100.38%、101.84%、99.74%，RSD 分別為 1.99%、2.64%、1.42%、1.54%、2.89%、2.73%、1.53%、1.25%（n＝6），表明方法準確度良好。

2.5.7 樣品含量測定 精密量取11批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量，每批樣品平行測定3次，取平均值。結果見表3。

表3 綠原酸等8種成分的含量測定結果（n＝3，mg/g）

3 討論

本課題組前期分別考察了以甲醇-甲酸溶液、乙腈-甲酸溶液、乙腈-乙酸溶液為流動相時各成分的分離效果，結果表明，以乙腈-甲酸溶液為流動相時各成分的分離效果較好，故選擇其為流動相。同時還考察了不同波長下（230、254、280、330 nm）各色譜峰的吸收度，結果顯示，在254 nm波長下所得色譜峰較多且分離度較好，能夠較為全面地反映樣品的化學成分信息，故選擇254 nm為指紋圖譜的檢測波長；此外還對綠原酸等8種成分進行全波長掃描，結果發現，綠原酸、咖啡酸、菊苣酸的最大吸收波長為327 nm，馬錢苷為237 nm，木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷均為280 nm，因此選擇237、280、327 nm為含量測定的檢測波長。

本研究建立了11批蒲藍利咽合劑的HPLC指紋圖譜，確定了20個共有峰，與對照指紋圖譜的相似度均大于0.97，說明各批次樣品的質量均一穩定、差異較小。聚類分析、主成分分析的結果均顯示，S3、S10～S11為一類，其余為一類。正交偏最小二乘法-判別分析結果顯示，15、14（黃芩苷）、10、18（漢黃芩苷）、11、17（千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸）、4、20、16、12、7（咖啡酸）、19號峰為影響樣品質量的標志物。考慮到復方制劑具有多成分、多靶點協同作用的特點，故選擇樣品中發揮抗菌消炎作用的主要藥效成分綠原酸、菊苣酸、馬錢苷和木蝴蝶苷B[6，8，10―11]，與 VIP 值＞1 的黃芩苷、千層紙素 A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷、咖啡酸共8種成分作為蒲藍利咽合劑質量控制的指標成分。

含量測定結果顯示，11批樣品中綠原酸、咖啡酸、馬錢苷、菊苣酸、木蝴蝶苷B、黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸、漢黃芩苷的含量分別為0.287～1.021、0.163～0.485、0.735～3.641、0.587～4.012、1.920～9.063、37.443～115.974、3.623～13.942、7.135～18.736 mg/g，表明不同批次樣品含量存在差異，其中S3、S10～S11樣品中8種成分的總含量高于其他批次。其原因可能與蒲藍利咽合劑原藥材的產地、制劑提取濃縮工藝等多種因素有關[15―16]。

綜上所述，建立的蒲藍利咽合劑HPLC指紋圖譜和綠原酸等8種成分的含量測定方法，可用于蒲藍利咽合劑的質量評價；黃芩苷、漢黃芩苷、千層紙素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸等12種成分可能是影響蒲藍利咽合劑質量的標志物。