脂肪與肥胖相關基因FTO對肝細胞增殖效果研究*

王 倩 折瑞蓮 沙文瓊 林湖濱 曹雨之

廣東省深圳市人民醫院 518020

機體健康與肝臟關系密切，肝臟疾病發病率逐年提高，嚴重影響人們的生活質量[1]。肝臟疾病發病不區分人群，如青少年肥胖、孕婦妊娠期脂肪肝[2-3]。一些常見的肝臟疾病由過度肥胖導致，如脂肪肝[4-5]。因此，探索與肥胖相關的因素顯得尤為重要。

脂肪與肥胖相關基因(Fat mass and obesity-associated protein gene，FTO)于1999年在研究小鼠融合趾被發現，起初，認為與細胞程序性凋亡有關[6]。2007年，通過全基因組關聯分析研究發現FTO是肥胖敏感性基因，與肥胖率、能量吸收率有關，編碼m6A去甲基化酶[7]。2011年，FTO被鑒定為脂肪與肥胖相關基因，并與代謝性疾病、腫瘤發生發展存在密切關系[8-9]。在大鼠疾病模型研究中，發現FTO過表達導致體重顯著增加、糖尿病等。FTO編碼的去甲基化酶作用與代謝相關的信號通路分子，引起能量代謝失調，進而可能導致肥胖、糖尿病等代謝性疾病[10-11]。此外，有研究發現，脂肪組織細胞FTO表達水平改變會增加外周血細胞FTO等位基因高表達的風險[12]。在正常肝細胞中還不清楚其如何調控肝細胞的增殖活性。本研究旨在利用人肝正常細胞模型研究FTO如何調控肝細胞增殖，研究其干擾與過表達對肝細胞的增殖效果,以及對代謝相關基因表達的調控，以期合理指導肝臟疾病患者飲食，避免肥胖、糖尿病等代謝疾病。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑：1640培養基、甘油檢測試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒與CCK-8試劑盒購自南京凱基公司。胎牛血清購自杭州四季青公司。FTO-OE過表達載體購自廣州基旦生物公司。FTO-sh干擾載體購自廣州艾基生物公司。qPCR反轉錄試劑盒與蛋白marker購自日本TAKARA公司。qPCR引物購自上海生工公司。GAPDH抗體購自美國CST公司。293T細胞與人肝正常細胞HL-7702購自中國科學院上海細胞庫。SDS-PAGE凝膠試劑盒與蛋白裂解劑RIPA購自碧云天公司。Lipo2000轉染試劑與TRIzol購自美國Invitrogen公司。

1.1.2 儀器:qPCR儀器(Bio-Rad，M400)。酶標儀(博璐騰，型號DC220)。超凈臺(蘇州超凈，型號WT-2ND)。二氧化碳培養箱(Thermo，型號BB150)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與轉染：使用RPMI1640培養基添加終濃度10%的胎牛血清培養肝細胞，并置于37℃，含5%CO2培養箱培養細胞。293T細胞培養在6孔板， DNA(μg)(帶有綠色熒光蛋白GFP標簽)與Lipo2000(μl)的比例為1∶2。250μl Opti-MEM(不含血清和抗生素)稀釋10μl Lipo2000，室溫靜置5min形成DNA-Lipo2000復合物。從6孔板中吸出500μl培養基，然后滴加入500μl質粒和脂質體混合物。4～6h后，移除含有DNA-脂質體復合物的培養基，代之以正常培養基，繼續將細胞放置溫箱孵育。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞存活：細胞轉染過表達及干擾慢病毒載體后，96孔板加入細胞 100μl/孔(約 1×104)，將96孔板在37℃，含5% CO2細胞培養箱中孵育1d、2d、3d、4d。向各孔中加入10μl的 CCK-8 檢測溶液。37℃下孵育1h。讀數前在搖床上輕微震蕩混勻，使用酶標儀在 450nm 波長處檢測每孔的吸光度。細胞增值率計算公式=(轉染組/NC對照組)×100%

1.2.3 Western blot法檢測蛋白表達：常規流程胰酶消化細胞，1 000r/min離心5min，轉移至1.5ml離心管，PBS清洗細胞3次，按50μl RIPA+ 5μl PMSF (100mmol)比例加裂解液，吹打細胞，搖勻置于冰上30min。裂解完后，于4℃下16 000r/min離心15min。配制8%的SDS-PAGE，每孔上樣20μg蛋白樣品，恒壓分離蛋白。切下目標條帶以及內參條帶。凝膠置于轉膜液平20min，待處理。PVDF膜甲醇預處理3～5min，純水洗膜2min，轉至轉膜緩沖液浸潤5min。操作必須將氣泡完全去除。按正負極方向放置轉印夾。冰浴條件下，250mA恒流轉移1h。取出雜交膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1h。一抗稀釋濃度4℃過夜。TBST洗膜10min，3次。相應二抗稀釋液37℃孵育1h。TBST(吐溫-20，0.1%)洗膜10min，3次。將雜交膜置于干凈的保鮮膜上。暗房顯影，使用化學發光液均勻地加到膜的表面，并使反應持續5min。

1.2.4 qPCR法檢測ATGL、c/EBPβ、FAS相對表達：胰酶消化并收獲細胞，轉入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。4℃離心，12 000g，15min，取上清。加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。4℃離心，12 000g，10min，棄上清。加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃離心，7 500g，5min，棄上清。室溫晾干，加入DEPC 水溶解，超低溫冰箱保存。反轉錄條件：37℃，15min；85℃，5s。qPCR體系：模板，1μl；前引物 (10μmol/L)，0.4μl，后引物(10μmol/L)，0.4μl；2×PerfecStar qPCR SuperMix，10μl；Nuclease free-Water，8.2μl。使用兩步法分析基因表達，程序如下，95℃ 5s, 60℃ 5s, 然后42個循環擴增分析基因表達(95℃，15s；60℃，1min)。使用2-ΔΔCt方法計算基因相對表達，以GAPDH表達為對照。

1.2.5 試劑盒方法檢測甘油水平：甘油水平檢測按照試劑盒說明書進行。細胞(包括分化的脂肪細胞)裂解，消化、離心收集細胞。或直接在培養皿內裂解。按比例每(1～2)×106細胞加100μl裂解液，混勻裂解。裂解物處理，取100～500μl裂解物轉移到1.5ml離心管，進行下一步操作。70℃加熱10min滅活脂肪酶，可能出現絮狀沉淀。室溫5 000r/min離心5min，上層清液既可用于酶學測定。工作溶液的配制，按R1∶R2=4∶1比例。標準品稀釋，用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將4mmol甘油標準品倍比稀釋為62.5、31.25、15.625、7.812 5μmol，注意設置0濃度對照反應管。甘油三酯水平檢測方法同甘油檢測。

2 結果

2.1 慢病毒干擾FTO-sh載體及過表達FTO-OE載體構建 FTO-OE慢病毒干擾載體(見圖1a、b)及FTO-sh慢病毒過表達載體經轉染293T細胞后(見圖1c、d)，進一步培養細胞并分析FTO過表達及干擾效果。從圖2可以看出，western blot分析看出，FTO-OE過表達載體有效提高FTO蛋白的表達水平(見圖2a)，qPCR方法得到一致的結果(P<0.05)，見圖2b。FTO-sh干擾載體顯著性降低FTO蛋白的表達水平(見圖2c)，qPCR結果亦顯示出同樣的結果(P<0.05)，見圖2d。

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2.2 FTO對正常肝細胞的增殖效果 FTO-OE轉染正常肝細胞HL-7702，培養5d。從圖3a看出，肝細胞增殖率逐漸增強，與FTO-NC對照組存在顯著差異，FTO基因對肝細胞生長有促進的功能(P<0.05)；當干擾FTO的表達時，肝細胞存活率存在明顯的抑制水平，肝細胞的生長率逐漸降低(P<0.05)，見圖3b。從以上結果可以看出，FTO具有促進肝細胞增殖功能。

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2.3 FTO調控肝細胞甘油代謝 當FTO過表達時，與FTO-NC對照組相比，肝細胞產生的甘油水平顯著提高(P<0.05)，見圖4a；當干擾FTO的表達時，與FTO-NC對照組相比，甘油的水平存在降低的現象(P<0.05)，見圖4b。從實驗結果能夠看出，FTO對肝細胞里的甘油具有明顯的正調控性。

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2.4 FTO調控肝細胞甘油三酯代謝 以上結果顯示FTO對肝細胞甘油代謝調控具有正調控功能，那么其對甘油三酯應該也具有同樣調控效果。與預期中的結果一致，實驗結果顯示，與FTO-NC對照組相比，當FTO過表達時，甘油三酯的水平顯著提高(P<0.05)，見圖5a；當沉默FTO的表達，甘油三酯的水平顯著降低(P<0.05)，見圖5b。與FTO對甘油代謝調控一致，FTO對甘油三酯代謝具有同樣效果。

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2.5 FTO調控肝細胞與代謝相關的基因 以上結果顯示，FTO對肝細胞脂肪代謝具有正調控功能。下面從基因的角度分析FTO對脂肪代謝相關基因表達調控。與FTO-NC對照組相比，當FTO過表達，ATGL表達水平降低， c/EBPβ與FAS表達水平提高(P<0.05)，見圖6a；當干擾FTO的表達，出現相反的結果，ATGL表達水平提高， c/EBPβ與FAS表達水平降低(P<0.05)，見圖6b。結果顯示，FTO對脂肪代謝相關基因表達具有調控的功能。

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3 討論

FTO是脂肪與肥胖相關基因，在脂肪代謝、肥胖、糖尿病、腫瘤進展等方面具有重要的調控功能[12-13]。本研究綜合利用MTT方法、western blot、qPCR等方法發現，FTO對肝細胞增殖、甘油水平、甘油三酯水平、甘油代謝相關基因表達具有調控的功能。當FTO過表達，肝細胞增殖活性提高，甘油與甘油三酯水平提高，ATGL表達水平降低， c/EBPβ與FAS表達水平提高；當干擾FTO表達，出現相反的結果。FTO具體如何調控肝細胞脂肪代謝基因還需進一步研究。

代謝性疾病作為一種特殊的疾病，參與多種并發癥發生發展。FTO與代謝性疾病關系密切，如脂肪肝、糖尿病、肥胖、腫瘤等[6,14-15]，其編碼m6A去甲基化酶，介導多種疾病的發生發展，但是其對宿主細胞的代謝調控機制仍未闡明[6]。目前，多數研究表明FTO通過m6A修飾對葡萄糖和脂肪代謝發揮作用，在肝臟 FTO通過調節肝臟糖生成基因的表達參與調節全身糖穩態，如有小鼠研究表明，肝臟細胞特異性 FTO 過表達導致小鼠空腹血糖和胰島素水平升高，糖耐量降低[16]。在肝臟組織細胞，FTO 通過改變肝臟中 m6A 的修飾狀態和脂質代謝相關基因的表達進而調節脂質代謝，抑制機體能量轉換為熱量，最終形成肥胖[7,17]。有研究表明，FTO 通過下調靶基因的m6A 水平，降低線粒體含量，提高甘油三酯積累水平，促進脂肪在肝臟的積累，加劇脂肪肝進程。如脂肪肝大鼠模型中發現，FTO mRNA和蛋白水平顯著上升，且發現FTO表達水平與丙二醛、超氧化物歧化酶濃度呈正相關，肝臟中FTO 水平升高與氧化應激和脂質沉積有關[18]。

然而，蹊蹺的是FTO在不同的細胞疾病模型中出現的效果可能相反，因此闡明FTO在具體細胞中的作用很關鍵，如FTO與肪肝代謝性疾病形成的關系是怎樣的，這對指導脂肪肝、糖尿病等患者尤為重要。