清膚消腫散調控急性皮下蜂窩組織炎大鼠TGF-β1Smad信號通路的研究*

文 波 李 琦

四川省成都市新都區中醫醫院 610500

蜂窩組織炎是細菌局部感染或病變侵害導致的化膿性感染，表現為局部的紅、腫、熱、痛以及快速擴散[1]。大量研究顯示其在中老年人中最常發生，其致病菌最常見的是溶血性鏈球菌。急性皮下蜂窩組織炎的特點主要是突然發病、發展迅速與病程兇險，如果不能得到及時有效的治療，易導致一系列嚴重并發癥[2]。目前臨床對于蜂窩組織炎的治療主要以綜合治療為主，包括給予營養支持、維持機體水電解質平衡、改善機體低蛋白血癥及抗生素治療[3]。近些年來中醫臨床對于急性皮下蜂窩組織炎的治療也在逐步發展，清膚消腫散是我院治療急性皮下蜂窩組織炎的臨床經驗組方，但對于其治療作用機制尚未得出清晰認識。研究顯示，TGF-β1/Smads信號轉導可顯著減輕組織損傷，且在急性皮下蜂窩組織炎的發展過程中TGF-β1水平與病情嚴重程度呈正相關。因此本研究以TGF-β1/Smads信號通路為切入點，探討清膚消腫散治療對于急性皮下蜂窩組織炎的具體機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠45只，清潔級，體重(220±20)g，實驗動物在成都醫學院動物實驗中心飼養，飼養條件為Ⅱ級，光照周期12h/12h，室溫在22～25℃之間，相對濕度為45%～60%，自由進食、飲水。

1.2 實驗試劑 清膚消腫散為本院自制；ELISA試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；SYBR Green染料購自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol Reagent總 RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈反應試劑盒購自美國英杰公司；TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7以及β-actin抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組：將SD大鼠45只隨機分為正常對照組、模型對照組與研究組，每組15只。其中正常對照組不進行手術，模型對照組與研究組建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型。模型制備后研究組大鼠給予清膚消腫散外敷治療。治療1周后處死所有大鼠并取皮下組織制備樣本，保存于-20℃冰箱備用。

1.3.2 造模方法：每只SD大鼠通過向右旁腹上方皮膚注射0.2ml G族鏈球菌懸液以建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型。

1.3.3 治療方法：當模型制備成功1d后，研究組大鼠給予清膚消腫散在皮下蜂窩組織炎患處外敷治療，2次/d。用藥3d，共6次。

1.4 指標檢測

1.4.1 通過ELISA檢測各組大鼠外周血中TGF-β1、IL-8和TNF-α水平：取出部分大鼠皮下組織，以25ml/g加入生理鹽水混合研磨后離心分離上清液，按照ELISA試劑盒步驟對樣本TGF-β1、IL-8和TNF-α進行標記，測量吸光度后以標準曲線來計算其中TGF-β1、IL-8和TNF-α的含量。

1.4.2 RT-PCR法檢測各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平：取出部分大鼠皮下組織，將其置于液氮中磨碎，加入適量TRIzol試劑，通過勻漿機進行勻漿處理，隨后進行分層、沉淀、清洗及溶解等步驟制得RNA備用。取制備好的總RNA進行反轉錄成cDNA，然后加入SYBR Green染料與TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7及β-actin上下游引物混合，隨后于PCR儀上進行擴增并定量分析。上述引物序列見表1。

表1 所選基因引物序列

1.4.3 Western Blot法檢測各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白水平：取出部分大鼠皮下組織，通過組織破碎儀加蛋白提取試劑提取總蛋白，將提取的蛋白加入十二烷基磺酸鈉混勻后水煮變性。將提取的總蛋白進行電泳、封閉及轉膜操作。轉膜后分別孵育TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7及β-actin抗體與相對應辣根過氧化物酶標記的二抗，洗膜顯影，結果用ImageJ軟件對各組細胞中不同因子的相對灰度值進行系統性分析。

2 結果

2.1 各組大鼠外周血中炎癥指標水平 ELISA結果如表2所示，造模后模型對照組與正常對照組相比，其血清TGF-β1、IL-8和TNF-α水平顯著上升(P<0.05)，提示皮下蜂窩組織炎可使相關的炎癥因子表達水平增加；與模型對照組相比，研究組大鼠血清中TGF-β1、IL-8和TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。

表2 各組大鼠上皮組織TGF-β1、IL-8和TNF-α水平

2.2 各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA水平 RT-PCR結果如圖1所示，與正常對照組相比，模型對照組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA水平均顯著升高，Smad7的mRNA水平均明顯降低(P<0.05)；與模型對照組相比，研究組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的mRNA水平均顯著降低，Smad7水平顯著上升(P<0.05)。

圖1 各組大鼠腦皮質中EPO、VEGF的mRNA水平

2.3 各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白變化水平 Western Blot結果如圖2所示，與正常對照組相比，模型對照組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白水平均顯著升高，Smad7水平均明顯降低(P<0.05)；與模型對照組相比，研究組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3的蛋白水平均顯著降低，Smad7水平顯著上升 (P<0.05)。

圖2 各組大鼠皮下組織中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7蛋白表達水平

3 討論

急性皮下蜂窩組織炎最常見的癥狀為皮下組織炎性病變并化膿，其致病菌多為金黃色葡萄球菌與溶血性鏈球菌。這一類致病菌能夠崩解基質與溶解纖維素并且由于皮下組織疏松及筋膜間隙較多，使得感染迅速蔓延，并伴有中性粒細胞與淋巴細胞浸潤。如果沒有得到及時有效的治療用于控制病情，往往會導致病灶出現紅腫熱痛等情況。隨著病情的持續發展，組織壞死形成囊腫，嚴重者甚至會導致膿毒血癥及其他嚴重并發癥，導致預后較差。因此合適的治療方案是臨床需要解決的問題，近些年中醫藥在臨床診治急性皮下蜂窩組織炎表現出了獨特的優勢[4-5]。

清膚消腫散是我院臨床經驗方，在明代經方的基礎上結合現代中西醫理論的創新，經過加減后配伍組成，方內主要成分為黃連、紫花地丁、梔子、蒲公英、連翹與金銀花。前期臨床使用顯示，該藥可能具有改善患者急性皮下蜂窩組織炎癥狀功效。本研究結果顯示，當成功建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型后大鼠外周血中炎癥因子IL-8與TNF-α顯著上升，與其他研究一致，且TGF-β1水平同樣上升。當給予清膚消腫散治療后，其炎癥水平得到了顯著改善，而且TGF-β1水平同樣得到了降低。這可能與清膚消腫散方中成分效果有關。其中黃連和紫花地丁有苦泄、辛散，涼血消腫的效果[6]，能改善患處炎癥水平；梔子、蒲公英、連翹和金銀花分別發揮消腫止痛、涼血解毒[7-8]的效果；多藥共奏清熱涼血的作用，從而改善患者體內炎癥水平及患處癥狀。此外，清膚消腫散是我院專家在明代經方基礎上結合臨床應用改良而來，效果顯著。前期臨床研究顯示，在使用清膚消腫散治療的患者中，其TGF-β1水平與癥狀嚴重程度呈正相關，與本研究結果一致。

TGF-β1/Smad 信號通路是一條經典的分子信號通路，研究表明，TGF-β1 的生物學效應主要通過Smad 家族蛋白發揮，主要包括該蛋白質家族中的受體調節型蛋白Smad2、Smad3和抑制型蛋白Smad 7型[9-10]。TGF-β1 經整合素、蛋白酶等機制激活后可與細胞表面的跨膜受體Ⅱ結合，并在磷酸化作用下活化 Smad2、Smad3蛋白，繼而進一步誘導細胞外基質的合成[11]。但是，當 Smad7 上調并與跨膜受體Ⅰ結合時，Smad2、Smad3 活化會受到抑制[12]。本研究結果顯示，當成功建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型后，其皮下組織中TGF-β1與其下游受體調節蛋白Smad2、Smad3顯著升高，抑制型蛋白Smad7顯著降低，說明TGF-β1/Smad信號通路在這一過程中發揮著重要作用，而給予清膚消腫散治療后能夠明顯拮抗這一效應，提示清膚消腫散能夠通過TGF-β1/Smad信號通路發揮抗炎作用。

綜上所述，本研究通過建立急性皮下蜂窩組織炎大鼠模型，并給予清膚消腫散治療，能夠顯著改善大鼠炎癥水平，這一過程很可能與抑制TGF-β1/Smad 信號通路有關。