冠心丹參滴丸聯合誘導多能干細胞來源的心肌細胞移植對大鼠心肌梗死的影響

蔡昊，羅志榮，韓小晶，牟芳芳，邵水金，國海東，2

1.上海中醫藥大學基礎醫學院，上海 201203；2.上海中醫藥大學中西醫結合研究院，上海 201203

《中國心血管健康與疾病報告2020》指出，心血管病病死率占我國城鄉居民總死亡原因首位[1]。急性心肌梗死是心血管病中最危急的一種。然而，藥物、介入治療及冠脈搭橋術等只能挽救瀕臨死亡的心肌，對已壞死心肌卻無能為力。近年來，應用干細胞移植替代傳統手段治療心肌梗死逐漸受到重視。但干細胞移植后在心肌局部的存活和向心肌定向分化的能力較弱，嚴重影響干細胞移植治療的效果，也限制了干細胞移植在臨床的應用和推廣[2]。誘導多能干細胞（iPSC）是利用病毒載體將4 個轉錄因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）轉入分化的體細胞中，使其重編程為類似胚胎干細胞（ESC）的一種干細胞。iPSC具有與ESC類似的自我更新和多向分化潛能，因其取材容易、避免倫理問題、同體移植免疫排斥反應弱等優勢逐漸成為心臟再生治療的手段。iPSC在體外可被誘導為心肌細胞，移植iPSC來源的心肌細胞可改善心肌梗死后心功能，降低梗死面積[3-5]。冠心丹參方由丹參、三七、降香組成，臨床主要用于缺血性心臟病的治療。課題組研究發現，冠心丹參滴丸可通過促進間充質干細胞（MSC）移植后的募集和存活提高其治療心肌梗死的作用[6]。本研究進一步觀察冠心丹參滴丸聯合iPSC來源的心肌細胞移植對心肌梗死模型大鼠心功能的影響，探討其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物及細胞

6～8 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠 50 只，體質量（280±20）g，上海中醫藥大學動物實驗中心提供，動物許可證號SYXK（滬）2014-0008。飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，溫度（26±2）℃、濕度（68±2）%環境，自由攝食飲水。所有實驗均按照上海中醫藥大學倫理委員會和國際動物福利標準要求進行。人iPSC，購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 藥物

冠心丹參滴丸，批號20140907YR08291，哈爾濱業銳藥業有限公司。將冠心丹參滴丸溶于無菌雙蒸水中，配制成濃度25 mg/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

iPSC培養基（貨號CA1014500）、心肌細胞誘導分化試劑（貨號CA2004500）、iPSC 消化液（貨號CA3001500）、心肌細胞培養液（貨號CA2015002），北京賽貝生物技術有限公司；心肌肌鈣蛋白T（cTnT，貨號ab8295），英國Abcam公司；抗熒光淬滅封片劑（貨號H-1200），美國Vector公司；Masson染色液（貨號BP-DL021），南京森貝伽生物技術有限公司；基質細胞衍生因子-1（SDF-1）、干細胞因子（SCF）、血管內皮生長因子（VEGF）ELISA檢測試劑盒（貨號分別為ml003227、ml102853、ml064294），上海酶聯生物科技有限公司。371型細胞培養箱，美國Thermo fisher Scientific；Synergy 2 多功能酶標儀，BioTeck 公司；IX53熒光顯微鏡，日本Olympus。

2 實驗方法

2.1 誘導多能干細胞誘導分化

將生長狀態良好的iPSC按1∶6比例傳代至12孔板，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養，當細胞密度達到90%～98%時進行誘導分化。先加入2 mL心肌細胞誘導分化試劑Ⅰ培養48 h，吸去液體，PBS清洗2次，加入2 mL誘導分化試劑Ⅱ繼續培養48 h，吸去液體，PBS清洗2次，加入2 mL誘導分化試劑Ⅲ繼續培養，當培養液變黃時更換成新鮮的誘導分化試劑Ⅲ。顯微鏡下觀察，待出現跳動細胞后，改用心肌細胞培養液繼續培養。

2.2 熒光染色

將分化后的細胞用4%多聚甲醛室溫固定20 min，使用0.5%TritonX-100室溫處理15 min破膜，PBS洗3次。滴加山羊血清37 ℃封閉30 min，加入cTnT抗體（1∶200），4 ℃搖床孵育過夜。PBS洗3次，加入山羊抗小鼠IgG（Alexa Fluor?488），37 ℃室溫孵育1 h。PBS洗3次，DAPI室溫染色10 min，PBS沖洗后抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 分組與造模

將50只大鼠隨機分為假手術組、模型組、細胞移植組、冠心丹參滴丸組和冠心丹參滴丸+細胞移植組（聯合組），每組10只。將大鼠用異氟烷麻醉后固定于鼠板，連接呼吸麻醉機，碘伏消毒胸部，剪開左胸皮膚與肌肉，撐開3～4肋骨，取出心臟，結扎左冠狀動脈前降支，將心臟送回胸腔內，假手術組取出心臟后立即回納。輕輕擠壓排出胸腔內氣體，逐層縫合關閉切口，消毒后常規飼養。大鼠造模后模型組死亡2只、冠心丹參滴丸組死亡2只、細胞移植組死亡1只。第2日超聲心動圖檢測大鼠心功能，其中3只左室射血分數（EF）>55%（細胞移植組1只、聯合組2只），進行剔除。最終假手術組10只、模型組8只、冠心丹參滴丸組8只、細胞移植組8只、聯合組8只。

2.4 干預

冠心丹參滴丸組造模后次日超聲心動圖檢測后開始每日予冠心丹參滴丸100 mg/kg溶液灌胃，給藥劑量按人與大鼠體表面積折算，連續4周。細胞移植組造模后即刻于心肌梗死區周邊分3點注射30 μL細胞懸液（含105個心肌細胞），同時每日予等體積生理鹽水灌胃。聯合組參照細胞移植組注射細胞懸液，同時予冠心丹參滴丸溶液灌胃。假手術組和模型組常規飼養，每日予等體積生理鹽水灌胃。干預前5 d和整個干預過程中，各組大鼠均予免疫抑制劑他克莫司0.75 mg/kg、西羅莫司0.3 mg/kg灌胃。

2.5 心功能檢測

干預結束后，異氟烷麻醉大鼠，仰臥固定于平板上，進行超聲心動圖檢測。將線陣探頭置于大鼠左胸壁，獲取胸骨旁左心室短軸二維圖像，然后平乳頭肌獲取M 型超聲心動圖。分別測量左室舒張末期內徑（LVDd）、左室收縮末期內徑（LVDs）、左室舒張末期容積（LVEDV）和左室收縮末期容積（LVESV）。采用Teichholz 校正公式計算EF 和左室短軸縮短分數（FS）。EF（%）=（LVDd3-LVDs3）÷LVDd3×100%，FS（%）=（LVDd-LVDs）÷LVDd×100%。每只大鼠連續測量3次，取平均值。

2.6 取材

超聲心動圖檢測結束后，腹主動脈取血，4 ℃靜置1 h，3 500 r/min離心5 min，分離血清，用于ELISA檢測。處死大鼠，快速分離心臟，梗死面積最大處切開心臟，去除心房組織，靠近心底梗死組織經4%多聚甲醛固定、蔗糖脫水后進行冰凍切片，靠近心尖心肌組織采用ELISA進行細胞因子檢測。

2.7 Masson染色

冰凍切片室溫干燥10 min，0.01 mol/L PBS 洗2次，加Bouin固定液，37 ℃烘箱處理2 h，流水沖洗切片至黃色消失。滴加天青石藍染色液100 μL染色2～3 min，水洗。滴加Mayer蘇木素染色液染色2～3 min，水洗。使用酸性乙醇分化液處理1～2 min，流水沖洗10 min。滴加麗春紅品紅染色液染色10 min，蒸餾水沖洗。滴加磷鉬酸溶液處理約10 min，傾去液體，滴加苯胺藍襯染5 min，蒸餾水沖洗，滴加弱酸處理2 min。使用95%乙醇快速脫水，無水乙醇脫水3次，每次5～10 s。二甲苯透明3次，每次1～2 min，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察心肌梗死情況和膠原纖維沉積，每只動物隨機選擇5個視野，采用Image J 1.50b軟件計算梗死面積和膠原纖維含量。梗死面積（%）=（梗死區心外膜周長+梗死區心內膜周長）÷（左心室心外膜周長+左心室心內膜周長）×100%，膠原纖維含量（%）=藍色染色面積÷視野總面積×100%。

2.8 ELISA檢測

預冷PBS沖洗心肌組織，稱重后按1∶9加入PBS研磨，4 ℃、5 000×g離心10 min，取上清液。將ELISA試劑盒平衡至室溫，設置標準品孔和樣本孔，每個標準品孔加標準品50 μL，樣本孔加入待測血清或組織樣本50 μL，每孔各加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，封板，37 ℃烘箱孵育60 min。將液體倒掉，濾紙拍干，加入洗滌液300 μL，靜置1 min，倒掉洗滌液，拍干，重復5次。加入底物A和底物B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。加終止液50 μL，酶標儀波長450 nm處測定各孔OD值，根據標準曲線計算樣品中SDF-1、SCF、VEGF含量。

3 統計學方法

4 結果

4.1 誘導多能干細胞誘導分化及鑒定

iPSC呈克隆樣生長，克隆與周邊界限明顯且克隆內細胞呈圓形或橢圓形，核質較大（見圖1A、圖1B）。cTnT是心肌細胞特異性標志物，iPSC經誘導分化后得到心肌細胞，可見大部分細胞表達cTnT（見圖1C）。

圖1 iPSC形態及向心肌細胞分化（標尺=25 μm）

4.2 冠心丹參滴丸聯合心肌細胞移植對模型大鼠心功能的影響

冠心丹參滴丸組干預期間死亡1只、細胞移植組超聲心動圖檢測時死亡1只。與假手術組比較，模型組大鼠 EF、 FS 明 顯 降 低 （P<0.01）， LVDd、 LVDs、LVEDV、LVESV明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，細胞移植組和聯合組大鼠EF、FS明顯升高（P<0.01），LVDs、LVESV明顯降低（P<0.05，P<0.01）；與細胞移植組比較，聯合組大鼠EF、FS 明顯升高（P<0.01）；與冠心丹參滴丸組比較，聯合組大鼠EF、FS明顯升高，LVDs、LVESV 明顯降低（P<0.05，P<0.01）。各組LVDd、LVEDV差異無統計學意義（P>0.05）。見圖2、表1。

表1 各組大鼠心功能指標比較（）

表1 各組大鼠心功能指標比較（）

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與細胞移植組比較，#P<0.05；與冠心丹參滴丸組比較，&P<0.05，&&P<0.01

LVESV/μL 28.07±18.88 210.49±52.61△△138.84±71.76*163.04±41.04 94.49±48.15**&組別假手術組模型組細胞移植組冠心丹參滴丸組聯合組只數10 8 7 7 8 EF/%86.03± 7.61 35.14±10.35△△55.50±10.40**43.32± 5.80#68.23±11.80**#&&FS/%57.62±9.72 17.68±5.86△△30.26±7.10**22.20±3.55 40.05±9.34**#&&LVDd/mm 6.05±0.68 7.76±0.80△△7.47±0.96 7.36±0.97 7.30±1.17 LVDs/mm 2.60±0.81 6.38±0.73△△5.24±1.09*5.71±0.63 4.40±1.07**&LVEDV/μL 185.86± 44.66 326.11± 74.38△△301.26± 92.22 291.65± 86.10 288.70±103.66

圖2 各組大鼠超聲心動圖

4.3 冠心丹參滴丸聯合心肌細胞移植對模型大鼠心肌組織梗死面積和膠原纖維含量的影響

顯微鏡下觀察，膠原纖維被染成藍色。與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織梗死面積和膠原纖維含量明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，細胞移植組和聯合組大鼠心肌組織梗死面積和膠原纖維含量明顯減少（P<0.01）；與細胞移植組比較，聯合組大鼠心肌組織梗死面積明顯減少（P<0.01），冠心丹參滴丸組大鼠心肌組織梗死面積和膠原纖維含量明顯增加（P<0.05，P<0.01）；與冠心丹參滴丸組比較，聯合組大鼠心肌組織梗死面積和膠原纖維含量明顯減少（P<0.01）。見圖3、圖4、表2。

表2 各組大鼠心肌組織梗死面積和膠原纖維含量比較（，%）

表2 各組大鼠心肌組織梗死面積和膠原纖維含量比較（，%）

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01；與細胞移植組比較，#P<0.05，##P<0.01；與冠心丹參滴丸組比較，&&P<0.01

膠原纖維含量0 64.33±4.15△△45.36±5.55**60.27±4.56##40.40±6.21**&&組別假手術組模型組細胞移植組冠心丹參滴丸組聯合組只數10 8 7 7 8梗死面積0 58.15±5.56△△46.77±5.37**54.63±4.81#30.03±6.94**&&##

圖3 各組大鼠心肌組織形態（Masson染色）

圖4 各組大鼠梗死心肌組織膠原纖維形態（Masson染色，標尺=50 μm）

4.4 冠心丹參滴丸聯合心肌細胞移植對模型大鼠旁分泌的影響

在心肌組織中，與假手術組比較，模型組大鼠SDF-1、SCF、VEGF含量有增加趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）；與模型組比較，細胞移植組、冠心丹參滴丸組和聯合組大鼠SDF-1、SCF、VEGF含量明顯增加（P<0.01）；與細胞移植組比較，聯合組大鼠SDF-1、SCF、VEGF含量明顯增加（P<0.01）；與冠心丹參滴丸組比較，聯合組大鼠SCF、VEGF含量明顯增加（P<0.05）。

在血清中，與假手術組比較，模型組大鼠SDF-1、SCF、VEGF差異無統計學意義（P>0.05）；與模型組比較，聯合組大鼠SDF-1、VEGF含量明顯增加（P<0.01）；與冠心丹參滴丸組比較，聯合組大鼠SDF-1含量明顯增加（P<0.05）。各組SCF差異無統計學意義。見表3。

表3 各組大鼠心肌組織和血清SDF-1、SCF、VEGF含量比較（）

表3 各組大鼠心肌組織和血清SDF-1、SCF、VEGF含量比較（）

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與細胞移植組比較，#P<0.05，##P<0.01；與冠心丹參滴丸組比較，&P<0.05

心肌組織/（pg/mg）血清/（pg/mL）組別假手術組模型組細胞移植組冠心丹參滴丸組聯合組只數10 VEGF 6.23±1.20 5.23±1.86 8.09±0.81 9.33±3.16*10.49±2.04**SCF 0.40±0.06 0.39±0.05 0.44±0.06 0.39±0.07 0.46±0.06 SDF-1 45.28± 6.91 50.26± 4.27 80.47±11.40**103.02± 6.58**#113.99±15.20**##SCF 195.85±21.65 203.24±20.78 247.87±20.87**263.72±23.73**303.26±16.68**##&VEGF 263.00±32.58 279.43±15.70 339.34±22.04**353.27±11.0**393.40±17.64**##&SDF-1 3.25±1.20 5.42±1.94 8.61±1.71 7.80±1.72 12.24±3.93**&8 7 7 8

5 討論

干細胞是具有自我復制和多向分化潛能的原始細胞，在一定條件下，可以分化為多種功能細胞或組織器官。目前，已經開始的Ⅲ期臨床試驗進一步證實干細胞再生醫學在MI治療中的有效性[7]。MI后，局部組織缺血缺氧，產生氧化應激反應，使微環境發生改變，絕大部分干細胞在移植后很短時間內丟失或死亡[8-10]。Montazeri等[11]設計了一種同時移植人心臟前體細胞和嵌入纖維蛋白水凝膠的優化產氧微粒的策略，可以更有效地治療急性MI，其機制可能是提供富氧微環境，從而調節移植細胞存活和分化。大量研究表明，通過聯合生物材料改善干細胞移植微環境可以顯著提高干細胞移植治療心肌損傷的效果[12-14]。局部固化的可注射性金納米粒子-透明質酸水凝膠基質能夠增強移植的iPSC源性心肌細胞縫隙連接的形成并促進心臟修復[15]。然而，生物材料在臨床中的應用還存在諸多問題，包括注射方式、生物相容性及可降解性等。

中醫藥對于心血管疾病的防治具有多途徑、多層次、多靶點的整體調節、綜合治療作用。對以往文獻進行總結發現，將干細胞移植與中藥相結合可起到協同增效、優勢互補作用，可發揮中西醫結合的優勢[16-18]。丹參滴丸聯合臍帶血單核細胞移植可以明顯提高移植細胞的存活率，抑制心肌細胞凋亡，降低氧化應激和炎癥反應，從而改善心功能[19]。銀杏葉提取物761可改善缺血心肌微環境，促進移植MSC的活力，顯著提高干細胞移植改善心功能的作用[20]。前期研究發現，丹酚酸B預處理可提高MSC的存活和向內皮細胞分化，減少梗死面積，增加室壁厚度和血管新生，更有利于心功能恢復，但丹酚酸B 預處理并未促進MSC移植后向心肌細胞分化[21]。研究表明，丹參和三七有效成分對干細胞分化和動員具有一定促進作用[22-23]。本研究結果表明，冠心丹參滴丸對iPSC誘導分化的心肌細胞移植治療MI有促進作用。因此，中醫藥有望成為調控干細胞存活和分化的重要策略和手段。

近年來，iPSC的制備及其向心肌細胞和血管細胞的分化為缺血性心臟病的治療提供了新方向。研究表明，iPSC移植的有效性由其旁分泌作用介導[24]，iPSC分化的心肌細胞的外泌體可改善心功能，但不會增加致心律失常并發癥的發生率[25]。有研究表明，iPSC及其來源的心肌細胞移植后存活細胞數量很少，表明旁分泌作用可能是其修復心肌損傷的基礎[26]。SDF-1對干細胞動員具有重要作用，在MI后立即上調，并在7 d內下調，可誘導治療性干細胞歸巢至受損心肌[27]。在MI豬模型中，iPSC移植可提高VEGF水平，通過促進血管生成和改善不良心室重構恢復心功能[28]。此外，MI后心臟特異性過表達SCF促進心外膜激活和動脈生成[29]。本研究結果顯示，冠心丹參滴丸聯合心肌細胞移植可顯著提高大鼠梗死心肌組織SDF-1、SCF、VEGF含量，提示iPSC來源的心肌細胞移植可能通過旁分泌途徑改善受損的心功能。

綜上所述，冠心丹參滴丸聯合iPSC誘導分化的心肌細胞移植能明顯改善MI模型大鼠心功能，減少梗死面積，其機制可能與促進旁分泌作用有關。本研究可為MI等缺血性心臟病的治療提供新策略。