溫陽振衰顆粒對腎間質纖維化模型大鼠細胞焦亡及腎間質纖維化的影響

袁軼峰，蔡虎志，王敏，李琰，歐陽過，陳新宇

湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是各種原因引起慢性腎臟結構和功能障礙的臨床綜合征，日益成為世界范圍內公認的公共衛生問題。慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）是CKD進展至后期的共同結局，具有高患病率、高致殘率特點[1]。目前尚缺乏有效延緩CRF進展的措施，導致CRF患者預后不良。腎臟纖維化是導致腎臟結構和功能受損的重要途徑[2-4]，抑制腎臟纖維化是延緩CRF進展的有效措施[5-6]。NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路介導的細胞焦亡在多種疾病中發揮重要作用[7-8]。溫陽振衰顆粒由陳新宇教授根據多年臨床經驗擬定，課題組前期研究發現，溫陽振衰顆粒可改善慢性腎功能衰竭患者腎纖維化[9]。本實驗基于NLRP3/Caspase-1通路觀察溫陽振衰顆粒對腎間質纖維化大鼠細胞焦亡及腎臟纖維化的影響，進一步明確其治療腎臟纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雄性SD大鼠50只，體質量（220±20）g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物房，溫度22～26 ℃，濕度50%～60%，光暗周期12 h。自由攝食飲水。

1.2 藥物

溫陽振衰顆粒（制附片、干姜、茯苓、紅參、麥冬、五味子、甘草以10∶10∶15∶6∶15∶10∶10比例配伍），由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供，8 g/袋，以生理鹽水溶解，配制成濃度為0.072 g/mL溶液。

1.3 主要試劑與儀器

PBS（上海Wellbio，貨號WB00001），NLRP3抑制劑MCC950（美國AbMole，貨號M04359），蘇木素（上海Wellbio，貨號WB03008B），伊紅（上海Wellbio，貨號WB03008A），DAB試劑盒（北京中杉金橋，貨號ZLI-9018），二步法試劑盒（北京中杉金橋，貨號PV-9000），肌酐試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號C011-2-1），尿素氮試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號C013-2-1），Tris（德國Sigma，貨號V900483），RIPA 裂解液（上海碧云天，貨號P0013B），蛋白酶抑制劑（北京金泰宏達，貨號583794），磷酸酶抑制劑（北京普利萊，貨號P1260），顯影液（上海佳信，貨號BW-61），定影液（上海佳信，貨號BW-62），Super ECL Plus超敏發光液（美國Advansta，貨號K-12045-D50），反轉錄試劑盒（北京康為世紀，貨號CW2569），Trizol（美國Thermo，貨號15596026），Ultra SYBR Mixture（北京康為世紀，貨號CW2601），FAM-YVAD-FMK（英國Abcam，貨號ab219935），Caspase-1、白細胞介素（IL）-18、β-actin、轉化生長因子（TGF）-β1、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）抗體（美國Proteintech，貨號分別為22915-1-AP、10663-1-AP、60008-1-Ig、21898-1-AP、55135-1-AP、66761-1-Ig），IL-1β 抗 體 （ 美 國 Invitrogen， 貨 號 PA5-88078），NLRP3抗體（英國Abcam，貨號ab214185），HRP-標記山羊抗小鼠IgG（美國Proteintech，貨號SA00001-1），HRP 標記山羊抗兔IgG（美國Proteintech，貨號SA00001-2）。YD-315切片機，浙江金華益迪試驗器材；BMJ-A包埋機，常州中威電子儀器；BA210T顯微鏡，廈門Motic；H1650R臺式冷凍離心機，湖南湘儀；DYY-6C電泳儀，北京六一；DYCZ-40D轉膜儀，北京六一；BioPrep-24 生物樣品均質儀，杭州奧盛；Chemiscope6100 化學發光成像系統，廣州勤翔；Quant Studio1熒光定量RCP儀，美國Thermo。

1.4 分組、造模及給藥

50只大鼠適應性飼養1周后按體質量分層，隨機分為空白組、假手術組、模型組、抑制劑組和溫陽振衰顆粒組，每組10只。參考文獻[10]建立腎間質纖維化大鼠模型：腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，左中腹部切約1 cm縱向切口，鈍性分離皮下組織及肌層，暴露左側腎臟，游離左側輸尿管，穿線結扎并剪斷左側輸尿管，逐層縫合切口。空白組不予處理，假手術組只暴露腎臟，游離左側輸尿管，不做結扎，其余操作相同。

各組分別于造模后次日給藥，給藥劑量參考人與大鼠體表面積折算，抑制劑組予1 mg/mL MCC950生理鹽水溶液[20 mg/（kg·d）]腹腔注射，溫陽振衰顆粒組予溫陽振衰顆粒溶液1.44 g/（kg·d）灌胃，每日2次，模型組、假手術組灌胃等量生理鹽水，連續14 d。

1.5 指標檢測

1.5.1 血肌酐、血尿素氮含量

末次給藥后禁食8 h，水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈取血3 mL，3 000 r/min離心15 min，收集血清，試劑盒檢測血肌酐（SCr）、血尿素氮（BUN）含量。

1.5.2 腎組織病理觀察

取血后摘取左腎，取部分腎組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定48 h，常規石蠟包埋，切片，HE和Masson染色觀察組織病理變化及膠原纖維分布情況。

1.5.3 免疫組化檢測

腎組織石蠟切片脫蠟、抗原修復后，滴加TGF-β1一抗（1∶200）、α-SMA一抗（1∶400）、Col-Ⅰ一抗（1∶200），4 ℃孵育過夜，滴加二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片。光鏡下觀察，陽性染色為黃色至棕褐色，每張切片選取3個陽性表達區域拍照，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算陽性表達的平均光密度。

1.5.4 Western blot檢測

取適量腎組織，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，將膜浸入5%脫脂奶粉-PBST溶液，室溫封閉60 min，4 ℃過夜。加入NLRP3一抗（1∶1 000）、Caspase-1一抗（1∶1 000）、IL-18一抗（1∶2 000）、IL-1β 一抗（1∶2 000）、β-actin 一抗（1∶2 000），4 ℃孵育過夜，加入HRP標記山羊抗小鼠IgG（1∶6 000）、HRP標記山羊抗兔IgG（1∶6 000），室溫孵育1 h，ECL化學發光法顯影，凝膠成像儀測定蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值與內參蛋白灰度值比值計算蛋白相對表達量。

1.5.5 RT-PCR檢測

取少量腎組織，加入Trizol 充分研磨，提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度。以RNA為模板，反轉錄合成cDNA，SYBR法進行RT-qPCR實驗。使用Primer Express 5.0 軟件設計引物（見表1），以β-actin為內參，2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

表1 各基因PCR引物序列

1.5.6 細胞焦亡檢測

腎組織石蠟切片經脫蠟、抗原修復后，滴加FAMYVAD-FMK（1∶50）熒光染料（綠色）、碘化丙啶（紅色），37 ℃恒溫箱孵育1 h，洗滌液沖洗3 min×3次；加入DAPI（藍色），37 ℃染核10 min，PBS沖洗5 min×3次，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察細胞焦亡情況，藍色為活細胞，焦亡細胞可見綠色+紅色熒光，計算細胞焦亡率。細胞焦亡率（%）=陽性細胞數÷總細胞數×100%。

1.6 統計學方法

采用SPSS19.0和DPS14.1統計軟件進行分析。計量資料用表示，多組間比較用方差分析，Levene檢驗方差齊性，方差齊用LSD 法，方差不齊用Tamhane"s T2法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 造模情況

空白組及假手術組大鼠腎臟無腫脹，腎臟顏色有光澤，輸尿管無擴張；模型組大鼠左側腎臟腫大、顏色偏淺，左側輸尿管結扎處至腎臟擴張明顯，左腎明顯大于右腎，腎實質變薄；抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠左側腎臟腫脹程度較模型組減輕，左側輸尿管結扎處以上擴張。

2.2 溫陽振衰顆粒對模型大鼠血肌酐、血尿素氮含量的影響

與假手術組比較，模型組大鼠SCr、BUN含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠SCr、BUN 含量顯著減少（P<0.01）。見表2。

表2 各組大鼠SCr、BUN含量比較（）

表2 各組大鼠SCr、BUN含量比較（）

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

BUN/（mmol/L）8.85±2.70 8.70±2.24 18.46±2.69△△14.82±1.79**14.28±2.23**組別空白組假手術組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組只數10 10 10 10 10 SCr/（μmol/L）31.88±4.91 29.48±5.10 61.57±6.38△△46.22±7.33**45.44±8.45**

2.3 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織病理變化的影響

HE及Masson染色顯示，空白組和假手術組大鼠腎小球、腎小管結構完整，無明顯病理改變；模型組大鼠可見腎小管擴張，炎性細胞浸潤，間質纖維化明顯，腎小球形態破壞，結構不完整，大量炎性細胞浸潤；抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎小管、腎小球損傷程度較模型組減輕，腎間質纖維化減少。見圖1、圖2。

圖1 各組大鼠腎組織形態（HE染色，×400）

圖2 各組大鼠腎組織形態（Masson染色，×400）

2.4 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織轉化生子因子-β1、α-平滑肌肌動蛋白、Ⅰ型膠原蛋白表達的影響

陽性染色主要表達于遠端腎小管上皮細胞。與假手術組比較，模型組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ表達顯著降低（P<0.01）。見圖3～圖5、表3。

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達比較（，平均光密度，×10-3）

表3 各組大鼠腎組織TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達比較（，平均光密度，×10-3）

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

組別空白組假手術組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組Col-Ⅰ2.1±0.5 1.5±0.6 34.0±9.0△△18.6±5.0**15.6±7.1**只數10 10 10 10 10 TGF-β1 0.6±0.4 0.9±1.2 14.6±5.9△△5.6±3.1**4.3±1.7**α-SMA 0.4±0.2 0.6±0.4 14.1±4.3△△5.9±2.7**4.3±1.1**

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖4 各組大鼠腎組織α-SMA陽性表達（免疫組化染色，×400）

圖5 各組大鼠腎組織Col-Ⅰ陽性表達（免疫組化染色，×400）

2.5 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織NOD樣受體蛋白3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細胞介素-18、白細胞介素-1β蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β 蛋白表 達顯著升高 （P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達顯著降低（P<0.01）。見圖6、表4。

表4 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達比較（，相對表達量）

表4 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白表達比較（，相對表達量）

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

組別空白組假手術組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組IL-1β 0.27±0.06 0.29±0.07 0.76±0.13△△0.50±0.12**0.54±0.11**只數10 10 10 10 10 NLRP3 0.26±0.07 0.26±0.07 0.69±0.13△△0.51±0.10**0.44±0.09**Caspase-1 0.28±0.07 0.30±0.06 0.79±0.12△△0.53±0.08**0.55±0.06**IL-18 0.27±0.07 0.27±0.09 0.76±0.13△△0.52±0.12**0.48±0.15**

圖6 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β蛋白免疫印跡

2.6 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織NOD樣受體蛋白3、半胱氨酸蛋白酶-1、白細胞介素-18、白細胞介素-1β mRNA表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA 表達顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA表達顯著降低（P<0.01）。見表5。

表5 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA表達比較（）

表5 各組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1、IL-18、IL-1β mRNA表達比較（）

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

組別空白組假手術組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組IL-1β 0.88±0.27 0.90±0.40 3.71±1.37△△2.07±0.80**2.31±0.91**只數10 10 10 10 10 NLRP3 1.08±0.18 1.05±0.32 3.55±0.36△△2.27±0.32**2.03±0.50**Caspase-1 0.83±0.16 1.03±0.27 3.74±0.87△△1.80±0.54**1.71±0.34**IL-18 0.95±0.28 0.98±0.21 4.19±0.62△△2.18±0.16**2.37±0.36**

2.7 溫陽振衰顆粒對模型大鼠腎組織細胞焦亡的影響

與假手術組比較，模型組大鼠腎組織細胞焦亡率顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，抑制劑組和溫陽振衰顆粒組大鼠腎組織細胞焦亡率顯著減少（P<0.01）。見表6、圖7。

表6 各組大鼠腎組織細胞焦亡率比較（，%）

表6 各組大鼠腎組織細胞焦亡率比較（，%）

注：與假手術組比較，△△P<0.01；與模型組比較，**P<0.01

細胞焦亡率組別 只數0.90±0.49 0.76±0.40 12.54±3.81△△2.82±0.71**2.78±0.99**空白組假手術組模型組抑制劑組溫陽振衰顆粒組10 10 10 10 10

圖7 各組大鼠腎組織細胞焦亡陽性表達（免疫熒光染色，×400）

3 討論

CKD屬中醫學“水腫”“癃閉”“關格”等范疇，其基本病機為本虛標實，以腎元虛衰為本，兼具水濕、痰濁、瘀血等標實之證。《素問?陰陽應象大論篇》有“陽化氣，陰成形”，腎元虧虛則水液不運，飲溢于肌表則發為“水腫”，濕邪濁毒壅滯于下焦則發為“癃閉”，水谷不下則變為“關格”，皆由陽氣虧虛所致。腎為先天之本，為“五臟陰陽之本”，故腎陽為一身陽氣之根本。CRF病位在腎，涉及肺、脾、肝等臟腑，陽氣虧虛在疾病的發展過程中起主導作用。溫陽振衰顆粒由制附片、紅參、干姜、茯苓、五味子、麥冬、甘草組成。制附片溫通陽、暖命門、溫坎水、破陰凝，紅參大補元氣、復脈固脫，二者合而為君；干姜大熱無毒，守而不走，茯苓健脾滲濕，可補后天脾土，二者相伍則土得火生而中氣可復，火得土覆而火可久存，為臣藥；另以麥冬養陰生津，五味子五味皆備而酸獨勝，以五味子之酸斂固澀固護陽氣、斂火歸元，使陽氣不外泄，為佐藥；甘草味甘性平，一可減附子之毒，二則調和諸藥，為使藥。諸藥合用，共奏溫陽益氣、固陽化陰之功。

腎臟纖維化是各種CKD的共同病理結局，其中炎性細胞浸潤引發的免疫反應在腎纖維化過程中發揮關鍵作用[11]。近年研究表明，多種腎臟炎癥反應可激活NLRP3炎性小體[12-13]，通過IL-1等促炎性細胞因子觸發先天性免疫防御，以響應如感染、代謝失調等危險信號。同時，NLRP3/Caspase-1炎癥通路介導的細胞焦亡在腎臟疾病中也發揮著重要作用[14-15]。細胞焦亡不同于細胞凋亡、壞死、脹亡和自噬，表現為細胞膜破裂并釋放促炎性細胞內容物，是對刺激因素的一種過度應答反應。當機體受到內源性或外源性信號刺激時，模式識別受體通過識別病原相關分子模式和損傷相關分子模式導致炎性小體多蛋白復合物組裝及Caspase-1前體活化，活化的Caspase-1一方面誘導焦亡發生，另一方面剪切細胞因子pro-IL-1β和pro-IL-18 使其成熟和分泌IL-1β和IL-18，IL-1β和IL-18釋放到胞外以介導炎癥級聯反應[16-17]。

在腎臟非免疫性實質細胞中，小管上皮細胞可通過激活NLRP3炎性小體表達和釋放IL-18，由此觸發小管上皮細胞炎性反應和焦亡[17]。本研究結果也表明，模型組大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1表達升高，炎癥因子IL-18、IL-1β表達升高，細胞焦亡率增加，纖維化相關指標TGF-β1、α-SMA、Col-Ⅰ蛋白表達升高，腎間質纖維化明顯。使用NLRP3 抑制劑MCC950 干預后，大鼠腎組織NLRP3、Caspase-1表達降低，炎癥因子及纖維化相關指標表達降低，細胞焦亡率減少，腎間質纖維化有所改善，與溫陽振衰顆粒組結果一致。表明NLRP3/Caspase-1炎癥通路介導的細胞焦亡在腎間質纖維化過程中起重要作用，溫陽振衰顆粒可能通過干預NLRP3/Caspase-1通路介導細胞焦亡，進而抑制腎臟纖維化，改善腎功能。