隔藥餅灸對動脈粥樣硬化易損斑塊兔Beclin1、LC3蛋白表達的影響

饒澤華，吳雪芬，馬逸杰，廖意娟，宋家薇，易麗貞，劉欣，岳增輝

湖南中醫藥大學針灸推拿學院，湖南 長沙 410208

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病的病理基礎，AS斑塊破裂形成血栓是引發急性心血管事件的重要原因。斑塊易損性是血栓形成的決定因素。AS易損斑塊的特點是豐富的脂質核心，浸潤明顯的巨噬細胞、泡沫細胞或炎癥細胞，尤其巨噬細胞可通過吞噬或分泌作用，產生纖溶蛋白酶原激活物及基質金屬蛋白酶等降解細胞外基質，致纖維帽變薄[1-2]。研究AS斑塊不穩定因素，盡早識別易損斑塊并有效干預，促使其向穩定方向轉變，是預防心血管事件發生的重要策略。巨噬細胞是AS斑塊中最主要的細胞，在AS病變早期，巨噬細胞凋亡可抑制炎癥反應，但在AS病變后期，其凋亡會加速壞死核形成，破壞AS斑塊穩定性，這與巨噬細胞自噬水平密切相關[3]。因此，調節易損斑塊中細胞自噬水平對穩定AS易損斑塊具有重要作用。Beclin1是自噬起始階段的重要調節蛋白，與自噬水平呈正相關。LC3是自噬體的特異性蛋白，當自噬發生時，胞質型LC3Ⅰ轉化成LC3Ⅱ并附著在自噬體膜上，參與自噬底物的降解。他汀類藥物能夠穩定易損斑塊，但長期應用可引起肝功能不全及肌痛等不良反應，使其應用受到限制[4]。

隔藥餅灸是結合艾灸、藥物和腧穴三者共同作用的中醫外治療法。研究表明，隔藥餅灸可調節AS兔血脂水平，抑制AS進展[5-7]，但其能否通過調節自噬穩定AS易損斑塊目前尚不清楚。因此，本研究以隔藥餅灸為干預手段，觀察其對AS易損斑塊兔Beclin1、LC3蛋白表達的影響，探討隔藥餅灸穩定AS易損斑塊的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性新西蘭大耳白兔58只，體質量1.8～2.2 kg，湖南太平生物科技有限公司提供，動物許可證號SCXK（湘）2020-0005。單籠飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，室溫25 ℃、濕度50%～70%環境，12 h明暗交替。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批（LL2019081905）。高脂飼料，湖南嘉泰實驗動物有限公司提供，含83.8%基礎飼料、1%膽固醇、10%蛋黃粉、5%豬油和0.2%丙基硫氧嘧啶。

1.2 藥物及制備

丹參、郁金、山楂、澤瀉、大黃藥粉，購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，按等比例取上述藥粉3～5 g，以醋調成糊狀，制成厚3 mm、直徑1 cm的藥餅。阿托伐他汀鈣片，美國輝瑞公司，批號1237304。

1.3 主要試劑與儀器

艾炷（南陽昊翔藥業有限公司，5 mm×10 mm）；斑點蝰蛇毒（廣西醫科大學蛇毒研究所制備）；Ad5-p53重組載體（深圳賽百諾基因技術有限公司，批號20130602）；組胺（上海三杰生物技術有限公司，批號20110901）；總膽固醇（TC）ELISA試劑盒（江蘇艾迪生生物科技有限公司，貨號ZF014）；三酰甘油（TG）ELISA試劑盒（江蘇艾迪生生物科技有限公司，貨號ZF013）；Beclin1 抗體（美國Immunoway 公司，貨號YM3363）；LC3 抗體（美國CST 公司，貨號12741）。球囊擴張導管（3.0～3.5 mm×15 mm）、導引導管（145 cm×0.84 mm）、導引導絲（14 mm×195 cm）、手推式球囊擴張壓力泵（30 atm/20 mL），美國Cordis公司；臺式高速冷凍離心機（型號D3024R），北京大龍儀器；立式冷藏陳列柜（型號LSC-316C），浙江星星科技股份有限公司；高速組織研磨儀（型號KZ-Ⅱ），武漢賽維爾生物科技有限公司；超薄切片機（型號UC7），德國Leica公司；酶標儀（型號RT-6100），美國Rayto 公司，凝膠成像系統（型號alphaEase FC），美國Alpha Innotech公司，顯微鏡（型號E100），日本Nikon公司。

1.4 造模

所有兔適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為空白組10只和手術組48只。采用高脂飼料喂養+腹主動脈球囊損傷+基因轉染+藥物觸發斑塊破裂法[8]制備模型，空白組予普通飼料喂養，手術組予高脂飼料喂養，2周后對手術組兔行腹主動脈球囊損傷術：兔經耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉，肝素鈉抗凝（200 U/kg），將兔固定于兔臺，右后肢大腿內側剪毛備皮，絡合碘常規消毒，在股動脈搏動明顯處縱行切開皮膚，游離股動脈約2 cm，結扎遠心端，動脈夾夾閉近心端，并在股動脈近心端穿線打一活結，準備術后結扎。將股動脈剪一小口，送入導引導絲，松開動脈夾，沿導引導絲將球囊導入腹主動脈，長度約20 cm，用球囊擴張壓力泵向球囊注入肝素鈉生理鹽水，保持壓力泵讀數為6～8 atm（1 atm=101.325 kPa），抗阻力牽拉球囊導管至髂動脈，抽空球囊，45 s后再次將球囊導管送入20 cm深度處，重復3次。術后結扎股動脈近心端，逐層縫合皮膚，消毒，連續3 d肌肉注射青霉素（40萬U/d）預防感染。手術過程死亡4只，剩余44只兔再隨機分為模型組、直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組，每組11只。術后繼續予高脂飼料喂養，同時進行相應干預，共8周。

干預結束后停止高脂飼料喂養，改為普通飼料，對所有手術組兔進行腹主動脈斑塊局部基因轉染。選取左后肢大腿內側股動脈，術前準備及送入球囊導管操作同腹主動脈球囊損傷術，用球囊擴張壓力泵向腹主動脈斑塊局部注入20 μL滴度為1.0×1012VP/mL的Ad5-p53 重組載體，術后操作同前。基因轉染時間為2周。

分別于動物處死前48、24 h腹膜下注射中國斑點蝰蛇毒（0.15 mg/kg），30 min 后耳緣靜脈注射組胺（0.02 mg/kg），共觸發2次。

1.5 干預方法

取穴分為2組，1組“巨闕”、雙側“天樞”“豐隆”，2組雙側“心俞”“肝俞”“脾俞”。參照《實驗針灸學》[9]取穴定位，直接灸組將兔固定于兔臺，取穴處剪毛，將艾炷（下有紙制墊盤）粘于穴位處，點燃施灸，待艾炷燃完且余熱散盡后，再換另一壯，每穴每日連灸3壯（約30 min），2組穴位隔日交替施灸；隔藥餅灸組將兔固定于兔臺，取穴處剪毛，將藥餅貼于穴位處，將艾炷（去除紙質墊盤）置于藥餅上點燃，取穴及其余操作同直接灸組；西藥組將阿托伐他汀鈣片研磨成粉，按1.96 mg/（kg·d）劑量拌入高脂飼料中，并每日進行相同固定操作，每次30 min；空白組和模型組兔每日僅固定，不干預，每次30 min。以上干預連續8周。

1.6 取材

干預結束后取材。取材前12 h禁食不禁水，耳緣靜脈注射20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉兔，仰臥固定于兔臺，腹部剪毛后，沿腹中線開腹，游離主動脈弓至髂總動脈分叉處主動脈全長，采血針平行血管穿刺，取動脈血2 mL于抗凝管中，3 000 r/min離心10 min，取離心后血清，放于新的EP管，置于-20 ℃冰箱保存備用。采血完成后，用眼科剪將腹主動脈剪下，生理鹽水沖洗，剪取米粒大小腹主動脈組織，迅速置于2.5%戊二醛中固定24 h以上，置于4 ℃冰箱冷藏備用，剩余腹主動脈組織置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.7 指標檢測

1.7.1 一般狀態觀察

每日觀察兔精神狀態、動作靈敏性、反應敏捷性、毛發光澤度、體質量變化、飲食量、飲水量及大小便顏色形態等。

1.7.2 ELISA檢測

取離心后血清，采用ELISA試劑盒檢測TC和TG含量，嚴格按試劑盒說明書操作，酶標儀波長450 nm處測量各孔吸光度（OD值），計算血清TC和TG含量。

1.7.3 透射電鏡觀察

取出2.5%戊二醛固定24 h以上的腹主動脈組織，1%鋨酸固定2 h，50%、70%、90%、100%丙酮脫水，每次15 min。置于丙酮-812包埋劑（1︰1）中，37 ℃烤箱滲透2～4 h，丙酮-812包埋劑（1︰2）37 ℃滲透過夜，812包埋劑37 ℃滲透5～8 h后烤箱包埋過夜，60 ℃烤箱聚合48 h，超薄切片（厚度60～80 nm），醋酸鈉、硝酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察。

1.7.4 Western blot檢測

取適量腹主動脈組織，加入裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，80 μg蛋白上樣，凝膠電泳分離蛋白，轉至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶室溫孵育2 h，分別加入Beclin1和LC3一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，加入相應二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。ECL發光液顯影，凝膠成像系統成像，采用Quantity One 4.4.0軟件分析，以目的蛋白與內參蛋白灰度值比值計算蛋白相對表達量。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 隔藥餅灸對模型兔一般狀態的影響

最終存活42只兔，其中空白組8只、模型組9只、直接灸組9只、隔藥餅灸組7只、西藥組9只。與空白組比較，模型組兔精神狀態萎靡，活動減少，毛發光澤度降低，體質量增加，大便成形、顏色較黑，小便混濁；與模型組比較，各干預組兔精神狀態稍改善，行動遲緩，其他無明顯差異。

2.2 隔藥餅灸對模型兔血清總膽固醇和三酰甘油含量的影響

與空白組比較，模型組兔血清TC和TG含量顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，直接灸組、隔藥餅灸組和西藥組兔血清TC和TG含量顯著減少（P<0.01，P<0.05）。見圖1。

圖1 各組兔血清TC和TG含量比較（，每組7～9只）

2.3 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈超微結構及自噬體形成的影響

空白組兔腹主動脈血管平滑肌細胞包膜完整、呈梭形排列，無脂滴沉積，細胞器結構正常；模型組兔腹主動脈平滑肌細胞轉化成泡沫細胞，其內肌原纖維不可見，泡沫池中有脂滴分布，核周圍出現低電子密度空泡，細胞核局部凹陷呈不規則形狀，粗面內質網、線粒體等細胞器不可見，未見自噬體存在，胞外可見個別膠原纖維存在，大量膠原纖維斷裂、溶解、呈絮狀；直接灸組兔腹主動脈血管平滑肌細胞轉化成泡沫細胞，其內肌原纖維部分保留，泡沫池中含有大量脂滴，主要為圓形或橢圓形，局部出現低電子密度空泡，細胞核呈不規則三角形、局部凹陷，染色質均勻，粗面內質網、線粒體等細胞器不可見，核膜部分區域模糊、雙層膜結構消失，可見自噬體存在，胞外大量膠原纖維斷裂、溶解、呈絮狀；隔藥餅灸組兔腹主動脈血管平滑肌細胞轉化成泡沫細胞，其內肌原纖維不可見，細胞膜與胞外物質溶為一體，脂滴散在分布于泡沫池中，核周圍出現低電子密度空泡，細胞核呈不規則形狀、局部凹陷，染色質均勻，核周隙擴張嚴重，有髓樣殘留物，粗面內質網、線粒體等細胞器不可見，可見自噬體存在，胞外可見個別膠原纖維存在，大量膠原纖維斷裂、溶解、呈絮狀；西藥組兔腹主動脈可見血管平滑肌細胞轉化成泡沫細胞，其內肌原纖維部分保留，胞內出現大面積低電子密度空泡，細胞核呈不規則三角形、局部凹陷，染色質均勻，核膜部分區域模糊，線粒體、粗面內質網等細胞器不可見，未見自噬體存在，胞外可見個別膠原纖維存在，大量膠原纖維斷裂、溶解、呈絮狀。見圖2。

圖2 各組兔腹主動脈超微結構（×7 000）

2.4 隔藥餅灸對模型兔腹主動脈組織Beclin1和LC3蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組兔腹主動脈組織Beclin1蛋白表達顯著升高（P<0.01），LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值有升高趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）；與模型組比較，直接灸組兔腹主動脈組織Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達顯著升高（P<0.01），隔藥餅灸組兔腹主動脈組織Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P<0.01，P<0.05），西藥組LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著升高（P<0.01）；與直接灸組比較，西藥組兔腹主動脈Beclin1蛋白表達顯著降低（P<0.01）。見圖3、圖4。

圖3 各組兔腹主動脈Beclin1、LC3蛋白免疫印跡

圖4 各組兔腹主動脈Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值比較（，每組7～9只）

3 討論

AS的形成與發展和脂質代謝紊亂密切相關。TC主要功能是合成膽汁酸、促進游離脂肪酸的吸收，當其代謝失常時可導致AS發生。TG的主要功能是供能和貯能，可降低纖溶系統活性，增加凝血系統活性，促進AS發生發展[10]。多項研究表明，灸法能有效降低血清TC和TG含量[11-13]。本實驗結果顯示，模型組兔血清TC和TG含量顯著增加，各干預組TC和TG含量均顯著減少，提示隔藥餅灸可改善AS易損斑塊兔血脂水平，抑制AS發展。且與西藥組比較差異無統計學意義，表明隔藥餅灸效果與藥物阿托伐他汀相當。

自噬是生物進行降解和回收利用細胞內生物大分子和受損細胞器的過程[14]，在營養缺乏、組織缺氧、氧化應激及DNA損傷等條件下被激活。巨噬細胞自噬是AS進展中的重要參與者，AS早期階段，內皮結構受損，單核細胞進入血管壁轉化為巨噬細胞，巨噬細胞吞噬氧化型低密度脂蛋白或其他脂蛋白后變成泡沫細胞，最終形成斑塊。機體通過自噬回收利用內源性細胞成分如氨基酸、游離脂肪酸、核苷酸等，以維持細胞穩態[15]。而斑塊中巨噬細胞凋亡及胞葬作用缺陷會促進斑塊壞死，從而導致斑塊不穩定性增加，形成血栓，最終引起急性心腦血管事件[16]。因此，減少斑塊中巨噬細胞浸潤、增加易損斑塊的穩定性可作為治療AS的重要方法之一。本實驗透射電鏡結果顯示，模型組兔腹主動脈平滑肌細胞轉化成泡沫細胞，泡沫池中可見脂滴分布，未見自噬體存在，大量膠原纖維斷裂溶解，表明AS過程中出現泡沫細胞聚集與脂質積累。經干預后，直接灸組和隔藥餅灸組兔腹主動脈泡沫細胞中可見自噬體存在，西藥組部分細胞器及膠原纖維保留，但視野中未見自噬體存在，表明隔藥餅灸干預可促進自噬體形成，增強細胞自噬水平，抑制AS發展。

Beclin1可控制自噬和凋亡的相互轉換[17]，LC3是自噬體的特異性蛋白，研究發現，LC3Ⅱ在AS血管中高表達，而在非AS血管中低表達，LC3Ⅱ可靶向定位于前自噬體和自噬體膜上，與自噬體數量呈正相關[18-19]，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的水平常用于評價自噬水平，比值越大表明自噬水平越高[20]。本實驗結果顯示，模型組兔腹主動脈組織Beclin1 蛋白表達顯著升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值也有升高趨勢，但差異無統計學意義，表明AS發展使細胞自噬功能激活，自噬作為潛在的“補償機制”，發揮抗AS作用。經干預后，隔藥餅灸組兔腹主動脈Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均顯著升高，表明隔藥餅灸干預可提高細胞自噬水平，增加斑塊穩定性。

綜上，隔藥餅灸可能通過上調Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達，提高細胞自噬水平，促進自噬體形成，從而改善血脂水平，穩定斑塊，抑制AS發展。