miR-130a-3p調節有氧代謝提高小鼠運動耐力*

周浩，吳佳韓，陳婷，羅君誼，孫加節，張永亮，習欠云

華南農業大學動物科學學院/廣東省動物營養調控重點實驗室/國家生豬種業工程技術研究中心，廣東 廣州 510642

MicroRNAs（miRNAs）是一類在轉錄后水平參與基因調控并發揮重要作用的非編碼小RNA，主要通過抑制翻譯和降解mRNA 來調節其靶標［1］。30 多年前， 科學家們就在秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans中發現了第一個miRNA，它最初被認為只是一個傳統的蛋白質編碼基因，但隨著研究的深入，科學家們發現它并不編碼蛋白質，而是編碼了一個具有調節功能的22 個核苷酸的RNA，從此人類便開啟了分子生物學的新紀元［2-4］。現在在人類中已有2 000 多種miRNA 被發現，據研究報道它們共同調節了人類基因組中超過1/3 的基因［5］。miRNAs 作為一個熱門研究的調控生長因子，越來越多的研究表明，其在動物機體內能夠參與細胞生長、分化、發育和凋亡等代謝活動，是細胞活動的強大調節者［6-8］。有報道稱，miR-132 可通過靶向DAPK-1 刺激滋養層細胞的生長和侵襲［9］；miR-125b-5p抑制3T3-L1前脂肪細胞增殖并促進成脂分化［10］；miR-383-5p 通過靶向癌性PP2A 抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡［11］。同時，miRNAs 還與癌癥、糖尿病、代謝性疾病等疾病的發病機制息息相關，可作為各種類型的疾病（尤其是癌癥）的預測和診斷的生物標記物［12-14］。研究發現，miR-621 通過靶向TRIM29 通過Wnt/βcatenin信號通路抑制膀胱癌細胞的增殖和轉移［15］；miR-423 在各種人類腫瘤中異常表達，并參與癌癥進展的多個信號通路［16］；miR-26a 可通過改善外周胰島素敏感性和保護β 細胞的功能來緩解2 型糖尿 病［17］；miR-125a-5p 可 以 通 過 靶 向STAT3 抑 制肝臟脂肪生成和糖異生并提高糖原合成，從而改善2 型糖尿病肝糖脂代謝紊亂［18］。隨著各界學者對miRNAs 功能研究的不斷深入發現，miRNAs 與動物機體正常的生長、發育、繁殖等代謝活動密切相關。

近年來，有不少報道稱miRNAs參與調節有氧代謝過程。研究表明，miR-181a/b-1 在成骨過程中通過增加線粒體耗氧率和與ATP 相關的呼吸代謝促進成骨分化［19］；miR-107 通過促進線粒體β-氧化促進肝臟中脂質積累并降低葡萄糖耐受［20］；miR-146a 過表達能促進肝細胞中的線粒體合成與線粒體呼吸［21］；miR-21-5p 參與調節H9C2 細胞的線粒體呼吸和脂質含量［22］；miR-33a/b 靶向抑制調節脂肪酸氧化調節的關鍵酶SIRT6，降低肝臟的脂肪酸氧化與胰島素信號傳導［23］。更有研究表示，有氧代謝向動物機體運動時骨骼肌的收縮提供了大量能量，而適度的有氧運動能增加線粒體的數量并減輕胰島素抵抗［24］。

骨骼肌作為動物機體參與運動、氧化代謝等活動的重要代謝器官，其自身的發育及其對體內能量物質的利用受到外部環境因素以及內部調節因子的共同作用，包括miRNAs。早在2006年，研究顯示miR-1 能促進成肌細胞分化，而miR-133 刺激成肌細胞增殖［25］。近來研究也發現，miR-664-5p 通過靶向血清反應因子SRF 和Wnt1 促進成肌細胞增殖并抑制成肌細胞分化［26］；miR-17-92 促進C2C12 成肌細胞增殖但抑制分化［27］；小鼠骨骼肌中miR-133a 的缺失會導致線粒體合成減少，運動耐力下降［28］；miR-696 通過抑制PGC-1α 降低小鼠骨骼肌線粒體活性，并降低成肌細胞耗氧率［29］；miR-494-3p 可以通過靶向E1A 結合蛋白P300 抑制快速氧化肌纖維的形成，并降低人骨骼肌的基礎耗 氧 率［30］；C2C12 肌 管 中miR-204-5p 的 沉 默 可通過調節PGC-1α 增強線粒體生物合成，同時miR-204-5p 可作為一種人類骨骼肌線粒體的功能調節劑［31］；另有研究發現，miR-499 通過直接靶向Fnip1 激活肌細胞中的AMPK/PGC1α 信號，改變小鼠骨骼肌纖維類型，從而增強運動能力和線粒體活性［32］。上述資料表明，miRNAs 參與了骨骼肌發育以及機體氧化代謝的調節作用。miR-130a 作為miRNAs 的一員，其存在與功能在2006 年首次報道［33］。近年來，有關miR-130a 的研究不斷深入，有報道表明miR-130a-3p 在非酒精性脂肪性肝炎纖維化的發展過程中可直接靶向TGFBR1和TGFBR2負性調節肝星狀細胞活化和增殖［34］；還可通過PTEN/PI3K/Akt 信號通路促進軟骨細胞增殖和減輕骨關節炎［35］，以及通過靶向SnoN 通過TGF-β1 通路抵抗腎臟纖維化［36］等。本實驗室前期研究發現，miR-130a-3p 可以通過靶向PHLPP2 抑制小鼠脂肪合成代謝，并促進葡萄糖轉運蛋白-4（GLUT4）轉位，增加細胞對葡萄糖的吸收作用［37］，同時還可靶向雌激素受體α（ERα）抑制催乳素（PRL）的表達［38］。研究提示，miR-130a 同樣參與了物質代謝的調節，但其是否通過提高營養物質有氧代謝，進而影響骨骼肌的發育及其功能還未見報道。因此，本研究擬通過miR-130a-3p全身性敲除與過表達小鼠為對象，初步探究miR-130a-3p 對小鼠有氧呼吸及其運動能力的作用，為深入研究miR-130a-3p 對骨骼肌能量代謝和運動機能的調節機制提供前期基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

miR-130a-3p 全身性敲除與過表達FVB 小鼠由賽業（廣州）生物科技有限公司通過CRISPR/CAS9基因編輯技術制備［37］。WT 小鼠為普通無特定病原體（SPF，specific pathogen free）級FVB 小鼠。小鼠料為普通SPF 級，符合國家標準，高脂飼料（HFD，60%的能量來自脂質），普通飼料（5%的能量來自脂質），購自于廣東省醫學實驗動物中心（廣東佛山）。試驗動物的飼養和應用遵照《美國國立衛生研究院實驗動物應用指南》進行。所有程序均獲得華南農業大學實驗動物倫理委員會的批準，并按照協議（SCAU-AEC-2016-0714）進行。

1.2 試驗儀器

實時熒光定量PCR 儀（Bio-Rad C1000 Touch，廣州市昊洋貿易有限公司）；小鼠跑步機（瑞沃德生物科技有限公司）；抓握力測定儀器（BIO-GS3，Bioseb，France）；代謝測量系統（Sable Systems International，美國）；分光光度計（Nanodrop 2000，Thermo Fisher，美國）。

1.3 試驗設計與分組處理

選用30 只3 周齡生長性能相近的FVB 雄性小鼠，其中野生型（WT）、miR-130a-3p 過表達（130OE）與miR-130a-3p 敲除（130KO）小鼠各10只。在整個試驗中，使用高脂飼料（HFD）喂養小鼠。所有小鼠均單籠飼養，每天光照和黑暗各12 h，自由采食和飲水。環境相對濕度控制在60%左右，溫度控制在（25±1）℃左右。每3 d 記錄1 次采食量，每7 d記錄1次體質量。

1.4 小鼠肌肉力量與運動耐力檢測

1.4.1 肌肉力量檢測在試驗的第5 周通過小鼠砝碼抓握試驗與抓握力測定試驗檢測肌肉力量。小鼠砝碼抓握試驗方法為：用手抓住小鼠尾巴把小鼠拎起來，迫使小鼠抓住一定質量的砝碼，當小鼠能抓住砝碼并堅持3 s 以上時則認為小鼠可以承受該質量，進入下一質量的砝碼檢測。每一只小鼠均輪流進行檢測，測試結束后統計每組小鼠的得分情況［39］。抓握力測定試驗通過將小鼠置于抓握力測定儀器中，每只小鼠輪流進行一共10 次的拉力試驗，試驗結束后去掉每只小鼠所測得的10 個數據中的最大值與最小值，取剩下數據的平均值用于統計分析。

1.4.2 運動耐力測試測試開始前將跑步機傾斜角度調為10°，每條跑道放入1 只小鼠，先以11 m/min 的速度運動，適應10 min 后休息10 min。然后開始試驗：給予小鼠一個11 m/min 的初速度，每5 min加速4 m/min，直至小鼠靜坐在電網上5 s，即判定為小鼠力竭，記錄每只小鼠的運動時間與距離［40］。

1.5 活體有氧呼吸代謝測量

在飼喂高脂飼料的第6周，通過使用代謝測量系統得到小鼠的O2消耗量（VO2）、CO2產生量（VCO2）和產熱量。

1.6 RNA提取與qRT-PCR

使用Trizol（Invitrogen）從組織中提取總RNA，使用分光光度計對RNA 的濃度進行檢測。使用EZB 4 × EZscript Reverse Transcription Mix Ⅱ逆轉錄試劑盒（海方生物，上海）將總量1 μg的RNA進行逆轉錄，其中miR-130a-3p 使用特異性頸環引物逆轉錄，mRNA 使用OligodT18 逆轉錄。將得到的產物cDNA稀釋5倍使用。

qRT-PCR 通 過 EZB 2× Color SYBR Green qPCR Master Mix（A0012）在實時熒光定量PCR 儀中進行檢測，miRNA 使用U6作為內參，將得到的結果通過2-ΔCt方法進行統計。

1.7 數據統計分析

采用SPSS 24.0 進行單因素方差分析和獨立樣本t檢驗分析。所有統計分析均用Graghpad 7.0 統計軟件完成，結果用平均值±標準誤（mean±S.E.M）表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 實驗結果

2.1 miR-130a-3p 過表達和基因敲除轉基因小鼠的鑒定

為了探究miR-130a-3p 是否參與調節骨骼肌發育以及機體的氧化代謝，我們建立了miR-130a-3p過表達（130OE）和miR-130a-3p 基因敲除（130KO）小鼠模型。在瓊脂糖凝膠電泳中，130OE小鼠中可以檢測到插入的外源基因（圖1a）；測序結果表明，與WT小鼠相比，130KO小鼠中缺失了miR-130a-3p的一段種子序列（圖1b）；通過qRT-PCR 檢測小鼠體內的miR-130a-3p 發現，相對于WT 小鼠，130OE 小鼠的miR-130a-3p 表達量顯著性升高（P＜0.01），130KO 小鼠表達量顯著下降（P＜0.01）（圖1c）。以上結果表明，miR-130a-3p 基因敲除與過表達小鼠模型已成功建立。

圖1 轉基因小鼠模型的構建Fig.1 Construction of transgenic mouse model

2.2 miR-130a-3p 過表達和敲除對小鼠采食量與體質量的影響

在高脂飼喂條件下，每3 d 測量1 次小鼠采食量發現，與WT 小鼠相比，130OE、130KO 小鼠的采食量均無顯著差異（圖2a），表明miR-130a-3p不影響小鼠的采食量；同時，從飼喂高脂飼料第2周開始，130KO 小鼠體質量顯著大于WT 小鼠（P＜0.05）（圖2b）；另外，在整個飼養期間，與WT 小鼠相比，130OE 小鼠的體增量顯著降低（P＜0.05），而130KO 小鼠的體增量顯著升高（P＜0.05）（圖2c）。

圖2 過表達和miR-130a-3p敲除對小鼠采食量與體質量的影響Fig.2 Effects of overexpression and miR-130a-3p knockout on feed intake and body mass in mice

2.3 miR-130a-3p 過表達和敲除對小鼠有氧代謝的影響

隨后我們在代謝籠中檢測3種不同基因型小鼠的O2消耗量、CO2產生量以及產熱量，由圖3 可以得出，130KO 小鼠的O2消耗量顯著低于WT 小鼠（P＜0.01）（圖3a）；且相對于WT小鼠，130OE小鼠CO2產生量有顯著上升（P＜0.01），而130KO 小鼠的CO2產 生 量 顯 著 下 降（P＜0.01）（圖3b）；除此之外，130KO 小鼠的產熱量顯著低于WT 小鼠（P＜0.01）（圖3c）。以上結果表明，miR-130a-3p敲除時會降低小鼠的有氧呼吸代謝，而miR-130a-3p 過表達時也能在一定程度上提高小鼠的有氧呼吸代謝，說明miR-130a-3p 參與機體的有氧代謝活動。

圖3 miR-130a-3p敲除或過表達對小鼠有氧代謝的影響Fig.3 Effects of miR-130a-3p knockout or overexpression on aerobic metabolism in mice

2.4 miR-130a-3p 過表達和敲除對小鼠肌肉力量與運動耐力的影響

由圖4 結果可知，與WT 小鼠相比，130OE、130KO 小鼠在砝碼抓握試驗的抓力得分（圖4a）和抓握力測定試驗（圖4b）中均無顯著差異，表明miR-130a-3p 不影響小鼠的肌肉力量。隨后，我們通過跑步機測量小鼠的運動耐力發現，與WT小鼠相比，130OE 小鼠的運動時間與距離均顯著上升（P＜0.05），而130KO 小鼠的運動時間與距離均極顯著下降（P＜0.01）（圖4c～d），表明miR-130a-3p可以提高小鼠的運動耐力。

圖4 miR-130a-3p過表達和敲除對小鼠肌肉力量與運動耐力的影響Fig.4 Effects of miR-130a-3p overexpression and knockout on muscle strength and exercise endurance in mice

3 討論與結論

運動與有氧氧化代謝是研究肌肉相關功能的重要課題。骨骼肌作為機體運動的重要器官，其收縮的能量主要由無氧代謝途徑和有氧代謝途徑提供，而有氧代謝途徑所產生的能量遠高于無氧代謝途徑，是骨骼肌最有效的ATP 來源［41］。骨骼肌由數以千計的具有收縮功能的肌細胞組成，被稱為肌纖維［42］。在正常情況下，骨骼肌的肌纖維數目在動物出生之前就已經確定，出生后肌肉的生長發育主要體現在肌纖維類型之間的轉變和大小變化，機體在整個生長發育過程中甚至發育成熟后都可能發生肌纖維類型的轉變［43-44］。隨著生物學的發展，肌纖維類型的分類方法也在不斷演變，不同的肌纖維類型之間線粒體含量、ATP酶活性與有氧代謝酶活性均不相同［45］。目前根據肌纖維的代謝類型、代謝酶活性含量等，可將肌纖維分為氧化型和酵解型肌纖維。氧化型肌纖維具有更多的毛細血管與肌紅蛋白，外觀呈紅色，因此也被稱為“紅肌”，含有較多的細胞色素、氧化代謝酶和線粒體，收縮速度較慢，屬于慢收縮肌纖維［46-47］。而酵解型肌纖維的肌紅蛋白和毛細血管較少，被稱為“白肌”，細胞色素、氧化代謝酶和線粒體含量較少，收縮速度較慢，屬于慢收縮肌纖維［48］。由于氧化型與酵解型肌纖維的種種不同，氧化型肌纖維比酵解型肌纖維表現出更強的抗疲勞能力。先前已有研究表明，骨骼肌纖維可以影響身體的耐力水平，優秀的長跑運動員的骨骼肌中含有較高水平的氧化型肌纖維比例［49］。其次，肌纖維的大小數量以及氧化型、酵解型的比例都與生理性衰老和病理性肌萎縮有關［50］。有報告指出，肌營養不良癥患者的氧化型纖維含量較低，出現氧化型向酵解型轉化的現象［51］。這些發現表明，肌纖維類型的比例與肌肉疾病密切相關。而在畜禽生產中，氧化型纖維比例更高的肉類由于肌紅蛋白與血紅蛋白的含量較高，具有更高的肉色評分與嫩度，肉品質更高。因此提高氧化型纖維的比例對于肌肉疾病的防控與改善畜禽肉品質都具有重要意義。

對于肌纖維之間轉換的研究一直是近幾年來對于骨骼肌相關研究的熱點。研究表明，運動與否與不同的運動形式都能使肌纖維代謝類型之間發生轉變，長時間的耐力運動能增強有氧氧化代謝相關酶活、增加肌纖維的線粒體含量，促進肌纖維的有氧氧化代謝［52］。也有研究報道，高脂飲食能夠提高小鼠骨骼肌中線粒體含量從而顯著提高跑步期間的運動耐力表現［53］。而近年來，隨著對miRNAs的深入研究，肌纖維類型之間的轉變同樣有miRNAs 的參與，miR-152 通過靶向解偶聯蛋白3（UCP3）基因促進慢肌纖維形成［54］；miR-151-3p通過靶向骨骼肌細胞中的ATP2a2 調節慢肌基因表達［55］；miR-22-3p 通過抑制AMPK/SIRT1/PGC-1ɑ信號通路調節骨骼肌纖維類型的轉換［56］。目前對miR-130a 的研究報道主要圍繞疾病與免疫、癌癥等方面［57］，研究表明，外泌體miR-130a-3p可以通過介導SIRT7/Wnt/β-catenin軸調節人脂肪干細胞的成 骨 分 化［58］；Bta-miR-130a/b 通 過 靶 向 肉 牛 中 的PPARG 和CYP2U1 來 調 節 前 脂 肪 細 胞 分 化［59］；miR-130a 和miR-27b 可以通過靶向PPARγ 促進人間充質干細胞的成骨分化［60］；miR-130a 直接靶向抑制PPARγ減少肝臟脂肪的生成［61］。

已有報道表明miR-130a 參與了機體的發育與代謝調節，但其是否參與骨骼肌的發育還未見報道。碳水化合物作為骨骼肌在長時間（耐力型）運動中氧化的主要燃料，其來源在很大程度上取決了運動強度和持續時間，隨著運動強度的增加，碳水化合物的貢獻更大，通過攝入碳水化合物來提高長時間運動中碳水化合物的利用率一直是運動營養研究領域的主導［62］。有研究報道，氧化型肌纖維比酵解型肌纖維具有更高的葡萄糖敏感性與GLUT-4 蛋白表達，在基礎和胰島素刺激條件下能夠攝取更多葡萄糖［63］。前期研究表明miR-130a-3p能夠促進GLUT4 的轉位并增加細胞對葡萄糖的攝取［37］。本研究結果顯示miR-130a-3p過表達小鼠具有更高的運動耐力，敲除小鼠則反之。代謝測量結果也顯示，miR-130a-3p 過表達小鼠具有更強的有氧代謝，而敲除小鼠則反之。研究結果提示，miR-130a-3p 能夠增強小鼠的有氧代謝，從而提高其運動耐力，但具體的調控機制尚不清楚。我們推測miR-130a-3p 可能通過促進骨骼肌對葡萄糖的利用，調節肌纖維類型轉換，提高小鼠骨骼肌氧化型纖維的比例，增強運動耐力。

本文以miR-130a-3p 全身性敲除與過表達小鼠為對象，通過分子生物學、在體生理指標測量等技術，初步探究了miR-130a-3p 對小鼠有氧呼吸及其運動能力的作用。研究顯示miR-130a-3p 具有提高小鼠有氧代謝、降低體質量、增強運動耐力的作用，其結果為深入研究miR-130a-3p 對骨骼肌能量代謝和運動機能的調節機制提供了前期基礎。