聯(lián)合糞便微小染色體維持蛋白2檢測(cè)和多靶點(diǎn)糞便 FIT-DNA 聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)在篩查結(jié)直腸癌的意義＊

何柏霖 袁宇林 劉敏 張健 程書榜△

（1.深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科，廣東 深圳 518000）

（2.廣東醫(yī)科大學(xué)研究生院，廣東 湛江 524000）

結(jié)直腸癌是作為全球第三大常見癌癥，是消化系統(tǒng)的常見惡性腫瘤，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大主要原因[1]，嚴(yán)重危害著人類健康。若能對(duì)結(jié)直腸癌進(jìn)行早期篩查、早發(fā)現(xiàn)、早治療，結(jié)直腸癌患者的五年生存率可達(dá)80%以上[2]。發(fā)達(dá)國(guó)家得益于對(duì)人群結(jié)直腸癌篩查項(xiàng)目和危險(xiǎn)因素控制開展較早，其結(jié)直腸癌發(fā)病率以及死亡率均持續(xù)下降[1-2]。常見的篩查方式包括：糞便隱血，免疫法糞便隱血試驗(yàn)（FIT）-DNA檢測(cè)；腸鏡；問(wèn)卷評(píng)估等。腸鏡獲取病理診斷是篩查的金標(biāo)準(zhǔn)，但中國(guó)人口基數(shù)大，完成腸鏡篩查所需周期長(zhǎng)，病變檢出率低，受檢人群不夠濃縮。加上腸道準(zhǔn)備麻煩痛苦，且為侵入性檢查，人群接受度低。為了提高篩查的準(zhǔn)確度、人群的接受度，濃縮接受腸鏡檢查的人群。本研究擬聯(lián)合糞便微小染色體維持蛋白2檢測(cè)和多靶點(diǎn)糞便 FIT-DNA 聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)對(duì)亞太結(jié)直腸癌篩查評(píng)分系統(tǒng)（APCS）評(píng)分大于2分的人群進(jìn)行篩查，探討聯(lián)合兩種篩查技術(shù)對(duì)結(jié)直腸癌篩查的效能。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為前瞻性、觀察性研究。連續(xù)性納入2020年3月至2021年12月于深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院胃腸外科門診就診且APCS評(píng)分大于2分患者，共600例。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡40～74歲；（2）有輕微腸道癥狀人群，如排便習(xí)慣改變、便血、腹脹腹痛、便秘等；（3）有腸癌家族史人群；（4）有既往病史人群，如腸道慢性炎癥疾病；（5）腸鏡不依從人群；（6）做腸鏡有風(fēng)險(xiǎn)人群，如嚴(yán)重糖尿病患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）既往結(jié)直腸癌相關(guān)手術(shù)史；（2）存在腸鏡檢查的禁忌癥，不能耐受腸鏡檢查者；（3）不愿提供糞便樣本；（4）入選前 3 個(gè)月內(nèi)曾經(jīng)參加過(guò)任何藥物試驗(yàn)者；（5）有酗酒，吸毒或藥物濫用史；（6）研究者認(rèn)為不適宜參加本臨床試驗(yàn)者。共提供600個(gè)常衛(wèi)清檢測(cè)試劑盒免費(fèi)篩查。本研究通過(guò)深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)[KY2019106]。所有患者均簽署知情同意書。

1.2 篩查方法

1.2.1 多靶點(diǎn)糞便FIT-DNA聯(lián)合檢測(cè)

本研究采用諾輝健康科技有限公司提供的多靶點(diǎn)糞便 FIT-DNA 聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)試劑盒（常衛(wèi)清）。入組人員在專業(yè)技術(shù)人員指導(dǎo)下學(xué)習(xí)試劑盒附帶的糞便采樣視頻，并嚴(yán)格按照視頻提示標(biāo)準(zhǔn)采樣，然后由快遞人員上門收取標(biāo)本送至廣州諾輝醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，并出具檢測(cè)報(bào)告，陽(yáng)性人群建議行全結(jié)腸鏡檢查以確診，并再次收集糞便標(biāo)本，檢測(cè)糞便中微小染色體維持蛋白2（MCM2）的表達(dá)量。

多靶點(diǎn)糞便FIT-DNA聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)的工作原理是通過(guò)KRAS基因突變、BMP3/NDRG4基因甲基化和血紅蛋白的多組學(xué)檢測(cè)手段，經(jīng)已獲得專利且被藥監(jiān)局批準(zhǔn)的邏輯回歸模型算法進(jìn)行計(jì)算綜合評(píng)分，得出送檢樣本結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估結(jié)果。檢測(cè)評(píng)分的分值大于等于165分是陽(yáng)性結(jié)果，分?jǐn)?shù)小于165分是陰性結(jié)果。

1.2.2 糞便MCM2表達(dá)量的檢測(cè)

分析結(jié)直腸腺瘤患者及腺癌患者糞便中MCM2 mRNA的表達(dá)差異（采用William E.Bennett Jr方法在糞便中提取微量MCM2 mRNA）。

（1）100 mg凍存糞便加入1 mL的RNA Bee（美國(guó)Tel-Test公司）；（2）離心后的上清液加入酸化的玻璃微球，蛋白核酸提取儀離心（美國(guó)Thermo公司提供Fast Prep FP120）；（3）提取液使用德國(guó)Qiagen公司提供RNeasy spin column柱子微量提取RNA；（4）實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR分析正常人群、結(jié)直腸腺瘤患者及腺癌患者糞便中MCM2 mRNA的表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 18.0對(duì)收集的一般資料和臨床資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)匯總與梳理。計(jì)量資料用（x±s）表示，進(jìn)行t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。多個(gè)樣本均數(shù)講的比較用SNK-q檢驗(yàn)。約登指數(shù)=敏感度+特異度-1。約登指數(shù)：是評(píng)價(jià)篩查試驗(yàn)真實(shí)性的方法，假設(shè)其假陰性（漏診率）和假陽(yáng)性（誤診率）的危害性同等意義時(shí)，即可應(yīng)用約登指數(shù)。表示篩檢方法發(fā)現(xiàn)真正的患者與非患者的總能力，指數(shù)越大說(shuō)明篩查實(shí)驗(yàn)的效果越好，真實(shí)性越大。以P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 各檢測(cè)技術(shù)單獨(dú)檢測(cè)結(jié)果

多靶點(diǎn)糞便 FIT-DNA聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)試劑盒初篩陽(yáng)性結(jié)果80例，初篩陽(yáng)性患者在進(jìn)行腸鏡檢查的同時(shí)，再留取糞便標(biāo)本進(jìn)行MCM2檢測(cè)。病理結(jié)果提示陽(yáng)性（結(jié)直腸癌）8例，陰性72例，見表1。

表1 各檢測(cè)技術(shù)單獨(dú)檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同檢測(cè)方法的診斷價(jià)值比較

病理學(xué)金標(biāo)準(zhǔn)診斷80例經(jīng)過(guò)FIT-DNA初篩陽(yáng)性中8例為結(jié)直腸癌。經(jīng)MCM2單獨(dú)檢測(cè)，80例初篩陽(yáng)性中，陽(yáng)性33例，陰性47例；兩種方法聯(lián)合檢測(cè)，80例初篩陽(yáng)性患者中陽(yáng)性19例，陰性61例。MCM2檢測(cè)與 病理學(xué)診斷比較，有差異（P＜0.05，表2）；聯(lián)合檢測(cè)與病理學(xué)診斷比較，有差異（χ2=9.091，P＜0.05，表3）；兩種篩查技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)與MCM2檢測(cè)比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.84，P＜0.05，表4）。聯(lián)合檢測(cè)的約登指數(shù)為84.72%，見表5。

表2 MCM2檢測(cè)單獨(dú)檢測(cè)的診斷價(jià)值[n（%）]

表3 聯(lián)合檢測(cè)的診斷價(jià)值[n（%）]

表4 MCM2單獨(dú)檢測(cè)和聯(lián)合檢測(cè)

表5 不同檢測(cè)方法的診斷價(jià)值比較

2.3 MCM2在不同組織的表達(dá)量

熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)結(jié)果示：MCM2在正常結(jié)直腸黏膜、腺瘤、結(jié)直腸癌糞便中的表達(dá)量分別為（1.103±0.901）、（17.150±4.125）、（47.070±4.551），結(jié)果顯示任意兩組間總體均數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.026，見表6）。

表6 MCM2在不同組織的表達(dá)量

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活方式發(fā)生了變化，且人口老齡化逐漸增大，全球每年新增的惡性腫瘤，大約有1/10為結(jié)直腸癌，位居世界癌癥第三位。2016 年中國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：中國(guó)新發(fā)的癌癥約406萬(wàn)例，其中結(jié)直腸癌占比40.8%，位居第二位[3]。因此結(jié)直腸癌的防治工作刻不容緩。當(dāng)前，世界衛(wèi)生組織已把結(jié)直腸癌列為最適合進(jìn)行早期篩查和預(yù)防的癌癥之一，如何強(qiáng)化早期篩查、防治已成為社會(huì)各界的共識(shí)。在早期預(yù)防措施中，早診篩查的作用特別重要，是抑制結(jié)直腸癌高發(fā)的重要手段。世界各發(fā)達(dá)國(guó)家已做了相關(guān)的工作并取得了明顯的效果[4-6]。

近幾年多靶點(diǎn)糞便FIT-DNA聯(lián)合檢測(cè)逐步發(fā)展成熟，將糞便 DNA分子技術(shù)和免疫法糞便FIT結(jié)合起來(lái)，不但使FIT對(duì)結(jié)直腸癌篩查的敏感度得到進(jìn)一步的提升，同時(shí)也對(duì)結(jié)直腸發(fā)展期腺瘤篩查的敏感度也有了很大的提升。美國(guó)的研究表明，多靶點(diǎn)糞便FITDNA聯(lián)合檢測(cè)對(duì)進(jìn)展期腺瘤敏感性高達(dá)42%[7-8]。多項(xiàng)研究表明[9-10]，常規(guī)體檢人群篩查中，陽(yáng)性率在10%左右。我們對(duì)亞太結(jié)直腸癌篩查評(píng)分系統(tǒng)（APCS）[11]評(píng)分大于2分的人群進(jìn)行篩查發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性率為13.3%。然而篩查陽(yáng)性的這80例患者中，經(jīng)過(guò)腸鏡檢查，病理確診為結(jié)直腸癌的僅8例。腸鏡檢查的順應(yīng)性差，腸道準(zhǔn)備較麻煩，且是侵入性操作，患者的接受度低，這些均會(huì)成為腸鏡篩查的障礙，且增加患者的痛苦。能否通過(guò)進(jìn)一步的無(wú)創(chuàng)篩查，濃縮接受腸鏡檢查的人群成為我們研究的重點(diǎn)。

目前已有的研究表明，MCM2是細(xì)胞周期階段的特異性標(biāo)記，在進(jìn)入細(xì)胞周期的細(xì)胞中都存在表達(dá)，但是在分化成熟的細(xì)胞和靜止期（G0期）細(xì)胞中，MCM2不表達(dá)[12-15]。因此，MCM2能作為細(xì)胞增殖標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記增殖發(fā)育細(xì)胞中產(chǎn)生的異常和突變，其特異性能比常規(guī)增殖標(biāo)記物 PCNA和 ki-67更好，并且多項(xiàng)研究證實(shí)，MCM2的細(xì)胞表達(dá)陽(yáng)性與細(xì)胞發(fā)育異常的嚴(yán)重性相關(guān)，MCM2在結(jié)直腸腺瘤的腺上皮組織中也有高表達(dá)，盡管MCM2在結(jié)直腸腺瘤和腺癌組織中的表達(dá)部位沒有顯著的差別，但是二者在MCM2表達(dá)量上存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[16-20]。這就為通過(guò)定量檢測(cè)結(jié)直腸癌患者及結(jié)直腸腺瘤患者糞便中MCM2的表達(dá)差異提供了可能。

我們對(duì)多靶點(diǎn)糞便FIT-DNA聯(lián)合檢測(cè)的患者再次留取糞便，檢測(cè)糞便中的MCM2 mRNA在正常人群、腺瘤及結(jié)直腸癌中的表達(dá)差異，實(shí)驗(yàn)證明表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以往的研究顯示，MCM2在分化成熟、靜止階段的細(xì)胞中沒有表達(dá)[21-22]。MCM2在胃癌的研究中顯示[23-24]，微小染色體維持蛋白對(duì)病人的預(yù)后有一定的影響，而在胃部腺瘤和腺癌中，其表達(dá)存在著差異性[25-26]。大腸中關(guān)于MCM2在大腸正常上皮組織、大腸腺瘤和大腸癌組織的表達(dá)狀況進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)腺瘤中MCM2的表達(dá)量比正常組織要高，但比癌組織要低[27]。

我們的實(shí)驗(yàn)表明，在多靶點(diǎn)糞便FIT-DNA聯(lián)合檢測(cè)初篩陽(yáng)性的患者，再進(jìn)行糞便MCM2檢測(cè)，對(duì)結(jié)直腸癌篩查的敏感度可達(dá)100%，特異度為84.72%。多靶點(diǎn)糞便 FIT-DNA 聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)以及糞便微小染色體維持蛋白2檢測(cè)應(yīng)用于結(jié)直腸癌患者的初篩具有一定的臨床價(jià)值，兩種方法均具有重復(fù)性強(qiáng)、客觀性高、簡(jiǎn)便易行的優(yōu)勢(shì)。將兩者聯(lián)合檢測(cè)可提升篩查的敏感度、特異度和約登指數(shù)，可作為篩查、診斷結(jié)直腸癌的重要輔助手段，能讓接受腸鏡檢查的患者更加濃縮，減少患者的痛苦，節(jié)約有限的醫(yī)療資源。相對(duì)于結(jié)腸鏡來(lái)說(shuō)，在多靶點(diǎn)糞便FIT-DNA聯(lián)合檢測(cè)初篩陽(yáng)性的患者，再進(jìn)行糞便MCM2檢測(cè)，受檢者痛苦小，居家取樣方便，不但節(jié)省了醫(yī)療資源，還增加了人們的依從性，同時(shí)大幅度減小了腸鏡檢查所造成的出血、穿孔等并發(fā)癥的發(fā)生。