庚二酸的生物合成及發(fā)酵工藝條件優(yōu)化

鮑青青,毛銀,李國輝*,鄧禹*

1(江南大學(xué)， 糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

庚二酸,又稱蒲桃酸,是一種重要的七碳二元羧酸,主要用作生物素合成的前體,除此以外還可用于聚酰胺、表面活性劑及殺蟲劑[1]的制備。目前,工業(yè)上主要是通過水楊酸的裂解來合成庚二酸[2],但該方法有著工藝復(fù)雜、收率較低等缺點(diǎn)。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展,最早在部分微生物的培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)了微量庚二酸的存在[3-5]。隨后,利用代謝工程及合成生物學(xué)等方法,對(duì)庚二酸的生物合成進(jìn)行了研究。CHEONG等[6]在大腸桿菌JC01中過表達(dá)了5 個(gè)基因(paaJ、paaH、paaF、tdTer和cat1),構(gòu)建了一種二元羧酸的生物合成途徑,成功通過非脫羧克萊森縮合反應(yīng)合成了庚二酸。IKEDA等[7]在Corynebacteriumglutamicum中表達(dá)細(xì)胞色素P450 酶的編碼基因bioI,通過氧化裂解長鏈脂肪酸,同時(shí)阻斷生物素合成途徑,獲得了微量的庚二酸。但是上述研究中庚二酸的產(chǎn)量均較低,不利于后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn),因此有必要篩選獲得1 株高產(chǎn)庚二酸的菌株并進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化,以期提高庚二酸的產(chǎn)量。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究時(shí)[8-9],在部分微生物的培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)了少量庚二酸的存在。據(jù)此,本研究以實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的菌株為基礎(chǔ),利用48 孔板及搖瓶進(jìn)行篩選,成功篩選得到了1 株高產(chǎn)庚二酸的霍氏腸桿菌Bpa-3,同時(shí)分別對(duì)碳源種類、氮源種類、接種量及外加的無機(jī)鹽種類和濃度進(jìn)行了優(yōu)化,進(jìn)一步提高了庚二酸的產(chǎn)量,為其生物法合成提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

本研究所用的菌株為霍氏腸桿菌(Enterobacterhormaechei),命名為Bpa-3,由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10,胰蛋白胨10,酵母粉5(如需制備固體培養(yǎng)基,加入20 g/L 瓊脂粉),pH 7.0。

SOB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨20,葡萄糖4,酵母粉5,MgCl2·6H2O 2.03,NaCl 0.5,KCl 0.186,pH 7.0。

最優(yōu)組分培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨25,甘油4,MgCl2·6H2O 2.03,NaCl 0.5,KCl 0.186,pH 7.0。

1.1.3 試劑與儀器

胰蛋白胨及酵母提取物,英國oxoid公司;庚二酸標(biāo)準(zhǔn)品,美國sigma公司;瓊脂粉、葡萄糖、NaCl、MgCl2·6H2O、KCl,上海國藥試劑集團(tuán)。

UV-1800紫外可見分光光度計(jì),翱藝儀器(上海)有限公司;1260 Ⅱ高效液相色譜系統(tǒng),美國安捷倫有限公司;HYL-C3組合式搖床,太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;5424臺(tái)式高速離心機(jī),德國Eppendorf(艾本德)公司;G154DWS立式壓力蒸汽滅菌鍋,美國致微有限公司。

1.2 菌株活化及篩選

1.2.1 菌株活化

將-80 ℃冰箱保藏的菌種取出,在LB固體平板上劃線,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。

1.2.2 菌種初篩

種子液制備:挑取LB平板的單菌落接種于含有1 mL LB液體培養(yǎng)基的48孔板中,37 ℃,250 r/min培養(yǎng)12 h制備一級(jí)種子液。將一級(jí)種子液以2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量繼續(xù)轉(zhuǎn)接至48孔板,37 ℃,250 r/min 培養(yǎng)12 h制備二級(jí)種子液。

孔板篩選:菌種初篩在48孔板中進(jìn)行,具體方法如下:將制備的二級(jí)種子液以2%的接種量接種于含有1 mL SOB培養(yǎng)基的48孔板中,30 ℃,250 r/min發(fā)酵72 h,最后利用高效液相色譜(high performance liquid chromatography,HPLC)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析。

1.2.3 搖瓶復(fù)篩

種子液制備:將初篩得到的菌株接種于含有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,37 ℃,250 r/min培養(yǎng)12 h制備一級(jí)種子液。將一級(jí)種子液以2%的接種量繼續(xù)轉(zhuǎn)接至三角瓶中,37 ℃,250 r/min培養(yǎng)12 h制備二級(jí)種子液。

搖瓶發(fā)酵:以2%的接種量將二級(jí)種子液接種于含有50 mL SOB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,30 ℃,250 r/min發(fā)酵72 h,每隔12 h取1次樣,凍存于-20 ℃冰箱中,利用HPLC對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,最終結(jié)果計(jì)算其平均值。

1.3 代謝物含量測(cè)定及定性分析

搖瓶發(fā)酵時(shí),細(xì)胞的生長情況通過600 nm處的光密度(OD600)來衡量,每次取樣時(shí)記錄數(shù)據(jù)以繪制菌株生長曲線。

對(duì)于孔板發(fā)酵得到的發(fā)酵液,以4 000 r/min離心4 min獲得上清液;對(duì)于搖瓶發(fā)酵得到的發(fā)酵液,以10 000 r/min離心2 min獲得上清液,隨后將制備的上清液過水系濾膜,經(jīng)由HPLC檢測(cè)代謝物的含量。檢測(cè)所用流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4,流速為0.6 mL/min,色譜柱為Bio-Rad HPX-87 H色譜柱,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量為20 μL。通過紫外檢測(cè)器(218 nm)對(duì)發(fā)酵液中的有機(jī)酸進(jìn)行定量[10],通過示差檢測(cè)器對(duì)發(fā)酵液中的葡萄糖進(jìn)行定量。

為了對(duì)發(fā)酵液中的庚二酸進(jìn)行定性分析,本研究采用液質(zhì)聯(lián)用(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析[11]。檢測(cè)所用色譜柱為BEH C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.7 μm),所用檢測(cè)器為Waters Acquity PDA檢測(cè)器(200～400 nm),流動(dòng)相A為甲酸(0.1%),流動(dòng)相B為乙腈,進(jìn)樣量為5 μL。通過Waters Acquity超高效液相色譜儀在45 ℃下進(jìn)行梯度洗脫,梯度洗脫程序如表1所示,同時(shí)將負(fù)模式電噴霧電離(ESI-)應(yīng)用于質(zhì)譜儀。

表1 LC-MS梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program for LC-MS

1.4 庚二酸生產(chǎn)菌株發(fā)酵優(yōu)化

碳源種類優(yōu)化:分別用4 g/L的蔗糖及甘油替換SOB培養(yǎng)基中的葡萄糖,以2%的接種量將種子液接種于培養(yǎng)基,30 ℃,250 r/min發(fā)酵72 h,每隔12 h取樣,利用HPLC對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,最終結(jié)果計(jì)算其平均值。

氮源種類優(yōu)化:分別用25 g/L的有機(jī)氮源(酵母膏、大豆蛋白胨、魚粉蛋白胨、酵母粉、牛肉浸粉、胰蛋白胨)或無機(jī)氮源[乙酸銨、(NH4)2SO4、NH4Cl、尿素、(NH4)2HPO4]替換SOB培養(yǎng)基中的混合氮源(酵母粉和胰蛋白胨),以2%的接種量將種子液接種于培養(yǎng)基,30 ℃ ,250 r/min 發(fā)酵72 h,每隔12 h取樣,利用HPLC對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,最終結(jié)果計(jì)算其平均值。

碳氮源組合優(yōu)化:對(duì)培養(yǎng)基中的碳源(葡萄糖、甘油及蔗糖)及氮源[胰蛋白胨及(NH4)2HPO4]進(jìn)行組合,與SOB培養(yǎng)基中的碳氮比保持一致(C/N=4),以2%的接種量將種子液接種于培養(yǎng)基,30 ℃,250 r/min發(fā)酵72 h,每隔12 h取樣,利用HPLC對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,最終結(jié)果計(jì)算其平均值。

接種量?jī)?yōu)化:分別以1%、2%、4%、6%、8%、10%的接種量轉(zhuǎn)接二級(jí)種子液,利用最優(yōu)組分培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,30 ℃,250 r/min發(fā)酵72 h,每隔12 h取樣,利用HPLC對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,最終結(jié)果計(jì)算其平均值。

無機(jī)鹽種類優(yōu)化:以最優(yōu)組分培養(yǎng)基為基礎(chǔ),發(fā)酵前向培養(yǎng)基中分別外加不同終濃度的KCl(25 mmol/L)、MnCl2(0.5 mmol/L)、MgSO4(5 mmol/L)及KH2PO4(20 mmol/L)溶液,以4%的接種量將種子液接種于培養(yǎng)基,30 ℃ ,250 r/ min 發(fā)酵72 h,每隔12 h取樣,利用HPLC 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行,最終結(jié)果計(jì)算其平均值。

KH2PO4濃度優(yōu)化:以最優(yōu)組分培養(yǎng)基為基礎(chǔ),發(fā)酵前向培養(yǎng)基中分別外加終濃度分別為5、10、20、30、50 mmol/L的KH2PO4母液,接種量為4%,30 ℃,250 r/min發(fā)酵72 h,每隔12 h取樣,利用HPLC對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析,每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,最終結(jié)果計(jì)算其平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 庚二酸生產(chǎn)菌株篩選

對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保藏的菌株進(jìn)行劃線后挑取單菌落,通過48孔板進(jìn)行初篩,利用HPLC檢測(cè)庚二酸。最終從挑取的960個(gè)單菌落中篩選得到了12株能夠生產(chǎn)庚二酸的菌株。隨后將初篩得到的12株菌利用搖瓶進(jìn)行復(fù)篩,得到了1株庚二酸產(chǎn)量最高的菌株,將其命名為Bpa-3。如圖1-a所示,菌株Bpa-3在發(fā)酵12 h時(shí)已有少量庚二酸生成,隨著發(fā)酵時(shí)間的不斷延長,庚二酸的產(chǎn)量也不斷提高,發(fā)酵72 h時(shí)產(chǎn)生了115.4 mg/L的庚二酸。對(duì)該樣品進(jìn)行液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Bpa-3的發(fā)酵液在4.72 min有一明顯的出峰,與庚二酸標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間相一致;同時(shí),質(zhì)譜的特征離子碎片也顯示該物質(zhì)為庚二酸[7](圖1-b、圖1-c),進(jìn)一步表明菌株Bpa-3在發(fā)酵過程中生產(chǎn)了庚二酸。

a-菌株Bpa-3的生長曲線及庚二酸產(chǎn)量;b-發(fā)酵72 h樣品及庚二酸標(biāo)準(zhǔn)品液相圖譜;c-發(fā)酵72 h樣品及庚二酸標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜檢測(cè)圖譜圖1 菌株Bpa-3庚二酸的產(chǎn)量及其發(fā)酵液液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)分析Fig.1 Production of pimelic acid in strain Bpa-3 and its fermentation broth analysis by LC-MS

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 碳源種類

為了提高菌株Bpa-3的庚二酸產(chǎn)量,對(duì)SOB培養(yǎng)基中的碳源種類進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示。與葡萄糖相比,甘油更適合作為菌株生產(chǎn)庚二酸的碳源,這可能是因?yàn)槠咸烟鞘撬傩荚?在發(fā)酵過程中會(huì)產(chǎn)生過多雜酸,不利于產(chǎn)物的合成[12-13];而當(dāng)蔗糖作為碳源時(shí),菌株的庚二酸產(chǎn)量有所降低,可能是由于蔗糖是二糖,在微生物體內(nèi)需要分解為單糖才能被利用,從而導(dǎo)致庚二酸的產(chǎn)量降低;因此,后續(xù)研究中選擇甘油作為碳源。

2.2.2 氮源種類

在發(fā)酵過程中,培養(yǎng)基中的氮源對(duì)產(chǎn)物的合成有積極的影響[14-15]。因此,在本研究中,對(duì)氮源的種類進(jìn)行了優(yōu)化,分別用相同濃度的有機(jī)氮源或無機(jī)氮源替換培養(yǎng)基中的混合氮源,結(jié)果如圖3所示。除胰蛋白胨和(NH4)2HPO4外,其他種類的氮源均降低了庚二酸的產(chǎn)量;當(dāng)胰蛋白胨作為氮源時(shí),庚二酸的產(chǎn)量最高;因此,在本實(shí)驗(yàn)中以胰蛋白胨作為氮源進(jìn)行發(fā)酵。

圖2 碳源對(duì)菌株Bpa-3庚二酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of carbon sources on the pimelic acid production of strain Bpa-3

圖3 氮源對(duì)菌株Bpa-3庚二酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of nitrogen sources on the pimelic acid production of strain Bpa-3

2.2.3 碳氮源組合優(yōu)化

為了探究碳源與氮源的協(xié)同作用,結(jié)合前期結(jié)果,選擇葡萄糖、甘油及蔗糖3種碳源,胰蛋白胨及(NH4)2HPO42種氮源,對(duì)其進(jìn)行組合,研究不同碳氮源組合對(duì)菌株Bpa-3產(chǎn)庚二酸的影響,結(jié)果如圖4所示。在6個(gè)組合中,胰蛋白胨作為氮源時(shí)的庚二酸產(chǎn)量均高于(NH4)2HPO4,這可能是因?yàn)?NH4)2HPO4是無機(jī)氮源,相較于胰蛋白胨成分單一,對(duì)于菌株產(chǎn)庚二酸的貢獻(xiàn)較小;同樣地,甘油作為碳源時(shí)的庚二酸產(chǎn)量比葡萄糖和蔗糖高,這與2.2.1的結(jié)果相一致。庚二酸的產(chǎn)量最高的碳氮源組合是甘油和胰蛋白胨。因此,結(jié)合上述結(jié)果,在本研究中,選擇甘油作為碳源,胰蛋白胨作為氮源。

2.2.3 接種量

接種量的大小影響著菌株的生長速度,接種量過大或過小都不利于菌株合成產(chǎn)物[16]。在本研究中,分別采用不同的接種量來轉(zhuǎn)接二級(jí)種子液進(jìn)行發(fā)酵,以2%的接種量作為對(duì)照,結(jié)果如圖5所示。當(dāng)接種量<4%時(shí),庚二酸的產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加;當(dāng)接種量>4%時(shí),庚二酸的產(chǎn)量隨著接種量的增加而降低;因此,在本實(shí)驗(yàn)中選擇4%的接種量進(jìn)行發(fā)酵。

圖4 不同碳氮源組合對(duì)菌株Bpa-3庚二酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different combinations of carbon and nitrogen sources on the pimelic acid production of strain Bpa-3

圖5 接種量對(duì)菌株Bpa-3庚二酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of inoculum amount on the pimelic acid production of strain Bpa-3

2.3 外源無機(jī)鹽的添加

無機(jī)鹽離子對(duì)菌體的生長和產(chǎn)物的合成往往都有一定作用[17],如鎂離子能夠激活某些酶的活性[18],從而促進(jìn)菌體生長;錳離子和磷酸鹽也能夠促進(jìn)菌體的基礎(chǔ)代謝[19]。在本研究中,分別向最優(yōu)組分培養(yǎng)基中添加不同種類的無機(jī)鹽離子,如圖6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),除MgSO4外,其他無機(jī)鹽均能夠促進(jìn)庚二酸的合成。其中,KH2PO4對(duì)于菌株產(chǎn)庚二酸的作用最大,當(dāng)外加20 mmol/L KH2PO4時(shí),菌株Bpa-3的庚二酸產(chǎn)量為205.1 mg/L,比對(duì)照組提高了78%。

圖6 無機(jī)鹽種類對(duì)菌株Bpa-3庚二酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of inorganic salt types on the pimelic acid production of strain Bpa-3

a-不同KH2PO4濃度下的庚二酸產(chǎn)量;b-不同KH2PO4濃度下菌株Bpa-3的生長曲線圖7 KH2PO4濃度對(duì)菌株Bpa-3庚二酸產(chǎn)量的影響Fig.7 Effects of KH2 PO4 concentration on the pimelic acid production of strain Bpa-3

3 結(jié)論

本研究通過篩選獲得了1株高產(chǎn)庚二酸的霍氏腸桿菌Bpa-3,通過發(fā)酵工藝優(yōu)化,庚二酸的產(chǎn)量達(dá)到217.3 mg/L,是目前報(bào)道的最高值,為后續(xù)生物法生產(chǎn)庚二酸及其他有機(jī)酸提供了有益借鑒。除此之外,本研究所用的菌株霍氏腸桿菌為野生菌,可以通過合成生物學(xué)的手段對(duì)其進(jìn)行改造,如利用基因編輯敲除庚二酸的下游競(jìng)爭(zhēng)途徑或異源表達(dá)庚二酸生物合成的相關(guān)基因等,以期進(jìn)一步提高庚二酸的產(chǎn)量,增強(qiáng)其生物法合成效率。