植物乳桿菌微膠囊的制備工藝優化及特性分析

要經緯,朱含芳,黃學成,郜鑫,郭蛇,陳霞

(內蒙古農業大學,乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,農業農村部奶制品加工重點實驗室,內蒙古自治區乳品生物技術與工程重點實驗室,內蒙古 呼和浩特,010018)

植物乳桿菌常分布于各種發酵食品中,如蔬果、肉類、乳制品及葡萄酒等,同時也是人體腸道正常菌群成員,對人體健康具有促進作用[1]。大量研究表明,植物乳桿菌能夠定植于人體腸道內,發揮調節免疫、調節腸道菌群平衡、緩解慢性代謝性疾病、降低膽固醇水平等多種健康功效[2]。眾所周知,益生菌發揮益生功效的前提之一是需在腸道內達到足夠的定植數量[3]。部分植物乳桿菌穩定性較差,進入消化道后難以忍受胃酸、消化酶、膽汁酸等作用,限制了其益生功效的發揮。近幾年,益生菌的穩定性和生物利用率的提高已成為功能性食品研究中的主要關注點之一[4]。微膠囊技術是指以天然或人工合成的高分子材料作為壁材,將固體、液體或氣體等包裹形成一種微小液滴或顆粒狀態的技術,被包裹的物質在酸性條件下耐受性提高,而在適宜環境中能夠釋放出來發揮作用[5]。

近年來,海藻酸鈉微膠囊的相關研究主要集中于微膠囊對芯材的保護、粒徑的控制以及微生物包埋率等方面,常用的制備方法有擠壓法、乳化法等[6]。李洪波等[7]采用乳化法制備干酪乳桿菌微膠囊,包埋率可達61.73%。FRAKOLAKI等[8]采用擠壓法制備海藻酸鈉雙歧桿菌微膠囊,包埋率可達到76.5%。但是,上述方法也存在一定程度的局限性,例如擠壓法制備微膠囊粒徑較大,乳化法則因攪拌速度剪切力較大,導致微膠囊形態不規則。采用微膠囊造粒儀制備微膠囊則可從根本解決上述問題。使用微膠囊造粒儀可在溫和條件下將微生物或動植物細胞包埋在聚合物基質中,形成顆粒均勻、粒徑適中的微膠囊,與擠壓法或乳化法等傳統制備方法相比,包埋效果穩定高效,得到了廣泛認可[9]。

本研究以海藻酸鈉為壁材通過微膠囊造粒儀制備植物乳桿菌IMAU10120-1微膠囊,通過檢測不同濃度海藻酸鈉、CaCl2和固化時間對植物乳桿菌微膠囊包埋率的影響,優化其制備工藝,并對所得微膠囊的腸溶性、人工胃腸液耐受性等進行評價,可為乳桿菌微膠囊的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

植物乳桿菌IMAU10120-1是經次級感染法篩選獲得的自發突變植物乳桿菌抗噬菌體菌株,保存于內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室。將植物乳桿菌IMAU10120-1以2%的接種量接種于MRS液體培養基中,37 ℃培養18 h。連續活化3代后待用。

1.1.2 試劑

人工模擬胃液:在100 mL PBS緩沖溶液中加入0.3 g胃蛋白酶,用0.1 mol/L的HCl調整pH值為2.5,0.22 μm無菌濾膜過濾后備用。

人工模擬腸液:配制0.65%(質量分數)的磷酸二氫鉀溶液100 mL,使用NaOH溶液(0.1 mol/L)將此溶液的pH值調節至8.0,加入0.1 g胰蛋白酶和1.8 g的牛膽鹽,0.22 μm無菌濾膜過濾后備用。

解囊劑:配制0.06 mol/L的檸檬酸鈉溶液,121 ℃滅菌15 min后備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體收集

以2%的接種量將植物乳桿菌IMAU10120-1接種于MRS液體培養基中,經37 ℃、18 h培養后,離心(4 000 r/min、5 min),菌泥用適量無菌生理鹽水重懸,制得植物乳桿菌IMAU10120-1濃縮菌懸液,使其菌體濃度約達109CFU/mL。

1. 2. 2 植物乳桿菌微膠囊的制備

把收集的菌泥和海藻酸鈉溶液按體積比1∶10混合均勻后倒入耐壓瓶中,使用微膠囊造粒儀(B-390型;步琦實驗室設備貿易(上海)有限公司)經高頻振蕩將海藻酸鈉和菌懸液的混合液體滴加到一定濃度的CaCl2溶液中,調整參數使液滴顆粒無連結且均勻,造粒結束后固化一定時間。離心得到樣品,用生理鹽水洗去微膠囊表面的CaCl2殘留液,制得成品微膠囊,置于-20 ℃保存。

1.2.3 植物乳桿菌微膠囊制備條件的優化

1.2.3.1 海藻酸鈉濃度的優化

選取質量分數為0.8%、1.2%、1.5%、1.8%、2.0%的海藻酸鈉作為壁材,在CaCl2質量分數2%,固化時間10 min的條件下制備微膠囊,測定微膠囊包埋率,確定海藻酸鈉的最佳濃度。

1.2.3.2 CaCl2濃度的確定

以最優濃度的海藻酸鈉為壁材,CaCl2質量分數選擇1%、1.5%、2%、2.5%、3%,固化時間10 min 的條件下進行微膠囊的制備,測定微膠囊包埋率,確定CaCl2的最佳濃度。

1.2.3.3 固化時間的確定

選取最優濃度的海藻酸鈉和CaCl2溶液,固化時間選擇10、20、30、40、50 min 進行微膠囊制備,測定微膠囊包埋率,確定微膠囊包埋的最佳固化時間。

1.2.3.4 正交試驗

在單因素基礎上,選擇海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度以及固化時間為試驗因素,通過正交分析法以植物乳桿菌微膠囊的包埋率為評價指標確定植物乳桿菌微膠囊的最佳制備工藝條件。

1.2.3.5 植物乳桿菌微膠囊包埋率的測定

將1 g植物乳桿菌微膠囊加入9 mL 0.06 mol/L的檸檬酸鈉溶液內,置于搖床,37 ℃、180 r/min的條件下溫育3 h后,進行活菌計數,包埋率的計算如公式(1)所示:

(1)

式中:N1為益生菌包埋后微膠囊中的總活菌數(每克微膠囊的含菌量與收集得到微膠囊總質量的乘積);N0為包埋前的總活菌數(每毫升濃縮菌液的含菌量與濃縮菌液體積的乘積)。

1.2.4 植物乳桿菌微膠囊形態的觀察

通過光學顯微鏡觀察微膠囊的結構:取少量微膠囊分散在載玻片中央,分攤均勻,在光學顯微鏡100倍的條件下觀察微膠囊形態并拍照。

1.2.5 植物乳桿菌微膠囊在連續胃腸液條件的存活率

參考陳美瑄[10]的方法并加以改進:分別取1 g制備好的植物乳桿菌微膠囊和1 mL未包埋的游離菌液(空白對照)放入到9 mL的人工胃液內,在37 ℃ ,180 r/ min的條件下搖床振蕩處理3 h后,測定活菌數,再將微膠囊和游離菌轉入人工腸液內繼續消化8 h 后取樣測定存活率,存活率的計算如公式(2)、公式(3)所示:

(2)

(3)

式中:N0為0 h 的活菌數;N1為人工胃液處理3 h后的活菌數;N2為人工腸液處理8 h后的活菌數。

1.2.6 植物乳桿菌微膠囊在人工腸液中的釋放率

參考TIAN等[11]的方法:取1 g制備好的植物乳桿菌微膠囊加入到9 mL的人工腸液內,在37 ℃、180 r/min的條件下搖床溫育2. 5 h,并在0、30、60、90、120、150 min時取樣計數。

1.3 數據統計與分析

以上實驗都經過3次以上的重復實驗驗證,所有的數據均采用8.6 Origin lab數據分析軟件進行分析。并且使用IBM SPSS Statistics 20以顯著性水平為0.05進行數據分析,P<0.05為差異顯著,P>0.05為差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉濃度的確定

由圖1可知,微膠囊的包埋率隨著海藻酸鈉濃度的增加,呈先升高后降低的趨勢(P<0.05)。當海藻酸鈉質量分數<1.8%時,植物乳桿菌微膠囊的包埋率較低,原因是海藻酸鈉濃度較低,制得的微膠囊機械強度弱,菌體容易從微膠囊內流出[12]。當海藻酸質量分數為1.8%時,包埋率達到最高(56.08%)。當海藻酸鈉質量分數>1.8%的時候,包埋率下降14.48%,可能是由于隨著海藻酸鈉添加量的增加,溶液黏度增大,制作微膠囊時難以從噴嘴中滴落,隨著海藻酸鈉質量分數的增大,壁材液密度和黏度也變大,不利于菌體的分散和包埋[13]。CHVARRI等[14]在制備雙歧桿菌微膠囊的時發現,海藻酸鈉質量分數為2%時包埋率最高(40.2%)。而本實驗海藻酸鈉質量分數為1.8%時包埋率最好,原因可能是由于不同制備方法造成的。本實驗使用的微膠囊造粒儀噴嘴孔徑較小,僅有300 μm,海藻酸鈉濃度較大時黏度增加,制備過程中難以形成連續的球型液珠。綜上所述,海藻酸鈉最適添加量選擇1.8%(質量分數)。

圖1 不同海藻酸鈉濃度對植物乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.1 The influence of different sodium alginate concentrations on the embedding rate of Lactobacillus plantarum microencapsules注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2 CaCl2濃度的確定

由圖2可知,隨著CaCl2濃度的增加,微膠囊的包埋率呈先升高后降低的趨勢(P<0.05),當CaCl2<2.5%時,包埋率逐漸升高;當質量分數達到2.5%時,包埋率最高(62.3%);隨著CaCl2濃度的繼續升高,包埋率下降。這可能是由于,當Ca2+濃度較低時,由于沒有足夠Ca2+與海藻酸鈉結合,導致微膠囊機械強度較低,不利于菌體的包埋[15];而Ca2+濃度過高時,由于海藻酸的結合位點達到飽和,沒有多余空間與Ca2+結合。因此,CaCl2濃度過高不僅不會增加包埋率,反而會增加溶液表面張力和密度,使得擠壓出的液滴浮于表面,不易成珠[16]。周莉等[17]在制備保加利亞乳桿菌海藻酸鈉微膠囊時發現,當CaCl2質量分數為2%,海藻酸鈉質量分數為3%的時候,其包埋率最高,達78.96%;隨著Ca2+濃度的增加,微膠囊包埋率逐漸增加,但當Ca2+濃度過高,包埋率則會有所下降,推測過高的Ca2+濃度會導致體系內與壁材反應的Ca2+相對較少,由于交聯有限導致包埋率下降。由圖2可知,對于植物乳桿菌IMAU10120-1,CaCl2質量分數為2.5%時包埋率最高,這可能是由于本研究使用的海藻酸鈉濃度較低,需要更多的Ca2+與海藻酸相結合。綜上所述,CaCl2的最適添加量選擇2.5%(質量分數)。

圖2 不同CaCl2濃度對植物乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.2 The influence of different calcium chloride concentration on the embedding rate of Lactobacillus plantarum microencapsules

2.3 固化時間的確定

如圖3所示,隨著固化時間的增加,微膠囊包埋率呈先升高后降低的趨勢(P<0.05)。當固化時間<40 min時微膠囊的包埋率逐漸升高,原因是海藻酸鈉與Ca2+結合不完全,微膠囊易破碎漏出菌體。當固化時間達到40 min時,其包埋率最高,達到了74.47%。而當固化時間>40 min時,包埋率下降,原因是固化時間較長可能會導致微生物死亡,從而導致包埋率下降[18]。郭宇星等[19]發現,海藻酸鈉的Na+會與CaCl2中的Ca2+發生置換形成海藻酸鈣凝膠,因此需要一定的置換反應時間,但如果置換時間過長,交聯程度過高,小球內部結構緊密,影響基質的傳遞,導致細胞存活率降低。與本實驗結果一致,因此,固化時間選擇40 min。

2.4 植物乳桿菌微膠囊的正交試驗

根據單因素試驗,選擇不同海藻酸鈉添加量(1.5%、1.8%、2%，質量分數),不同CaCl2添加量(2%、2.5%、3%，質量分數),不同固化時間(20、30、40 min),以植物乳桿菌微膠囊的包埋率為評價指標,進行正交試驗,以此篩選出植物乳桿菌微膠囊的最佳制備工藝,正交試驗因素水平如表1 所示。

圖3 不同固化時間對植物乳桿菌微膠囊包埋率的影響Fig.3 The influence of different curing times on the embedding rate of Lactobacillus plantarum microencapsules

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor of orthogonal experiment

在單因素直觀分析中,極差R越大,該因素對指標的影響就越強。由表2可知,以植物乳桿菌微膠囊的包埋率為評價指標,R值大小順序為:海藻酸鈉添加量(A)>CaCl2添加量(B)>固化時間(C)。因此,確定海藻酸鈉添加量為主要影響因素,其次是CaCl2添加量,最后是固化時間。最優制備工藝為A2B3C3,即海藻酸鈉質量分數1.8%,CaCl2質量分數3.0%,固化時間40 min。此時的微膠囊包埋率最高,可達到85.1%,制得的微膠囊顆粒較為均勻且無明顯黏結現象,因此選用上述條件為植物乳桿菌IMAU10120-1微膠囊的最佳制備工藝。

2.5 植物乳桿菌微膠囊的形態

采用B-390微膠囊造粒儀,通過調節振動頻率和氣壓等參數,可高效制備出顆粒大小適中且均勻的植物乳桿菌微膠囊。由圖4可知,植物乳桿菌微膠囊的形態大致呈球形,為白色顆粒,粒徑邊界清晰,平均粒徑在300 μm左右;凍干后的微膠囊表面不規則,但依舊維持完整外觀,無破碎裂紋等現象。王慶衛[20]使用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察雙歧桿菌微膠囊時發現,冷凍干燥后,海藻酸鈉形成的壁殼外觀較粗糙,推測微膠囊表面具有較多孔隙,與本實驗結果相似。

表2 植物乳桿菌微膠囊在不同制備條件下的包埋率Table 2 The embedding rates of Lactobacillus plantarum microencapsules under various conditions

a-凍干前的植物乳桿菌微膠囊;b-凍干后的植物乳桿菌微膠囊圖4 植物乳桿菌微膠囊的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopy of Lactobacillus plantarum microencapsules

2.6 植物乳桿菌微膠囊腸溶性

圖5 植物乳桿菌微膠囊在人工模擬腸液中的腸溶性Fig.5 The enterosolubility of Lactobacillus plantarum microencapsules in artificial simulated intestinal juice

2.7 植物乳桿菌微膠囊對人工胃腸液的耐受性

如表3所示,隨著微膠囊和游離菌在胃液內處理時間的增加,兩組的活菌數均有所降低(P<0.05)。未經包埋菌株在人工胃液處理3 h后,存活率僅有27.16%,活菌數下降了1.7×1010CFU/mL,而微膠囊組存活率為85.68%,活菌數僅下降了4.0×109CFU/mL,說明微膠囊包埋可以大大提高植物乳桿菌IMAU10120-1對胃液的耐受性。

將人工胃液處理3 h后的菌液及微膠囊轉至pH 8.0的人工腸液中繼續消化8 h后,微膠囊組的存活率仍高達79.36%,存活率僅下降6.32%;未包埋組則由于膽鹽作用,存活率從27.16%下降到16.40%,下降了10.76%。說明經微膠囊化后,植物乳桿菌IMAU10120-1的腸液耐受性有一定提高。

RATHER等[23]將植物乳桿菌NCDC201游離菌及其微膠囊在胃液中處理90 min,游離菌下降了5個對數級,而微膠囊組僅下降2個對數級。朱瑩丹[24]制備植物乳桿菌LIP-1微膠囊時發現,胃液處理90 min后,微膠囊組存活率為47.33%,未包埋組僅為16.01%,微膠囊化可對植物乳桿菌LIP-1起到較好的保護作用。本實驗經胃液處理3 h后,微膠囊組仍有80%以上的存活率。綜上所述,菌株微膠囊化后對人工模擬胃液具有一定的耐受作用。

表3 植物乳桿菌微膠囊在人工胃腸液中的存活率Table 3 The survival rate of Lactobacillus plantarum microcapsules in continuous gastrointestinal juice

3 結論

本實驗以海藻酸鈉為壁材,通過B-390微膠囊造粒儀制備植物乳桿菌微膠囊,成功制備出植物乳桿菌IMAU10120-1微膠囊,其最佳制備工藝為海藻酸鈉添加量1.8%(質量分數),CaCl2添加量3.0%(質量分數),固化時間40 min,此條件下微膠囊包埋率最高。在不加膽鹽的人工模擬腸液處理60 min,活菌數釋放量達1.55×1010CFU/mL。在人工胃液處理3 h后,其存活率達85.68%;繼續在人工腸液處理8 h后,其存活率仍可達79.36%。本研究可為植物乳桿菌微膠囊包埋技術的開發及其在食品工業中的應用提供一定的數據和理論支持。