香芹酚-殼聚糖納米顆粒的制備及抑菌活性研究

邢承宇,王璐,陳星光,陸健*,吳殿輝*

1(糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(工業生物技術教育部重點實驗室,生物工程學院(江南大學),江蘇 無錫,214122)3(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心,江蘇 無錫,214122)

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)是引起谷物赤霉病(fusarium head blight,FHB)的主要微生物[1],在侵染谷物時會產生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol,DON)等真菌毒素[2]。DON對人和動物均具有高危害性,會引起腹痛、腹瀉、腸胃炎等疾病[3]。為了保障食品的安全性,可以通過抑制產毒真菌的生長來降低谷物污染[4]。目前抑制谷物中真菌生長和毒素積累的方法主要有化學法、物理法和生物脫毒法。化學法是向采后谷物噴灑咪唑類、硫氰酸類等人工合成殺菌劑,這些殺菌劑在后期加工過程中有顯著殘留且難以降解,并且有致癌、致畸形的風險[5]。物理法包括輻照法、高溫脫毒處理法等[6],雖然物理法不會引入有毒物質,但是在處理谷物過程中會降低谷物的營養價值。生物法包括酶解去毒技術、微生物代謝解毒法等[7]。采用生物法抑制產毒真菌的生長不會破壞谷物中的營養物質,但是有可能引入其他微生物造成二次污染[8]。因此,開發新型的綠色抗菌劑仍然是控制糧食霉變和保障食品安全的重要途徑之一。

作為天然產物,植物精油具有多樣的抗菌特性,同時在使用過程中不會污染環境[9]。香芹酚是一種單萜酚,是百里香和牛至等植物精油的主要活性成分[10],具有抑制或者殺死微生物的特性[11]。因其天然安全性和良好的抑菌活性已被美國和歐洲批準為食品添加劑[12],世衛組織表明適量濃度的香芹酚可用于食品保鮮,且不會對身體健康產生負面影響[13]。王新偉等[14]采用紙片擴散法及雙倍稀釋法研究了香芹酚對黑曲霉和面包酵母的抑菌效果,結果表明香芹酚在0.125 μL/mL時抑制了面包酵母的生長,在0.062 5 μL/mL時抑制了黑曲霉的生長,是一種良好的食品抗菌劑。然而,與其他精油一樣,香芹酚是揮發性化合物,在食品加工、藥物配制和抗菌膜制備等過程中容易蒸發或分解[15]。近年來,新興的納米封裝技術已被廣泛應用于生物活性物質的包埋和遞送,為了克服香芹酚在加工和貯存過程中的敏感性,可以通過納米封裝技術提高其穩定性。

殼聚糖是甲殼質的脫乙酰形式,對真菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有不同抗菌活性[16]。由于其無毒、吸附性強、可降解、生物活性高等特點,殼聚糖已廣泛應用于食品、醫藥、環境和農業等領域[17]。HOSSEINI等[18]研究了殼聚糖和苯甲酸制成的納米凝膠對百里香精油的包封作用。在密封條件下,百里香精油殼聚糖納米凝膠對黃曲霉的最低抑制質量濃度為300 mg/L,而游離百里香精油在>400 mg/L時才能完全抑制黃曲霉的生長。ALTAN等[19]成功制備了負載丁香油的殼聚糖納米顆粒,對單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)有很高的抗菌活性,負載丁香油的殼聚糖納米顆粒的抑菌圈明顯大于游離的丁香油,說明納米顆粒的制備可以顯著提高丁香油的抑菌特性。

殼聚糖經納米化后具有更小的粒徑和更高的比表面能,可以提高納米殼聚糖的生物活性。采用殼聚糖納米顆粒包埋天然植物精油或其抑菌成分可以提高抑菌物質的穩定性、控制釋放速率、屏蔽濃度過高的氣味,達到緩釋長效抑菌效果,從而拓寬天然精油的應用范圍。本研究選取抑菌性能較好的香芹酚,通過乳化交聯法制備香芹酚-殼聚糖納米顆粒,優化香芹酚-殼聚糖納米顆粒的制備工藝,通過冷場掃描電鏡(field emission scanning eletron microscope,FESEM)、傅里葉紅外掃描(Fourier transformed infra- red,FTIR)進行殼聚糖納米顆粒的微觀結構分析,測定了香芹酚-殼聚糖納米顆粒的抑菌穩定性,并初步探討了香芹酚-殼聚糖納米顆粒的抑菌機制,以期為殼聚糖-納米顆粒在食品中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)Fg-4為實驗室保藏,分離自感染赤霉病的大麥。

1.1.2 試劑及儀器

香芹酚、高分子量殼聚糖(脫乙酰度75%～80%),麥克林生化科技有限公司;三聚磷酸鈉(tri- polyphosphate,TPP),阿拉丁(試劑)有限公司;吐溫80、乙酸,國藥集團化學試劑有限公司;碘化丙啶PI染液,上海源葉生物科技有限公司。

Nano-ZSE納米粒度及zeta電位分析儀,英國馬爾文儀器有限公司;Quanta200掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,SEM),荷蘭FEI公司;T30k手持式勻漿機,上海班諾生物科技有限公司;Nicolet is 10傅里葉變換紅外光譜儀,美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司。TGA/DSC1/1100SF熱重分析儀,梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司;D2-PHASER X-射線衍射,德國布魯克AXS有限公司;真空冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;Ti-U倒置熒光顯微鏡,日本尼康公司。

1.1.3 培養基

馬鈴薯葡萄糖培養基(potato dextrose agar,PDA):取土豆200 g,去皮切塊放入鍋中,加入1 L蒸餾水,蒸煮土豆至綿而不爛(約20～30 min),紗布過濾,濾渣棄去,濾液加入葡萄糖20 g,瓊脂15～20 g,溶解后蒸餾水定容至1 L,121 ℃滅菌20 min;

綠豆培養基(mung bean agar,MBA):40 g的綠豆加入1 L蒸餾水,煮沸30 min,紗布過濾,濾液加入15～20 g的瓊脂,定容至1 L后121 ℃滅菌20 min;

羧甲基纖維素鈉培養基(sodium carboxymethyl-cellulose,CMC):取15.0 g CMC用熱水溶解,加入1.0 g KNO3,1.0 g NH4H2PO4,0.5 g MgSO4·7H2O,1.0 g酵母粉,定容至1 L,121 ℃滅菌20 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 香芹酚-殼聚糖納米乳液的制備

參考HOSSEINI等[18]的方法制備香芹酚-殼聚糖納米乳液并稍作修改。

吐溫80添加量對香芹酚-殼聚糖納米乳液穩定性的影響:將0、200、400、600、800、1 000 μL吐溫80作為表面活性劑分別加入40 mL殼聚糖溶液中,并在室溫下攪拌2 h,得到均勻的殼聚糖水溶液。將0.36 g香芹酚逐滴滴入上述40 mL殼聚糖水溶液中,使用手持均質機18 000 r/min下均質10 min,得到水包油乳液。向制得的水包油乳液中逐滴滴入40 mL 2 mg/mL的TPP溶液,滴加完成后用磁力攪拌器持續攪拌30 min,最后超聲處理10 min,超聲功率為100 W。

殼聚糖與香芹酚質量比對香芹酚-殼聚糖納米乳液穩定性的影響:其他制備工藝參數不變,考察殼聚糖與香芹酚質量比(1∶0.7、1∶0.9、1∶1、1∶1.2、1∶1.4、1∶1.6)對香芹酚-殼聚糖納米乳液穩定性的影響,確定最適的殼聚糖與香芹酚質量比。

三聚磷酸鈉濃度對香芹酚-殼聚糖納米乳液穩定性的影響:其他制備工藝參數不變,考察TPP質量濃度(0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL)對香芹酚-殼聚糖納米乳液穩定性的影響,確定最適的TPP濃度。

超聲時間對香芹酚-殼聚糖納米乳液穩定性的影響:其他制備工藝參數不變,考察超聲時間(0、4、8、12、16、20 min)對香芹酚-殼聚糖納米乳液穩定性的影響,確定最適的超聲時間。

1.2.2 香芹酚-殼聚糖納米乳液粒徑測定

參考WAN等[20]的方法采用Zetasizer Nano ZS激光衍射儀的動態光散射技術測量平均粒徑。測量前,所有樣品均通過0.22 μm濾膜過濾,所有測量均在25 ℃下進行3次掃描。

1.2.3 包封率測定

參考HOSSEINI等[18]的方法測量香芹酚-殼聚糖納米乳液的包封率。將香芹酚-殼聚糖納米乳液 5 mL 于4 ℃、9 000 r/min下離心10 min,取0.1 mL上清液,95%乙醇定容至5 mL,定容后在其最大吸收峰下測定吸光值,包封率為包封香芹酚的質量與原始質量之比,根據公式(1)計算:

(1)

1.2.4 香芹酚-殼聚糖納米顆粒制備

將600 μL吐溫80作為表面活性劑加入到40 mL殼聚糖溶液中,并在室溫下攪拌2 h,得到均勻的殼聚糖水溶液。將0.48 g香芹酚逐滴滴入上述40 mL殼聚糖水溶液中,使用手持均質機18 000 r/min下均質10 min,得到水包油乳液。向制得的水包油乳液逐滴滴入40 mL 2.5 mg/mL的TPP溶液,滴加完成后用磁力攪拌器持續攪拌30 min,超聲處理16 min,超聲功率為100 W。將得到的香芹酚-殼聚糖納米乳液在4 ℃,9 000 r/min條件下離心30 min,取沉淀,用去離子水洗滌3次,超聲5 min,將納米粒子分散在去離子水中,得到均勻的懸浮液。最后,將形成的懸浮液在-80 ℃預凍10 h,放入真空冷凍干燥機,凍干完成將干燥的香芹酚-殼聚糖納米顆粒取出放入棕色密閉玻璃瓶,于4 ℃貯藏備用。不含香芹酚的殼聚糖納米顆粒同香芹酚-殼聚糖納米顆粒的制備方法相似,即在殼聚糖納米乳液的制備過程中不添加香芹酚。

香芹酚-殼聚糖納米顆粒的微觀結構分析:參考SOTELO-BOYS等[21]的方法使用FESEM觀察香芹酚-殼聚糖納米顆粒的微觀結構。在硅片上滴1滴樣品懸液于陰涼處自然干燥,測試時直接將硅片置于樣品倉,放大倍數為20～100 k。

香芹酚-殼聚糖納米顆粒的化學組成分析:參考TASTAN等[22]的方法,使用Nicolet is 10紅外光譜儀測定香芹酚-殼聚糖納米顆粒的FTIR。分辨率為1 nm,在500～3 500 cm-1掃描/采樣200次。

1.2.5 香芹酚-殼聚糖納米顆粒的抗菌穩定性分析

將禾谷鐮刀菌作為測試菌株,禾谷鐮刀菌Fg-4從實驗室大麥原料中分離獲得。

參考WAN等[20]等的方法采用微孔稀釋法測定香芹酚和香芹酚-殼聚糖納米顆粒抑制鐮刀菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。

為了評價香芹酚-殼聚糖納米顆粒在貯藏期間的穩定性,將香芹酚-殼聚糖納米顆粒和香芹酚分別置于35 ℃恒溫箱加速貯藏50 d,分析貯藏期間第0、10、20、30、40、50天時2×MIC當量的香芹酚-殼聚糖納米顆粒和香芹酚對禾谷鐮刀菌Fg-4菌株的菌絲抑制率。

向裝有30 mL滅菌的PDA液體培養基的錐形瓶中分別加入香芹酚和香芹酚-殼聚糖納米顆粒使其終質量濃度為60 μg/mL,向液體培養基中加入50 μL菌絲,然后將錐形瓶置于30 ℃,140 r/min的搖床內培養48 h,待錐形瓶內長出菌絲球后用定量濾紙過濾去掉培養基和抑菌物質,得到菌絲。菌絲放置于烘箱內,在105 ℃下烘干2 h,待其恒重后稱量菌絲質量,重復稱重3次,每次質量之差不超過0.005 g,取平均值作為最終干菌絲質量,計算菌絲抑制率如公式(2)所示:

(2)

1.2.6 香芹酚-殼聚糖納米顆粒對菌絲體的破壞作用

接種1塊禾谷鐮刀菌菌餅于PDA平板中央,27 ℃下培養4 d進行活化,用打孔器于菌落邊緣打一新鮮菌餅,復接種于新鮮PDA平板中央,27 ℃下培養60 h。取2 mL香芹酚質量濃度為40 mg/mL香芹酚-殼聚糖納米顆粒加至菌落邊緣,滅菌的乙酸鹽緩沖液作為空白對照,27 ℃下繼續培養36 h。參考WU等[23]的方法,使用SEM觀察香芹酚-殼聚糖納米顆粒對真菌菌絲體的破壞作用。

2 結果與分析

2.1 香芹酚-殼聚糖乳液制備

不同因素對香芹酚-殼聚糖乳液穩定性的影響如圖1所示,當吐溫80添加量從0增加到2.5%(體積分數),粒徑從480 nm降低到101 nm,吐溫80的乳化和包埋作用增強。這可能是因為當表面活性劑質量分數較高時,大量的表面活性劑在油-水界面吸附,其吸附速率隨濃度增加,并會使界面張力顯著降低,從而更有利于小乳滴形成。吐溫80添加量為1.5%(體積分數)時,包封率最大,包封率為49%,粒徑<150 nm,因此,吐溫80的添加量選擇為1.5%(體積分數)。

當殼聚糖與香芹酚質量比從1∶0.5增加到1∶1.6時,粒徑從110 nm增加到180 nm,隨著殼聚糖與香芹酚質量比的增加,包封率先增加后減小,這是由香芹酚的負載量飽和所致。當殼聚糖與香芹酚質量比為1∶1.2時,包封率最大,包封率為55%,粒徑<200 nm。因此,殼聚糖與香芹酚的質量比選擇為1∶1.2。

當TPP質量濃度從0.5 mg/mL增加到3.5 mg/mL,粒徑從101 nm增加到450 nm,這是因為TPP與殼聚糖發生了靜電相互作用,使得粒徑增大,當TPP質量濃度> 2.5 mg/mL時,包封率明顯下降,這是因為當TPP濃度過大時,凝絮沉淀,包封率降低。因此TPP的最適質量濃度為2.5 mg/mL。

超聲時間對包封率的影響較小,超聲時間由0 min 增加至20 min,包封率在40%～45%變化,隨著超聲時間的增加,粒徑先降低后增加,粒徑的降低是因為隨著超聲時間的延長,部分聚集的較大液滴得到有效破壞。而當超聲時間過長時,香芹酚-納米乳液液滴粒徑稍有增加,這意味著乳液的再聚集。FLORIS等[24]報道中等時間的超聲處理會使乳液的液滴粒徑下降至最小值,較長時間的超聲處理反而導致液滴粒徑出現小幅度增加。因此,制備香芹酚-殼聚糖納米乳液的最佳超聲時間為16 min。

香芹酚-殼聚糖納米乳液的最佳制備工藝為:吐溫80的添加量為1.5%(體積分數),糖酚質量比為1∶1.2,TPP質量濃度為2.5 mg/mL,超聲時間為16 min。

a-吐溫80添加量;b-殼聚糖與香芹酚質量比;c-TPP質量濃度;d-超聲時間圖1 不同反應條件對香芹酚-殼聚糖乳液粒徑和包封率的影響Fig.1 Effect of different reaction conditions on the particle size and encapsulation efficiency of carvacrol-loaded chitosan emulsion

2.2 香芹酚-殼聚糖納米顆粒的微觀結構分析

2.3 香芹酚殼聚糖納米顆粒的化學組成分析

圖3顯示了殼聚糖粉末、殼聚糖納米顆粒、香芹酚和香芹酚-殼聚糖納米顆粒的FTIR圖譜。殼聚糖粉末在2 851 cm-1(—CH拉伸)、1 641 cm-1(苯基)、1 080 cm-1(C—O—C拉伸)、53 cm-1(吡喃側環拉伸)顯示出特征峰(圖3中b曲線)。對于殼聚糖納米顆粒來說,苯基的峰值從1 632 cm-1移動到1 641 cm-1,而且在1 540 cm-1(氨基Ⅱ)處和1 028 cm-1(葡萄糖環的C—O—C拉伸)沒有出現峰值,表示納米顆粒內殼聚糖的NH3基團和TPP的磷酸基團之間通過靜電相互作用形成復合物。香芹酚精油中的特征峰1 618(C—H彎曲)、1 242(C—O—C拉伸)、941 cm-1(C—H拉伸),均出現在香芹酚-殼聚糖納米顆粒的光譜中,波數相同,表明香芹酚與殼聚糖納米顆粒之間沒有修飾或相互作用。圖3的2 926 cm-1和2 851 cm-1C—H伸展振動強度增加,這是由于包埋香芹酚后C—H含量急劇上升,從而進一步證明香芹酚的包埋成功。

a-殼聚糖納米顆粒;b-香芹酚-殼聚糖納米顆粒圖2 殼聚糖納米顆粒及香芹酚-殼聚糖納米顆粒FESEM圖譜Fig.2 FESEM pattern of chitosan nanoparticles and carvacrol-loaded chitosan nanoparticles

a-殼聚糖納米顆粒;b-殼聚糖;c-香芹酚-殼聚糖納米顆粒;d-香芹酚圖3 殼聚糖、殼聚糖納米顆粒、香芹酚-殼聚糖納米顆粒及香芹酚的傅里葉紅外光譜Fig.3 FTIR pattern of chitosan, chitosan nanoparticle,carvacrol-loaded chitosan nanoparticles and free carvacrol

2.4 香芹酚-殼聚糖納米顆粒的抗菌穩定性分析

通過微孔稀釋法測定了香芹酚和香芹酚-殼聚糖納米顆粒對禾谷鐮刀菌的MIC,香芹酚和香芹酚-殼聚糖納米顆粒的MIC分別為250 μg/mL和125 μg/mL(表1),研究結果表明,香芹酚的包埋不會影響其抑菌活性,相比游離香芹酚,香芹酚-殼聚糖納米顆粒的MIC值更低,說明殼聚糖納米顆粒的包埋能夠改善香芹酚的抗菌活性。

圖4 比較了香芹酚-殼聚糖納米顆粒和香芹酚在儲存期間抑菌穩定性的變化,貯存第0天時,香芹酚的抑菌效果大于香芹酚-殼聚糖納米顆粒的抑菌效果,這是因為香芹酚-殼聚糖納米顆粒此時發揮抑菌作用主要依靠游離在香芹酚-殼聚糖納米顆粒表面的香芹酚以及香芹酚-殼聚糖納米顆粒釋放出的部分香芹酚。在35 ℃貯藏30 d后,香芹酚的菌絲抑制率下降至56.3%,而香芹酚-殼聚糖納米顆仍保持較高的抑菌能力,菌絲抑制率為61.4%,表明在貯藏過程中,納米顆粒具有保護芯材的作用。隨著貯藏時間的繼續延長,香芹酚和香芹酚-殼聚糖納米均表現出抑菌能力下降的趨勢,但是差異增大,在貯藏第50天時,香芹酚-殼聚糖納米顆粒僅降至47.7%,而香芹酚降至25.1%,表明香芹酚-殼聚糖納米顆粒提高了香芹酚的抑菌穩定性。

表1 香芹酚和香芹酚-殼聚糖納米顆粒對禾谷鐮刀菌的MICTable 1 MIC of free carvacrol and carvacrol-loaded chitosan nanoparticles against F.graminearum

圖4 香芹酚-殼聚糖納米顆粒和香芹酚在貯存期間的抑菌穩定性Fig.4 Antifungal stability of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles and free carvacrol before and after storage

2.5 香芹酚-殼聚糖納米顆粒對菌絲體的破壞作用

由圖5 SEM結果可知,未經香芹酚-殼聚糖納米顆粒抑菌處理的霉菌菌絲較挺直,具有一定的支撐能力,細胞膜表面較為完整光滑,但是經過香芹酚-殼聚糖納米顆粒抑菌處理的霉菌菌絲表面皺縮,菌絲彎曲,菌絲形態改變,表明細胞壁和細胞膜的完整性遭到破壞。SEM結果表明,香芹酚-殼聚糖納米顆粒通過破壞菌絲細胞膜,使其菌絲皺縮,生長停滯,抑制產孢結構生成的方式,從而抑制禾谷鐮刀菌的生長。

a-未經處理的禾谷鐮刀菌菌絲生長狀況;b-經香芹酚-殼聚糖納米納米顆粒處理的禾谷鐮刀菌菌絲生長狀況圖5 香芹酚-殼聚糖納米顆粒處理前后禾谷鐮刀菌菌絲生長狀況SEM照片Fig.5 SEM of mycelial growth of F.graminearum before and after treatment by carvacrol-loaded chitosan nanoparticles

3 結論

本研究采用乳化交聯法制備了香芹酚-殼聚糖納米乳液,最佳制備條件為:吐溫80的添加量為1.5%(體積分數),殼聚糖與香芹酚質量比為1∶1.2,TPP質量濃度為2.5 mg/mL,超聲時間為16 min。此時粒徑為180 nm,包封率為62%,并展現出良好的貯藏穩定性。FESEM分析表明香芹酚-殼聚糖納米顆粒的形成,納米顆粒均勻分布,呈規則球狀,粒徑大小為80 nm。FTIR進一步證明殼聚糖對香芹酚的包埋是成功的。通過在貯藏期間比較香芹酚和香芹酚-殼聚糖納米顆粒的抑菌穩定性,隨著貯藏時間的延長,香芹酚的菌絲抑制率由82.2%降至25.1%,而香芹酚-殼聚糖納米顆粒的菌絲抑制率仍為47.7%。掃描電鏡觀察的結果表明,香芹酚-殼聚糖納米顆粒處理破壞了禾谷鐮刀菌的細胞壁和細胞膜的完整性,從而抑制其菌絲生長。綜上所述,將香芹酚包埋至殼聚糖納米顆粒提高了香芹酚的抑菌穩定性,拓寬了香芹酚的使用范圍,為未來防治糧食霉變,控制糧食中真菌毒素含量提供了可靠的理論基礎。