糟醉魚中高抗氧化活性乳酸菌的篩選與鑒定

谷貴章,張帥,諸夔妞,胡奇杰,曾坤

1(湖州市食品藥品檢驗研究院,浙江 湖州,313000)2(寧波大學 食品與藥學學院,浙江 寧波,315211)

發(fā)酵肉制品是指原料肉在特定溫度和濕度條件下,經微生物發(fā)酵或酶的作用而制成,具有較長貨架期和特殊風味、質地、色澤的肉制品。亞洲是發(fā)酵魚的主要市場,尤其是中國,發(fā)酵魚類型有貴州和湖南地區(qū)的酸魚、安徽地區(qū)的臭鱖魚、廣東地區(qū)的糟魚、潮汕地區(qū)的魚露、海南地區(qū)的魚茶等[1]。

傳統(tǒng)發(fā)酵魚的生產工藝主要是以復雜的微生物群落為特征的自然發(fā)酵。自然發(fā)酵體系需要很長時間才能形成優(yōu)勢微生物群落,這已成為大多數(shù)傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)化生產的瓶頸[2]。自然微生物群落容易受到環(huán)境條件的影響和污染,如溫度變化、腐敗菌、致病菌等。YANG等[3]研究了水分、溫度等生產因素對臭鱖魚品質的影響,但仍難以生產出品質穩(wěn)定的發(fā)酵魚。接種發(fā)酵劑是提高發(fā)酵食品質量的常用策略[4-5],具有提高產品質量、縮短發(fā)酵時間、延緩變質和改善風味等優(yōu)點。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)作為流行的發(fā)酵劑,廣泛用于各種食品的發(fā)酵,如肉類、魚類和奶酪的生產。據(jù)報道[6],內源性彎曲乳桿菌LAB26和戊糖片球菌SWU73571能顯著增加酸肉中乳酸菌數(shù)和氨基酸含量,且能抑制亞硝酸鹽、生物胺、丙二醛(malondial- dehyde,MDA)等物質的產生。BAO等[2]的研究表明,內源性乳酸鏈球菌M10和食竇魏斯氏菌M3能快速適應臭鱖魚生態(tài)變成優(yōu)勢菌群,抑制腐敗菌的滋生和硫代巴比妥酸反應物、揮發(fā)性鹽基總氮的增加,促進香氣活性成分與關鍵揮發(fā)性成分的形成,可節(jié)省29%的發(fā)酵時間。GAO等[7]發(fā)現(xiàn),接種植物乳桿菌可加快風味的形成,尤其是發(fā)酵魚中的酯化與醇解生物合成途徑。

水產品具有低脂肪、高蛋白等特點,極易發(fā)生脂肪和蛋白氧化,造成色澤變暗、彈性變差以及安全性降低等不良變化[8]。當前,生產企業(yè)通常使用人工抗氧化劑,如丁基羥基茴香醚、二丁基羥基甲苯和特丁基對苯二酚等來延長發(fā)酵魚的貨架期。但人工抗氧化存在食品安全風險[9-10],備受弊病。乳酸菌可作為一種食源性抗氧化劑進行應用,其自身的抗氧化活性已得到廣泛證實。LI等[11]從中國傳統(tǒng)香腸中分離出的植物乳桿菌C88具有良好的羥自由基和DPPH自由基清除活性;李默等[12]報道了希臘魏斯氏菌L23有較強的羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基清除活性及脂質抗氧化能力,可作為天然高抗氧化發(fā)酵劑用于肉制品生產;HAN等[13]從哈爾濱干香腸中分離的彎曲乳桿菌R5和發(fā)酵乳桿菌R6能有效地抑制脂肪過氧化。另外,乳酸菌降解蛋白質形成的肽也有抗氧化活性[14]。

目前,我國利用乳酸菌發(fā)酵肉制品的研究多集中于香腸和火腿,對發(fā)酵魚的研究較少。發(fā)酵魚所用的發(fā)酵劑受多重因素影響,具有專一性,所以外源性商業(yè)化發(fā)酵劑不適用[15]。糟醉魚是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵魚制品,風味獨特,倍受消費者喜愛。本文旨在以青占魚為研究對象,從其自然發(fā)酵成品中篩選耐鹽、產酸、抗氧化皆佳的乳酸菌菌株,為糟醉青占魚的接種發(fā)酵提供優(yōu)質的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青占魚[(200±20) g]、糯米、食鹽、白酒;MRS瓊脂培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基,杭州微生物試劑有限公司;亞油酸(60%～70%)、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)、維生素E等，均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-4802紫外可見分光光度計,尤尼柯儀器有限公司;Docu-PH pH計,賽多利斯科學儀器有限公司;XSP-2C雙目型生物顯微鏡,上海豫光儀器有限公司;StepOnePlus實時熒光定量PCR儀,美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 糟醉魚制作

制備酒糟:浸糯米(20 ℃、18 h)、蒸飯(15～20 min)、淋飯(冷卻后置于鋁箔,約2 cm厚,撒少許涼開水)、拌曲(將適量白酒均勻噴在糯米上并拌勻)、入缸發(fā)酵(30～32 ℃,40～48 h)。制備糟醉魚:將青占魚去頭、去尾、去內臟,切成約2 cm×3 cm塊狀,在150 g/L 的鹽水中浸漬48 h,風干(濕度57%以下,溫度18～22 ℃);酒糟中添加質量分數(shù)為5%的食鹽和3%的白酒,拌勻。酒糟與青占魚質量比為1.5∶1,以一層糟一層魚的方式,在30 ℃下密封糟醉成熟。

1.3.2 乳酸菌的分離培養(yǎng)

參照文獻[16]進行乳酸菌的分離培養(yǎng)。

1.3.3 菌落形態(tài)觀察

挑選菌落分布較好的培養(yǎng)皿,肉眼觀察培養(yǎng)皿中菌落的形態(tài)及特征。

1.3.4 乳酸菌的分離和純化

選取溶鈣圈較大的菌落,挑取并劃線接種于MRS瓊脂平板,(36±1) ℃培養(yǎng)48 h。重復上述操作,直至出現(xiàn)單個菌落。

1.3.5 乳酸菌的初步篩選

參照文獻[17]進行革蘭氏染色、鏡檢、過氧化氫試驗及葡萄糖產酸產氣試驗。

1.3.6 乳酸菌體外抗氧化液的制備

將乳酸菌活化后接種于MRS肉湯培養(yǎng)基,(36±1)℃培養(yǎng)16 h。細胞培養(yǎng)液在4 ℃、10 000 r/min下高速離心10 min,離心后,細胞培養(yǎng)上清液即為乳酸菌體外抗氧化液。

1.3.7 乳酸菌抗脂質過氧化率測定

參照文獻[18-19]進行抗脂質過氧化率測定。向0.5 mL 磷酸鹽緩沖溶液(0.02 mol/L、pH 7.4)中加入亞油酸1 mL、10 g/L FeSO4溶液l mL、待測液0.5 mL,37 ℃ 水浴中反應1.5 h,加入40 g/L TCA溶液 0.2 mL、8 g/L TBA溶液2 mL,沸水浴中反應30 min,迅速冷卻,離心,過濾,上清液于波長532 nm處測定吸光度。空白對照組為0.5 mL MRS肉湯培養(yǎng)基;調零組為0.5 mL磷酸鹽緩沖溶液加等體積的細胞培養(yǎng)上清液;陽性對照組為不同質量濃度(0～1.0 g/L)的維生素E溶液?？怪|過氧化率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A樣品,細胞培養(yǎng)上清液的吸光度;A空白,MRS肉湯培養(yǎng)基的吸光度。

1.3.8 乳酸菌耐鹽性測定

取0.1 mL活化后的菌液置于9.9 mL、NaCl質量分數(shù)分別為0%、2%、4%、6%的MRS肉湯培養(yǎng)基中,(36±1) ℃培養(yǎng)16 h。在波長600 nm處測定吸光度,以0%的菌液為空白對照組。

1.3.9 乳酸菌產酸能力測定

取0.1 mL活化后的菌液置于9.9 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,(36±1) ℃培養(yǎng),24 h內測定培養(yǎng)基的pH值,每2 h測定1次。

1.3.10 乳酸菌生理生化鑒定試驗

過氧化氫酶試驗、二乙酰試驗(Voges-Proskauer,V-P)、產H2S試驗、葡萄糖產酸產氣試驗、精氨酸產氨試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、石蕊牛奶試驗、脲酶試驗、葡聚糖試驗和精氨酸水解試驗,測試方法參照文獻[20]。

1.3.11 乳酸菌16S rDNA鑒定試驗

以細菌16S rRNA的通用引物27F和1541R擴增16S rDNA序列。(1)引物序列:27F(5′-AGA PTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1541R(5′-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3′)。(2)PCR反應體系:25 ng模板,4 μmol/L引物,200 μmol/L dNTP,2.5 μL 10倍緩沖液,1.5 mmol/L MgC12,0.75 U DNA聚合酶,加雙蒸水至25 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃保持1 min,重復循環(huán)28次;最后72 ℃延伸5 min。

1.3.12 糟醉魚感官評價

從色澤、滋味、糟香味、異味和質地5個指標來評定糟醉魚的感官品質,總分為100分,感官評定標準見表1。滋味權重占25%;色澤、糟香味、異味次之,占20%;質地占15%。10名受專業(yè)培訓的品評人員,品評前24 h內禁煙、禁酒、禁食刺激性食物。

表1 糟醉魚的感官評定標準Table 1 The sensory evaluation criteria for fermented drunk fish

2 結果與分析

2.1 菌落形態(tài)觀察

乳酸菌為厭氧或兼性厭氧菌,多分布于培養(yǎng)基中層或底層。乳酸菌菌落微小,直徑約1.0～1.5 mm,呈乳白色或米黃色,不透明或半透明;菌落表面光滑、邊緣整齊,多呈圓形或針尖形。基于上述特征,從自然糟醉魚中分離出40株目標菌株。

2.2 乳酸菌的初步篩選

2.2.1 形態(tài)觀察

將分離純化后的40株目標菌株進行革蘭氏染色,油鏡下觀察其形態(tài)特征。有33株為革蘭氏陽性菌,5株為革蘭氏陰性球菌,2株為革蘭氏陰性桿菌。5株革蘭氏陰性球菌呈成對狀或短鏈狀分布,無芽孢,無鞭毛。

2.2.2 過氧化氫酶試驗

選擇33株革蘭氏陽性菌進行初步鑒定,經過過氧化氫酶試驗判定,有20株呈陰性,13株呈陽性。

2.2.3 葡萄糖產酸產氣試驗

選擇過氧化氫酶試驗中呈陰性的20株革蘭氏陽性菌進行葡萄糖產酸產氣試驗,結果顯示,20株目標菌株初步判定為乳酸菌,且均可利用葡萄糖產酸,但不產氣。

2.3 抗氧化乳酸菌株的篩選

抗脂質過氧化試驗是檢測抗氧性的常用方法。試驗中亞油酸不飽和體系經Fe2+催化生成過氧化物,過氧化物繼續(xù)分解生成次級氧化產物丙二醛,在酸性條件下與TBA反應生成紅色縮合物,在波長532 nm處有強吸收峰,抗氧化性物質加入能夠抑制紅色產物的生成[18]。以不同濃度的維生素E 溶液為陽性對照,測定乳酸菌細胞培養(yǎng)上清液的抗脂質過氧化率,結果如圖1所示。

由圖1可知,20株乳酸菌的抗脂質過氧化率均在29%以上,其中有13株(L1～L13)超過了50%,有7株(L1～L7)超過了60%;L1菌株最高,為77.05%,維生素E當量為0.69 g/L。

2.4 高耐鹽乳酸菌株的篩選

發(fā)酵肉制品中的鹽分較高。適量的鹽分,不僅可以抑制致病菌和腐敗菌的滋生,還能增強肉的保水力;但鹽分也會直接影響肉制品中發(fā)酵菌株的生長[21],因此需要測試菌株的耐鹽性。糟醉魚中食鹽的含量約為5%(質量分數(shù)),所篩選菌株應在5%及以上時生長良好。本試驗模擬不同質量分數(shù)的NaCl條件,采用比濁法,在波長600 nm處測定菌液的吸光度,作為耐鹽性評價指標。結果表明,有8株乳酸菌能在NaCl含量5%(質量分數(shù))及以上發(fā)酵體系中存活,結果如圖2所示。

從吸光度的變化趨勢來看,鹽分的增加對8株乳酸菌的生長均有不同程度的抑制作用。菌株L1、L5和L6的吸光度變化較為平穩(wěn),在NaCl含量為6%(質量分數(shù))時,它們的吸光度仍在0.6以上,表明在高鹽條件下L1、L5和L6仍具備良好的生長能力和耐受性。

圖2 乳酸菌在不同NaCl含量下的生長情況Fig.2 The growth situation of LAB in different mass fractions of NaCl

2.5 乳酸菌株產酸能力比較

產酸能力是衡量乳酸菌發(fā)酵劑性能的重要指標之一。乳酸菌產酸速度快可縮短發(fā)酵周期,迅速使其變成優(yōu)勢菌群,抑制腐敗菌和致病菌的滋生,提高產品的生物安全性[22]。本試驗將抗氧化與耐鹽能力較好的菌株L1、L5和L6接種于MRS肉湯培養(yǎng)基,通過pH值的變化來比較三者的產酸能力,結果如圖3所示。

圖3 乳酸菌在不同時間下的產酸能力曲線Fig.3 The acid yield curve of LAB at different time

結果顯示,L1、L5和L6均能在24 h內將pH值從7.4降至4.7左右,說明三者均具有較強的產酸能力;前6 h內,pH值下降緩慢,說明菌株可能正在適應此時的生長環(huán)境,故乳酸產量較低;從第6 h到第12 h,培養(yǎng)液的pH值下降迅速,表明菌株代謝旺盛產生了大量乳酸,致使培養(yǎng)液pH值迅速下降;12 h后,pH值再次下降緩慢,說明隨著營養(yǎng)物質的大量消耗和毒性產物的大量積累,菌株生長代謝的速度放緩,已進入平穩(wěn)期甚至是衰亡期。

為了評價L1、L5和L6產酸能力是否有顯著差異,對MRS肉湯培養(yǎng)基pH值進行方差分析,結果如表2所示。

表2 MRS肉湯培養(yǎng)基pH值的方差分析Table 2 Analysis of variance on the pH value of MRS broth

由表2可知,P值>0.05說明L1、L5和L6的MRS肉湯培養(yǎng)基pH值變化無顯著差異,故三者產酸能力相當。

2.6 乳酸菌生理生化鑒定

經過氧化氫酶試驗、V-P試驗、產H2S試驗等測試,菌株L1、L5和L6的生理生化特征如表3所示。

表3 菌株L1、L5和L6的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strains L1, L5, and L6

結果顯示,菌株L1、L5和L6的生理生化特征完全一致,且該特征與腸球菌屬最接近,具體參見《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》[23]和《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[24]。

2.7 乳酸菌生理生化鑒定

16S rDNA是細菌染色體上編碼16S rRNA相對應的序列,存在于所有細菌染色體基因中,其內部由保守區(qū)和可變區(qū)兩部分組成;由于其分子內存在的可變區(qū)顯示細菌不同分類等級水平的特異性,故可用利用保守區(qū)序列設計引物,將16S rDNA片段進行擴增,利用可變序列的差異對不同菌屬、菌種的細菌進行分類鑒定[18]。經過DNA測序,L1、L5和L6的16S rDNA序列完全一致。NCBI在線BLAST進行同源性分析,該序列與耐久腸球菌(Enterococcusdurans)相似度為100%。另外,用Mega11.0軟件將三者與相關腸球菌屬乳酸菌構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果如圖4所示。

L1、L5和L6與耐久腸球菌聚成一簇,同源性最為相近,置信度為92,表明L1、L5和L6均為耐久腸球菌。

2.8 發(fā)酵方式對感官品質的影響

菌株L1、L5和L6的耐鹽性和產酸能力相當,但L1的抗氧化活性最強,更符合糟醉發(fā)酵的要求。為了比較自然發(fā)酵和接種發(fā)酵對糟醉魚感官品質的影響,嘗試將L1菌株與自然發(fā)酵后的酒糟混合(接種量為108CFU/g),采用一層糟一層魚的方式腌制,然后將自然發(fā)酵和接種發(fā)酵的試樣置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中,發(fā)酵成熟。按照1.2.12評定標準對成品進行感官評定,并根據(jù)評定分數(shù)繪制雷達圖,結果如圖5所示。

圖4 分離株與相關腸球菌屬乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of three isolated strains and related Enterococcus LAB

圖5 兩種不同發(fā)酵方式在糟醉魚感官評價上的比較Fig.5 The comparison of two different fermentation methods on sensory evaluation of fermented drunk fish

由圖5可知,從色澤和異味看,尤其是色澤,自然發(fā)酵的氧化程度明顯大于接種發(fā)酵,致使糟醉魚表皮發(fā)黃并稍有異味(如油耗味),說明L1在一定程度上能夠抑制脂肪的過度氧化;從滋味和質地看,兩者相當,表明接種發(fā)酵能較好地保持糟醉魚的原有特征;從糟香味看,接種發(fā)酵的稍淡,可能是接種發(fā)酵的肉質稍微松軟,導致對易揮發(fā)醇類物質的吸附力下降。總體上,接種L1菌株對糟醉魚的感官品質有明顯的提升作用。

3 結論

從試驗結果來看,有3株耐久腸球菌符合糟醉魚的發(fā)酵要求;其中L1的抗氧化活性最高,其抗脂質氧化率達77.05%。經專業(yè)人員品評,L1接種發(fā)酵的成品較好地保持了糟醉魚的原有特征,且色澤和異味優(yōu)于自然發(fā)酵。L1能有效地抑制脂肪的過度氧化,對糟醉魚的感官品質有顯著提升作用,可作為糟醉魚接種發(fā)酵的菌種資源。但接種L1也減弱了成品的糟香味,后續(xù)擬基于糟醉魚的香氣成分分析,嘗試通過優(yōu)化工藝參數(shù)來改善糟醉魚的風味品質。