不同口感鮮切蓮藕褐變的生理生化及分子機制研究

張晨,史艷楠,楊寧寧,秦莉莉,唐佳偉,董臣*

1(河南工業大學 生物工程學院,河南 鄭州,450001)2(河南工業大學 國際教育學院,河南 鄭州,450001)

蓮藕作為我國重要的水生經濟作物,廣泛種植于湖北、湖南、江西、福建等地。蓮藕富含水分、蛋白質、碳水化合物、膳食纖維、胡蘿卜素、視黃醇、核黃素、維生素C和維生素E等[1-3]物質，具有較高的食用價值。

蓮藕根據口感品質可以分為三大類。一類是粉質藕,口感柔軟、黏度大、適于煨湯,制作藕粉和糯米藕等,常見的有鄂蓮5號;另一類是脆質藕,口感脆嫩、黏度低、適于涼拌或清炒,常見的有鄂蓮3號;另有口感居于兩者之間的品種如鄂蓮4號。蓮藕也是我國出口的重要蔬菜之一,具有較高的經濟價值。由于蓮藕富含水分、外表皮薄、容易被損壞、貯藏期間易失水干縮和褐變變色,所以將新鮮蓮藕進行鮮切加工,供應餐飲業使用或作為即食產品成為了蓮藕銷售的主流方式[4-6]。然而鮮切后的蓮藕在加工和貯藏期間容易變質,存放的時間短,影響產品的出口和銷售[7]。褐變是限制蓮藕品質的重要因素,鮮切蓮藕的褐變以酶促褐變為主,相關機理的研究主要集中于酚、酚酶區域性分布學說、自由基傷害假說和保護酶系統假說[8]。然而不同口感鮮切蓮藕褐變的生理生化差異及機制研究卻鮮有報道,這對于篩選適合鮮切加工的蓮藕品種至關重要。因此作者選用了3種不同口感的蓮藕品種,通過對其鮮切后的外觀和生理生化水平進行分析,結合相關基因的表達,研究不同口感蓮藕褐變的生理生化特征及其分子機制,以及鮮切產品的適用性[9],旨在為解決蓮藕褐變提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

試驗所用蓮藕品種為鄂蓮3號;鄂蓮4號和鄂蓮5號均由廣昌白蓮研究所提供。選取品種一致,大小正常,顏色均勻無機械損傷的蓮藕,備用。

1.1.2 試劑

乙二胺四乙酸、氮藍四唑、乙酸、碳酸氫鈉、過氧化氫、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、對氨基苯磺酸、α-萘胺、甲硫氨酸、氮藍四唑,國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化鈉、草酸、酚酞、甲醇、愈創木酚、核黃素、酒石酸鈉、苯酚、乙醇、乙酸鈉,天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機、A590型雙束紫外可見分光光度計,翔藝儀器(上海)有限公司;干式恒溫器,杭州奧盛儀器有限公司;電熱式恒溫水槽,翔藝儀器(上海)有限公司;電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;JJ200型電子天平,常熟市雙杰測試儀器廠;電熱恒溫鼓風干燥箱,翔藝儀器(上海)有限公司;MX-S可調式漩渦混勻儀,北京鑫潤科諾儀器儀表有限公司;SX-500滅菌鍋,翔藝儀器(上海)有限公司;微孔板掃描分光光度計,BioTek儀器。

1.3 實驗方法

1.3.2 還原糖含量、可溶性蛋白質含量、總酚含量和維生素C含量的測定

在波長540 nm處測定吸光度,采用DNS(3,5-二硝基水楊酸)比色法測量還原糖[14];在595 nm處測定其吸光度,采用考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量[16];總酚含量的測定采用HCl-甲醇法[16]。在波長290 nm處測定吸光度;采用二氯酚靛酚滴定法測定維生素C含量。

1.3.3 抗氧化系統酶活性分析

采用愈創木酚氧化法分析POD活性[17],在波長470 nm處測定吸光度。每隔半分鐘記錄其吸光度的數值,連續記錄6次,酶活力大小用每分鐘A470改變0.01表示;氮藍四唑光化還原法分析SOD活性[18]。通常用抑制氮藍四唑光化還原的50%作為1個酶活性單位來表示SOD活性。

采用丙酮法提取PPO酶粗酶液,在波長420 nm處測定吸光度計算PPO酶活性,在波長595 nm處測吸光度算得PPO酶總蛋白量,計算出PPO酶比活力[19]。

1.3.4 APX、CAT、Mn-SOD、Cu,Zn-SOD、PPO和POD熒光定量分析

用Hipure piant RNA mini kit 試劑盒提取不同口感不同時期蓮藕的RNA,再把RNA反轉錄成cDNA。用定量酶進行定量分析[20]。本文章所用引物如表1所示。

表1 文章所用引物Table 1 Primers used in the article

2 結果與分析

2.1 鮮切蓮藕的外觀

通過觀察不同口感鮮切蓮藕的褐變過程,發現低溫貯藏第1天不同口感的鮮切蓮藕開始發生褐變,如圖1所示。低溫貯藏第2天鄂蓮4號褐變最顯著;鄂蓮3號在貯藏第4天和第5天時褐變明顯;鄂蓮5號分別在低溫貯藏第3天和第4天褐變明顯。鄂蓮3號鮮切第0天,外觀偏白偏亮更適合做鮮切加工。

圖1 不同口感鮮切蓮藕褐變表觀變化Fig.1 Apparent changes of browning of fresh cutlotus roots with different tastes

2.2 還原糖含量、可溶性蛋白質含量、總酚含量和維生素C 含量

試驗所用的鮮切鄂蓮3 號、鄂蓮4 號和鄂蓮5 號貯藏期間還原糖含量、可溶性蛋白質含量、總酚含量和維生素C 含量的變化如圖2 所示。還原糖的變化與蓮藕的褐變和呼吸作用有關,還原糖主要來源于總糖的分解,還原糖的消耗主要因為呼吸作用,在整個貯藏期間3 種蓮藕還原糖含量都成上升趨勢。隨著貯藏時間的延長,褐變蓮藕內還原糖含量延長,鄂蓮4 號的變化幅度較大,但鄂蓮3 號的還原糖含量較低,變化幅度較小。隨著貯藏時間的延長,3 個品種的可溶性蛋白質含量降低,但鄂蓮3 號相對于其他2個品種下降幅度較小,但3 個品種總的變化趨勢相同。

酚類化合物是植物組織褐變的重要底物之一,新鮮蓮藕中的酚類化合物容易被酚類酶氧化和褐變,從而使鮮切蓮藕發生表觀變化。實驗結果表明，不同品種蓮藕總酚延長含量存在差異,鄂蓮4 號在鮮切第1 天總酚延長含量最低,鄂蓮3 號和鄂蓮5 號總酚延長含量基本一樣。在整個貯藏期間,鄂蓮3 號和鄂蓮5 號變化幅度較為平緩,鄂蓮4 號在第4 天總酚含量下降明顯。鮮切蓮藕體內維生素C 在氧化酶的作用下可發生降解,從而導致含量下降。在整個貯藏期間,鄂蓮3 號、鄂蓮4 號和鄂蓮5 號這3 個品種中蓮藕的維生素C 含量都呈下降趨勢,但是鄂蓮4 號前3 d 持續降低,最后1 d 略微升高,鄂蓮3 號和鄂蓮5 號,這2 個品種貯藏第1 天略微升高,之后緩慢降低。這一結果顯示不同品種的蓮藕中維生素C 在鮮切后的貯藏期間的變化規律是不同的。

a-還原糖;b-可溶性蛋白;c-總酚;d-維生素C圖2 不同蓮藕品質變化Fig.2 Quality changes of different lotus roots

2.3 褐變度、呼吸強度、MDA含量和含量

2.4 抗氧化系統酶的活性

a-褐變度;b-呼吸強度;含量圖3 不同蓮藕生理生化的變化Fig.3 Physiological and biochemical changes of different lotus roots

a-POD活性;b-SOD活性;c-PPO活性圖4 不同蓮藕抗氧化系統酶活性的變化Fig.4 Changes of enzyme activities of antioxidant system in different lotus roots

2.5 不同蓮藕不同基因熒光定量分析

基因在mRNA水平的表達模式和其生物學功能具有密切關系。采用熒光定量PCR技術分析PPO、Mn-SOD、Cu,Zn-SOD、CAT、APX和POD基因在蓮藕褐變中的表達模式,結果如圖5所示。鄂蓮3號的PPO基因在低溫貯藏第2天時相對于鄂蓮4號和鄂蓮5號的表達量偏低,而鄂蓮4號的PPO基因表達量在這天達到最大值,這與之前的褐變實驗結果是一致的;鄂蓮3號的POD基因表達量在低溫貯藏第2天時遠高于4號和鄂蓮5號,這和之前的POD活性的結果是一致的;鄂蓮3號的Mn-SOD基因表達量在鮮切低溫貯藏第2天高于鄂蓮4號和鄂蓮5號。

3 結論

3.1 褐變對鮮切蓮藕的品質影響

本實驗選用了3種湖北種植的蓮藕品種:鄂蓮3號、鄂蓮4號和鄂蓮5號,發現不同品種的蓮藕在鮮切貯藏期間各項指標存在著顯著的差異,主要表現為鄂蓮3號的還原糖含量、可溶性蛋白質含量、維生素C含量和總酚含量的變化幅度均比鄂蓮4號和鄂蓮5號低。鮮切蓮藕中的可溶性蛋白質含量在整個貯藏期間處于相對平衡的狀態。這是由于蛋白質發生了變性和水解反應,另一方面是因為新的游離蛋白被細胞釋放出來。在貯藏后期,鮮切的蓮藕產品發生了嚴重的褐變,總糖發生分解反應產生還原糖,其中大部分被蓮藕的呼吸作用所消耗。在特定的條件下,只有一小部分的還原糖參與美拉德反應[21]。

a-APX;b-CAT;c-Mn-SOD;d-Cu,Zn-SOD;e-POD;f-PPO圖5 熒光定量分析表達Fig.5 Quantitative real-time PCR analysis

3.2 褐變造成的不同口感鮮切蓮藕的生理特征改變

不同品種的蓮藕中,SOD和POD是活性氧清除系統中主要的2種酶,它們的活性大小也有差異。鮮切貯藏期間的3個品種的蓮藕在同一時間測定,鄂蓮4號中的這2種酶的活性變化趨勢都大于同期的其他2個品種,鄂蓮3號的這2種酶活性變化相對平緩。結果表明,相比其他2個品種,鄂蓮3號中的活性氧清除系統更強大,對不良的貯藏環境的應激能力和反應程度也比較強,能更好地保護植物細胞免受活性氧等有害物質的侵害以及減緩脂質過氧化作用的發生。

綜上,鄂蓮3號、鄂蓮4號和鄂蓮5號這3個品種的蓮藕在品質和生理特性上都存在著明顯的差別,表現為鄂蓮3號的可溶性蛋白質、維生素C 和總酚的含量較高,褐變相關的酶SOD 和POD 活性較強。鄂蓮3 號品種更適合鮮切加工。