基于高通量測序解析濃香型大曲真菌群落結構及其與質量指標的關聯性分析

程偉,陳雪峰,陳興杰,周端,付歡,薛錫佳,鹿靜靜,代森

1(陜西科技大學 食品與生物工程學院,陜西 西安,710021)2(安徽金種子酒業股份有限公司,安徽 阜陽,236023) 3(陜西農產品加工技術研究院,陜西 西安,710021)

中國白酒以大曲作為釀造的糖化、發酵、酒化與生香劑,大曲培養過程中富集的環境微生物是白酒釀造微生物的重要來源;同時,大曲質量對白酒的出酒率及品質具有重要影響[1-2]。微生物群落結構對大曲質量及原酒的風格和品質具有重要影響,研究大曲微生物及其與質量指標的關聯,對明確白酒風格特點具有重要意義。大曲微生物主要包括細菌和真菌兩大類,其中真菌在釀酒過程的產酒、產酶、產香等方面起到重要作用[3]。近年來,采用高通量測序對大曲微生物進行了較多研究。如施思等[4]利用高通量測序對濃香型大曲貯藏階段的真菌多樣性進行分析,結果表明貯藏階段大曲的真菌群落結構不斷變化,畢赤酵母屬、根霉屬和恒梗霉屬為最終的優勢菌群。關于大曲微生物群落結構與功能的研究也有報道,通過整合宏基因組學與宏蛋白質組學分析,并基于鑒定功能酶的物種注釋分析,有助于建立大曲微生物組與酶系的關聯[5]。如柳習月等[6]采用多組學解析醬香型大曲風味物質的形成,結果表明不同曲種中的微生物、酶和代謝產物之間存在相關性;其中,芽孢桿菌與糖化酶、蛋白酶和四甲基吡嗪等呈正相關。絲狀真菌為大曲提供糖化動力,并對大曲培養起到關鍵作用;同時,大曲中的霉菌代謝產生糖化酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等水解酶系,此類酶系對降解發酵原料和產生酒體風味物質具有重要貢獻[7]。

當前,關于大曲微生物結構及其與質量指標的關聯性研究逐漸增多[8-9]。如李丹宇[10]研究發現在制曲過程中,大曲的糖化力、液化力和蛋白分解力等指標與大曲中的真菌數量和種類呈正相關。然而,關于不同產區濃香型大曲的真菌群落結構及其與質量指標的關聯研究還鮮有報道,尤其是曲皮及曲心的真菌群落結構與質量指標的關聯分析較少。本實驗通過高通量測序解析不同產區濃香型大曲的真菌群落結構,并與大曲質量指標進行關聯分析,旨在為解析濃香型大曲的糖化生香機理及篩選優良釀造功能微生物提供依據,同時對大曲微生物組信息擴充具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲樣品均為培養成熟剛入庫貯存的濃香型大曲,分別取自四川宜賓(YB)、四川瀘州(LZ)、山東濟寧(JN)、安徽阜陽(FY)、安徽亳州(BZ)和安徽臨泉(LQ)等地區。

氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉(均為分析純),天津市永大化學試劑有限公司;飽和酚、十二烷基硫酸鈉、乙二胺四乙酸-Na2、十六烷基三甲基溴化銨(cetrimonium bromide,CTAB)(均為分析純),北京索萊寶科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷(分析純),美國Sigma-Aldrich公司;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒,美國QIAGEN公司。

1.2 儀器與設備

TGL-20M高速冷凍離心機、超低溫冰箱,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;GeneAmp@9700型聚合酶鏈式反應PCPO儀,美國ABI公司;MX.S型可調式混勻儀,美國SCILOGEX公司;QuantiFluor型-ST藍色熒光定量系統,美國Promega公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 取樣方法

分別取大曲表層1～2 cm的曲料作為曲皮樣品(S組),取曲塊中心2～3 cm3區域的曲料作為曲心樣品(I組),隨機取3個平行樣本,再分別平均分為2份;其中1份在無菌環境下將每個曲樣的3個平行樣品分別單獨等量混合粉碎后,保存于無菌袋中,置于-80 ℃冰箱準備真菌群落結構分析;另1份將每個曲樣的3個平行樣品分別單獨等量混合粉碎后,保存于普通樣品袋中,置于4 ℃冰箱準備進行質量指標檢測。

1.3.2 大曲真菌群落結構分析

大曲微生物DNA提取:采用改良的CTAB法[11]提取大曲微生物總DNA,最后向離心管中加入 200 μL 無菌雙蒸水使DNA沉淀溶解,并貯于-20 ℃冰箱備用,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增定量:以稀釋后的基因組DNA為模板,選擇測序區域并使用帶Barcode的特異引物(Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer:New England Biolabs)和高效高保真酶進行PCR,以確保擴增效率和準確性;引物對應區域:ITS1區引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)。

PCR產物的混樣和純化:使用20 g/L的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測;對檢測合格的PCR產物進行磁珠純化,采用酶標定量并根據PCR產物濃度進行等量混樣,充分混勻后使用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物,對目的條帶使用凝膠回收試劑盒回收產物。

文庫構建和上機測試:采用TruSeq?DNA PCR- Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量,文庫合格后使用NovaSeq6000進行上機測序。建庫與測序在蘇州帕諾米克生物醫藥科技有限公司完成。

數據統計與繪圖:高通量測序完成后,進行數據分析與序列優化[12]。根據序列的相似性,將序列相似性大于等于97%分歸為同一操作分類單元(opera- tional taxonomic units,OTU),將所有序列與Silva庫(版本SILVA_138.1)比對得到序列的分類學信息;構建稀釋曲線和Shannon曲線,判斷取樣的合理性和測序量、測序深度的有效性;利用生信云平臺、R語言和AI作圖工具繪制稀釋曲線和堆積柱狀圖等[13]。

1.3.3 大曲質量指標檢測

參照輕工行業大曲質量標準(QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》)的相關方法,分別檢測各樣品的水分、酸度、淀粉和還原糖等理化指標,以及發酵力、糖化力和酯化力等生化指標;其中,酯化力的測定采用酯化72 h作為反應時間,其單位是mg/(g·72 h);各樣品的質量指標均分別檢測3次取平均值。

1.4 大曲真菌群落結構與質量指標的Spearman相關性分析

利用SPSS軟件對曲皮與曲心中的優勢真菌屬(相對豐度≥1%)及其質量指標進行Spearman相關性分析,以分析兩者之間的關聯性。

2 結果與分析

2.1 大曲真菌多樣性分析

2.1.1 序列統計與有效性分析

對各樣品的DNA進行測序,測序序列經質控過濾后分別得到71 295～91 030條真菌的有效序列,其平均長度為217～269 bp,聚類分析共產生3 379個OTU分類。稀釋曲線通常用來比較測序數據量及物種豐富度,當曲線趨向平緩時,更多的數據量只會產生少量新的OTU,反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU[14]。由本實驗的稀釋曲線和Shannon曲線以及表1可知,覆蓋率在99%相似度的OTU水平進行Chao1指數計算以估計物種總數,隨著測序深度的增加,Chao1指數曲線逐步趨于平緩,表明本次實驗的取樣合理,結果能代表樣本的真實情況。

2.1.2 Alpha多樣性分析

通過樣品的微生物多樣性分析(Alpha多樣性),可以反映微生物群落的豐度和多樣性[15]。由表1可知,12個樣品的覆蓋率均大于0.999,表明各樣品文庫的覆蓋率較高,樣品序列基本被完全測出,本測序結果可靠。Shannon指數和Simpson指數均能表現出樣品中物種的豐富度、均勻度及多樣性。由表1可知,JNS的Shannon指數和Simpson指數均高于其他樣品,表明JNS中的物種豐富度、均勻度及多樣性均最高。Ace指數用于計算群落豐度,其值越大說明樣品中微生物的豐度越高,由表1的Ace指數可知,BZS的群落豐度高于其他樣品。Chao1指數能估算樣品中的物種數目(即OTU數目),由表1的Chao1指數可知,BZS和JNI的物種總數在對應樣品組中均高于其他樣品。

表1 不同大曲樣品真菌Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity index of fungal in different Daqu samples

2.1.3 OTU分布的Venn分析

對獲取的OTU進行統計分類,并對樣品之間相對共有及獨有的OTU數進行疊加,得到OTU分布Venn圖,以比較OTU數目組成相似性及重疊情況[16]。如圖1所示,S組的真菌OTU總數為651個,共有OTU數為43個,占OTU總數的6.6%;BZS的OTU數為150個,占OTU總數的6.6%。I組的真菌OTU總數為719個,共有OTU數為47個,占OTU總數的6.5%;LQI的OTU數為175個,占OTU總數的24.34%;JNI的OTU數為94個,占OTU總數的13.07%,LQI和JNI的OTU數占比均較高。

對S組而言,43個共有OTU數占FYS總OTU數的45.57%,其占比在S組中最高;43個共有OTU數占BZS總OTU數的28.67%,其占比在S組中最低。對I組而言,47個共有OTU數占BZI總OTU數的54.02%,其占比在I組中最高;47個共有OTU數占LQI總OTU數的26.86%,其占比在I組中最低。綜上表明,FYS和BZI在對應樣品組中的真菌多樣性最高,BZS和LQI在對應樣品組中的真菌多樣性最低,也可以反映出不同地區的大曲真菌群落結構具有差異性。

a-曲皮樣品(S組);b-曲心樣品(I組)圖1 不同大曲樣品真菌OTU的差異性(花瓣圖)Fig.1 OTU variability of fungal in different Daqu samples(petal diagram)

2.2 大曲真菌群落結構分析

2.2.1 大曲微生物真菌門的分類

將各類OTU的代表序列與Unite的真菌數據庫進行比對,得到每個OTU在不同分類水平的物種分類信息。如圖2-a所示,S組和I組的真菌組成均可歸為子囊菌門(Ascomycota)、毛霉菌門(Mucoromycota)和擔子菌門(Basidiomycota)等3個菌門,其在S組的占比分別為52.52%、41.6%和0.6%,在I組的占比分別為87.41%、9.2%和0.9%;其中,兩個樣品組的優勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota),其豐度均在50%以上,同時子囊菌門(Ascomycota)在I組中占有絕對優勢。張會敏等[17]利用ITS rDNA克隆文庫法分析古井貢酒大曲(中溫大曲)的真核群落結構,結果表明中溫大曲的真菌組成可歸子囊菌門(Ascomycota)、毛霉亞門(Mucoromycota)和擔子菌門(Basidiomycota)等3個菌門,該研究結果與本實驗的結果相似。

此外,如圖2-b所示,在S組中,BZS和LQS中毛霉菌門(Mucoromycota)的占比分別為5.46%和7.21%,低于其他曲皮樣品;而BZS和LQS中的子囊菌門(Ascomycota)占比分別為90.94%和82.45%,明顯高于其他曲皮樣。在I組中,LQI中子囊菌門(Ascomycota)的占比為63.3%,明顯低于其他曲心樣品;而LQI中毛霉菌門(Mucoromycota)的占比為44.48%,明顯高于其他曲心樣品。

a-不同樣品組;b-不同樣品圖2 不同大曲樣品真菌門水平的相對豐度柱狀圖Fig.2 Column chart of relative abundance at fungal phyla level in different Daqu samples

2.2.2 大曲微生物真菌屬的分類

如圖3-a所示,S組中總體豐度較高的有根霉屬(Rhizopus,19.91%)、根毛霉屬(Rhizomucor,19.4%)、布氏白粉菌屬(Blumeria,17.57%)和散囊菌屬(Eurotium,12.8%),其中根霉屬(Rhizopus)的占比最高;I組中總體豐度較高的有嗜熱真菌屬(Thermomyces,26.04%)、散囊菌屬(Eurotium,21.69%)和嗜熱子囊菌屬(Thermoascus,19.37%),其中嗜熱真菌屬(Thermomyces)的占比最高。綜上可知,S組中的霉菌占比較高,霉菌分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等實現對制曲原料中大分子物質的降解,為其他微生物的生長提供可利用的小分子營養物質[18]。嗜熱真菌屬(Thermomyces)在I組中的占比明顯高于S組,這可能是因為濃香型大曲培曲過程中的最高品溫一般在50 ℃以上,且曲心的溫度普遍高于曲皮的溫度,而大多數真菌的最適生長溫度在20～30 ℃左右,致死溫度在50～60 ℃左右;同時,溫度是影響大曲微生物菌群形成的內源性動力[19];因此,部分耐熱和嗜熱真菌屬可以在曲心中存活。

此外,酵母菌屬(Saccharomyces)在S組和I組中的占比分別為0.36%和0.05%,S組中酵母菌屬(Saccharomyces)的占比明顯高于I組,這可能與培曲過程中曲皮與曲心的溫度差異有關;同時,培曲過程中曲皮與曲心在濕度、通風及含氧等方面均存在差異,也是導致酵母菌屬(Saccharomyces)占比差異的重要因素。制曲過程可以富集釀酒酵母和生香酵母等多種類型的酵母菌,在白酒發酵過程中酵母菌代謝產生醇類和酯類等風味物質,酵母類群對白酒發酵具有重要作用[20]。

如圖3-b所示,對S組而言,FYS中的根霉屬(Rhizopus,62.77%)占比最高,其次是YBS中的根霉屬(Rhizopus,24.2%)和JNS中的根霉屬(Rhizopus,21.02%),這可能與阜陽地區大曲(LZ)的培曲溫度低于其他5個地區有關,其溫度適宜于根霉屬(Rhi-zopus)等真菌的生長。根霉屬(Rhizopus)具有重要的工業應用,如米根霉(R.oryzae)代謝產生的淀粉酶可用于制曲與釀酒,華根霉(R.chinensis)和少根根霉(R.arrhizus)等可代謝產生乳酸,匐枝根霉(R.stoloni-fer)還能轉化甾族化合物,也可應用于甾體激素、延胡索酸和酶制劑的生產[21]。

值得注意的是,根毛霉屬(Rhizomucor)在LZS、YBS和JNS中的占比分別是55.5%、48.86%和11.78%,高于其他曲皮樣品。對I組而言,LZI中的嗜熱真菌屬(Thermomyces,86.66%)占比最高,其次是FYI中的嗜熱真菌屬(Thermomyces,44.61%)和BZI中的嗜熱真菌屬(Thermomyces,17.38%)。曲心中嗜熱真菌屬(Thermomyces)占比的差異可能是由于不同產區大曲的培曲過程中曲心頂溫的差異,進而對嗜熱真菌屬(Thermomyces)的生長產生不同影響。同樣,LZS中嗜熱真菌屬(Thermomyces,7.86%)的占比在S組中最高;因此,可以推斷瀘州地區大曲(LZ)的培曲溫度高于其他5個地區。夏玙等[22]采用高通量測序分析瀘州某企業大曲的真菌群落結構,結果表明嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、曲霉菌屬(Aspergillus)等霉菌是大曲中的優勢真菌類群,這與本實驗的結果相似。

此外,酵母菌屬(Saccharomyces)在FYS中的占比達到17.1%,而在JNS和BZS中的占比分別為2.12%和2.01%,在其他曲皮樣品中的占比均低于1.00%;同時,酵母菌屬(Saccharomyces)在LQI中的占比達到1.83%,而在其他曲心樣品中占比均低于1.00%。綜上可知,酵母菌屬(Saccharomyces)在FYS中的占比明顯高于其他樣品,這可能與阜陽地區的曲樣(FY)采用強化制曲工藝有關,其原因還有待于進一步分析。地域環境、制曲工藝和培曲環境等是造成釀酒微生物群落結構差異的重要原因[23-24],綜上可知,不同地區濃香型大曲曲皮中的優勢菌屬為根霉屬,曲心中的優勢菌屬為嗜熱真菌屬;同時,可以推斷濃香型大曲培曲溫度的控制和選擇對大曲真菌群落結構具有重要影響。

a-不同樣品組;b-不同樣品圖3 不同大曲樣品真菌屬水平的相對豐度柱狀圖Fig.3 Column chart of relative abundance at fungal genus level in different Daqu samples

2.3 大曲質量指標分析

酒曲微生物代謝產生豐富的酶類,對白酒發酵過程的糖化和風味代謝具有重要影響[25]。大曲的水分、酸度等理化指標在一定程度上能夠反映大曲的質量;同時,大曲的糖化力、酯化力等生化指標反映了大曲酶系的功能組成及微生物的生長代謝情況,也可作為大曲質量評價的重要依據。如表2所示,曲心樣品的水分、酸度、還原糖和酯化力均普遍高于曲皮樣品,曲皮樣品的淀粉、發酵力和糖化力均普遍高于曲心樣品。

糖化力反映了大曲中糖化酶的酶活力,其主要由霉菌和芽孢桿菌產生,研究表明絲狀真菌能夠提高大曲的糖化力[26]。由表2可知,JNS的糖化力最高[972 mg/(g·h)],可以推測JNS中絲狀真菌的豐度占比可能也較高。由圖3可知,JNS中的根霉屬(Rhizopus)和根毛霉屬(Rhizomucor)占比分別為21.02%和11.78%,其豐度占比均較高。酯化力反映了大曲中酯化酶催化酸類和醇類生成酯類物質的能力,發酵力則體現了大曲微生物發酵產酒的能力。由表2可知,BZI的發酵力和酯化力均最高,分別為0.22 U和13 mg/(g·72 h);FYS的發酵力和酯化力分別為0.21U和12 mg/(g·72 h),均處于較高水平,這可能與FYS中的酵母菌屬(Saccharo-myces,17.1%)占比明顯高于其他樣品有關。綜上可知,不同地區大曲的真菌群落組成與質量指標均存在差異。

表2 不同大曲樣品質量指標的檢測結果Table 2 Detection results of quality indicators of different Daqu samples

2.4 大曲真菌群落結構與質量指標的關聯分析

濃香型大曲培養過程中,其曲皮和曲心的微環境差異是導致微生物群落結構差異的重要原因,如曲心的溫度高于曲皮可能導致嗜熱菌在曲心中更具優勢;同樣,微生物的群落代謝也會影響環境因子,如水分、酸度、淀粉和還原糖等;同時,大曲的發酵力、糖化力和酯化力等生化指標也受到微生物群落代謝的影響。為解析大曲質量指標與真菌群落結構的關聯,利用SPSS軟件對曲皮與曲心的優勢真菌屬(相對豐度≥1%)及質量指標進行Spearman相關性分析(圖4),采用Spearman秩相關研究質量指標與物種豐富度(Alpha多樣性)之間的關系,得到兩者之間的相關性和顯著性P值[27]。

M-水分;A-酸度;S1-淀粉;Rs-還原糖;Fa-發酵力;Sa-糖化力;Ea-酯化力圖4 基于屬水平的大曲真菌群落結構與質量指標的Spearman相關性分析Fig.4 Spearman correlation analysis of fungal community structure and physicochemical indexes based on genus level注:縱向為環境因子信息,橫向為物種信息,熱圖對應的值為Spearman相關系數r,-10為正相關;*表示顯著性檢驗P<0.05,**表示顯著性檢驗P<0.01

由圖4可知,嗜熱真菌屬(Thermomyces)與水分呈極顯著正相關,被孢霉屬(Mortierella)與還原糖呈極顯著正相關,根霉屬(Rhizopus)、匍柄霉屬(Stem-phylium)和鏈格孢屬(Alternaria)與糖化力呈顯著正相關,羅薩氏菌屬(Rasamsonia)與酯化力呈極顯著正相關。值得關注的是與質量指標呈負相關的真菌群落,如根霉屬(Rhizopus)與水分呈顯著負相關,匍柄霉屬(Stemphylium)與酸度呈顯著負相關,羅薩氏菌屬(Rasamsonia)與淀粉呈顯著負相關,克魯維酵母屬(Kluyveromyces)與還原糖呈顯著負相關,曲霉屬(As-peigillus)與發酵力呈顯著負相關,根霉屬(Rhizopus)、酵母菌屬(Saccharomyces)、盤菌屬(Peziza)和牛肝菌屬(Retiboletus)與酯化力呈顯著負相關。確定與大曲質量指標相關性顯著的真菌菌屬,并通過篩選純化等技術獲得單菌株,再應用于強化制曲過程中,對提高大曲質量具有重要意義,這也是未來的研究方向。

3 結論

本實驗通過高通量測序解析不同地區濃香型大曲中的真菌群落結構,并采用Spearman相關性分析真菌群落結構及其與質量指標的關聯,得到的結論有:(1)不同地區濃香型大曲的曲皮共有真菌OTU為43個、曲心共有真菌OTU為47個,曲皮主要真菌類群為子囊菌門(Ascomycota,52.52%),毛霉菌門(Mu- coromycota,41.60%),曲心主要真菌類群為子囊菌門(Ascomycota,87.41%);其中,曲皮中的根霉屬(Rhi-zopus)、根毛霉屬(Rhizomucor)、布氏白粉菌屬(Blumeria)和散囊菌屬(Eurotium)為優勢菌屬,曲心中的嗜熱真菌屬(Thermomyces),散囊菌屬(Euroti-um)和嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)為優勢菌屬,其豐度均在10%以上;(2)質量指標與真菌群落的Spearman相關性分析表明,嗜熱真菌屬(Thermomy-ces)與水分呈極顯著正相關,被孢霉屬(Mortierella)與還原糖呈極顯著正相關,根霉屬(Rhizopus)、匍柄霉屬(Stemphylium)和鏈格孢屬(Alternaria)與糖化力呈顯著正相關,羅薩氏菌屬(Rasamsonia)與酯化力呈極顯著正相關。本研究為進一步解析濃香型大曲的糖化生香機理及篩選優良釀造功能微生物提供依據,同時對大曲微生物組信息擴充具有一定的參考價值。