乳糖醇調(diào)節(jié)液態(tài)發(fā)酵紅曲菌生長(zhǎng)及莫納可林K代謝的研究

許世錦，胡文林,陳羅華周,聶增宇,陳玲娟

(廣東天益生物科技有限公司,廣東 湛江,524300)

1979 年日本學(xué)者遠(yuǎn)滕章(AKIRA ENDO)教授發(fā)現(xiàn)紅曲霉(Monascusruber)能產(chǎn)生強(qiáng)力抑制膽固醇合成的活性物質(zhì),將其命名為莫納可林K(Monacolin K,MK)[1]。1985 年又相繼分離到Monacolin L、X、J、Dihydroerinolin和Dihydromonalin L 等類(lèi)似物,它們都具有相同的基本結(jié)構(gòu)(L 是J 的前驅(qū)物,J 是K 的前驅(qū)物),同時(shí)又都具有很強(qiáng)的降低膽固醇的作用[2]。其中,紅曲中的MK 作用最強(qiáng),能高效地抑制膽固醇合成中的關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A,HMG-CoA)還原酶的活性,進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂水平[3]。

目前,國(guó)內(nèi)MK 的生產(chǎn)全部以大米為碳源、采用塑料三角瓶固態(tài)發(fā)酵方式生產(chǎn)。與傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵法相比,液態(tài)發(fā)酵法具有規(guī)模大、自動(dòng)化程度高、人力成本低及生產(chǎn)過(guò)程中可以控制雜菌污染的顯著優(yōu)點(diǎn)。據(jù)報(bào)道以乳糖為碳源的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)127 mg/L 的MK,為國(guó)外紅曲菌液態(tài)發(fā)酵MK 的最高產(chǎn)量[4]。甘油作為常用碳源之一,對(duì)紅曲菌生長(zhǎng)和代謝有著重要作用,且能大幅提高合成MK 基因的轉(zhuǎn)錄水平[5]。目前國(guó)內(nèi)采用甘油與葡萄糖或米粉作混合碳源的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK 的研究,進(jìn)展顯著[6-8],尤其當(dāng)甘油與淀粉[m(甘油)∶m(淀粉)=3∶1]為混合碳源的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK可達(dá)1 302 mg/L[9],但以采用純甘油為碳源的搖瓶與15 L小型發(fā)酵罐液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK的產(chǎn)量最高,分別為1 600、888.9 mg/L[10]。另外,在甘油與淀粉為混合碳源的培養(yǎng)基中,再添加非離子表面活性劑對(duì)MK產(chǎn)量的提高效果更為明顯[11],尤其是添加非離子表面活性劑Triton X-100,液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)MK可達(dá)到 2 026.0 mg/L[12],效果極顯著。上述液態(tài)發(fā)酵技術(shù)中,甘油作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用于食品、保健品、藥品作為原料的MK 制品,不符合GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》和QB/T 2847—2007《國(guó)家輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 功能性紅曲米(粉)》,無(wú)法量產(chǎn)。非離子表面活性劑Triton X-100雖可大幅提高M(jìn)K的產(chǎn)能,但具有毒性,且紅曲菌無(wú)法利用,其在產(chǎn)品中的殘留物的清除方法及其對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響等方面尚需深入的理論研究。由于采用大米淀粉作為碳源利于產(chǎn)色素,而不利于產(chǎn)MK[13],產(chǎn)MK值不足100 mg/L,無(wú)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前尚未見(jiàn)采用符合GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》和QB/T 2847—2007《國(guó)家輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 功能性紅曲米(粉)》的原料作為碳源進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)MK的相關(guān)報(bào)道。

基于此,本文擬研究糖醇對(duì)紅曲菌TY02生長(zhǎng)與代謝的影響,探討糖醇對(duì)紅曲菌TY02的MK代謝調(diào)控機(jī)理,以期為谷物淀粉等物質(zhì)作為碳源、且符合GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》和QB/T 2847—2007《國(guó)家輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 功能性紅曲米(粉)》的原料進(jìn)行的液態(tài)發(fā)酵大幅提高紅曲菌MK的代謝能力、突破液態(tài)發(fā)酵低產(chǎn)MK的技術(shù)瓶頸、實(shí)現(xiàn)功能紅曲液態(tài)發(fā)酵量產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

紫色紅曲菌TY02(MonascuspurpureusTY02)為廣東天益生物科技有限公司保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏編號(hào)為CCTCC M2018586的保藏菌株。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

HWY-2112型雙層恒溫培養(yǎng)搖床,上海智城分析儀器制造有限公司;LC-20AD高效液相色譜儀、SPD-20A紫外分光檢測(cè)器，日本島津儀器有限公司;SW-CJ-1FD型超凈化工作臺(tái),蘇州凈化器設(shè)備有限公司;LS- B50L型立式蒸汽滅菌鍋,上海醫(yī)用核子儀器廠(chǎng);LXJ-ⅡB型低速大容量多管離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);DHG-9140A型鼓風(fēng)干燥箱、HWS-28型電熱恒溫水浴鍋、LRH-150型生化培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司;B2200S型超聲波清洗器,必能信超聲(上海)有限公司;MP502B型電子天平,上海精密實(shí)驗(yàn)器材有限公司

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:12 °Bx麥芽汁培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖60,蛋白胨25,玉米漿10,NaNO32,MgSO4·7H2O 1,K2HPO4·3H2O 1.5,pH值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):黏米粉120,大豆水解液40,玉米漿5,NaNO33.5,MgSO4·7H2O 1.5,K2HPO4·3H2O 2.5,pH 4.5。

1.3 培養(yǎng)條件及方法

斜面培養(yǎng):挑取1環(huán)菌種接種于斜面培養(yǎng)基中,在30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)斜面。

種子液培養(yǎng):用10 mL無(wú)菌水洗滌試管斜面孢子,接種至含有100 mL種子液培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,在30 ℃ 200 r/min的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48 h。

液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):將種子液按12%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,在30 ℃ 180 r/min的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng) 3 d,然后于24～25 ℃發(fā)酵至22 d。

1.4 分析方法

菌體量的測(cè)定:菌體量采用干重法測(cè)定。取發(fā)酵液,用3 層紗布過(guò)濾,蒸餾水洗滌2～3 次,擰干,在60 ℃ 烘箱中烘干至恒重。菌體量[生物量(dry cell weight,DCW)]的計(jì)算如公式(1)[14]所示:

(1)

MK的測(cè)定按QB/T 2847—2007《國(guó)家輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 功能性紅曲米(粉)》執(zhí)行:發(fā)酵液的預(yù)處理。稱(chēng)取發(fā)酵液或發(fā)酵液濾液5 g,加入35 mL 75%(體積分?jǐn)?shù))分析純乙醇,超聲波萃取50 min,然后再加入適量的75%分析純乙醇,再超聲波萃取10 min,冷卻,定容至50 mL,離心分離10 min(3 500 r/min),然后用0.45 μm的有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾,濾液用于測(cè)定MK,測(cè)定的MK為總MK。胞外MK的測(cè)定是以發(fā)酵醪液經(jīng)濾紙過(guò)濾后的濾液為樣品,樣品預(yù)處理方法和測(cè)定方法與總MK的測(cè)定相同。

色譜條件:色譜柱:C18柱(250 mm×4.6 mm),柱溫20～25 ℃,紫外檢測(cè)器:238 nm檢測(cè)波長(zhǎng),流動(dòng)相:V(甲醇)∶V(水)∶V(磷酸)=385∶115∶0.14,流速為1.0 mL/min,進(jìn)料量為20 μL。

桔青霉素的測(cè)定:按GB 5009.222—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中桔青霉素的測(cè)定》中的第一法執(zhí)行。

乳糖醇的測(cè)定:按GB 1886.98—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 乳糖醇 (又名4-β-D吡喃半乳糖-D-山梨醇)》執(zhí)行。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM SPSS?Statistics 20(NY,USA)對(duì)不同糖醇添加條件下菌絲體生物量和MK產(chǎn)率進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA),組間比較采用最小顯著差法(least significant difference,LSD)方法。每組的樣本量為20,顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖醇種類(lèi)及部分對(duì)應(yīng)糖對(duì)紫色紅曲菌TY02生長(zhǎng)和MK代謝的影響

以1.2培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)基為基本發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)分別添加30 g/L麥芽糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤蘚糖醇、乳糖醇、異麥芽糖醇、木糖、麥芽糖、乳糖,按照1.3的方法進(jìn)行培養(yǎng),菌體DCW、MK質(zhì)量濃度與糖醇種類(lèi)及部分相應(yīng)糖的關(guān)系如圖1所示。

a-糖醇;b-糖以及對(duì)應(yīng)的糖醇圖1 糖醇和糖種類(lèi)對(duì)紫色紅曲菌TY02菌絲體DCW和MK產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of sugars and sugar alcohols on the mycelial biomass DCW and MK yield of Monascus purpureus TY02注:a～f,*a～*g不同標(biāo)記字母分別表示菌絲體DCW和MK產(chǎn)率在不同糖醇種類(lèi)添加下組間差異顯著(P<0.05)

由圖1-a可知,在不同種類(lèi)糖醇添加的條件下,紫色紅曲菌TY02的生長(zhǎng)與MK代謝均呈正增長(zhǎng),菌體DCW與產(chǎn)MK呈正相關(guān)的關(guān)系。其中,添加木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇效果較佳,尤以添加乳糖醇效果最佳,菌體DCW與MK質(zhì)量濃度分別為45.96、48.83、52.65 g/L和291、482、665 mg/L,分別為對(duì)照組(DCW 33.08 g/L、MK 75 mg/L)的1.39、1.48、1.59倍和3.88、6.43、8.87倍(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)表明紫色紅曲菌TY02能夠利用糖醇作為碳源,糖醇對(duì)菌體生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[15],同時(shí)能顯著提高M(jìn)K 的代謝能力。

由圖1-b可知,不同種類(lèi)的糖和對(duì)應(yīng)的糖醇均能顯著促進(jìn)紫色紅曲菌TY02的菌體生長(zhǎng),但添加糖類(lèi)的菌體DCW均高于對(duì)應(yīng)的糖醇,這說(shuō)明紫色紅曲菌TY02優(yōu)先利用糖類(lèi)作為碳源。與對(duì)照組相比,糖類(lèi)雖能顯著促進(jìn)紫色紅曲菌TY02的生長(zhǎng),但其產(chǎn)MK能力明顯不足,這表明代謝過(guò)程中產(chǎn)生的葡萄糖可顯著地抑制紅曲菌TY02的MK代謝[16]。實(shí)驗(yàn)表明,相對(duì)于添加糖類(lèi),糖醇更能促進(jìn)紫色紅曲菌TY02合成MK,因此可推測(cè),糖醇既可作碳源,還影響紫色紅曲菌TY02的MK代謝途徑。

2.2 乳糖醇添加量及添加時(shí)間對(duì)紫色紅曲菌TY02生長(zhǎng)和MK代謝的影響

以1.2培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)基為基本發(fā)酵培養(yǎng)基,分別在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加20、40、60、80、100、120 g/L乳糖醇,以及在發(fā)酵0、2、4、6、8、10、12 d分別添加80 g/L乳糖醇,按照1.3的方法進(jìn)行培養(yǎng),菌體DCW、MK質(zhì)量濃度與乳糖醇質(zhì)量濃度和添加時(shí)間的關(guān)系如圖2所示。

a-DCW和MK質(zhì)量濃度;b-DCW和MK質(zhì)量濃度圖2 乳糖醇添加量及添加時(shí)間對(duì)紫色紅曲菌TY02DCW和MK產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of lactitol concentration and addition time on the mycelial biomass DCW and MK yield of Monascus purpureus TY02

由圖2-a可知,紫色紅曲菌TY02的菌體DCW與乳糖醇的濃度呈正相關(guān)的關(guān)系,產(chǎn)MK的質(zhì)量濃度隨著乳糖醇濃度的增加而增加,至乳糖醇質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí),MK達(dá)極值。此時(shí)DCW為60.92 g/L,MK為1 018 mg/L,分別為對(duì)照組(乳糖醇添加量為0 g/L)(DCW 33.47 g/L、MK 78 mg/L)的1.82倍和13.05倍,此后隨著乳糖醇濃度的進(jìn)一步提高,MK呈遞減趨勢(shì)。

實(shí)驗(yàn)表明,添加過(guò)多的糖醇,紫色紅曲菌TY02會(huì)趨向菌體生長(zhǎng),而不利于合成MK,這可能是碳氮比過(guò)高會(huì)導(dǎo)致紫色紅曲菌TY02將更多的能量用于菌體生長(zhǎng)[17]。上述結(jié)果表明,紅曲菌發(fā)酵過(guò)程中添加適量的乳糖醇極利于MK的合成,乳糖醇添加的最佳質(zhì)量濃度為80 g/L,這與文獻(xiàn)報(bào)道的以甘油為碳源的發(fā)酵產(chǎn)MK類(lèi)似[18]。

由圖2-b可知,在不同的發(fā)酵時(shí)間添加乳糖醇對(duì)紫色紅曲菌TY02的菌體生長(zhǎng)與MK代謝的影響程度各不相同。與對(duì)照組相比,菌體DCW均呈正增長(zhǎng),MK產(chǎn)量均得到提高,兩者均為正效應(yīng),兩者均在0 d添加最大,此時(shí)DCW為61.21 g/L、MK為1 023 mg/L,分別為對(duì)照組DCW 33.81 g/L、MK 76 mg/L的1.81倍和13.46倍。乳糖醇最佳的添加時(shí)間節(jié)點(diǎn)為發(fā)酵初始時(shí)間(0 d),這與文獻(xiàn)報(bào)道的紅曲黃色素發(fā)酵類(lèi)似[19]。

2.3 乳糖醇對(duì)總MK、胞外MK、開(kāi)環(huán)MK代謝的影響

以1.2培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)基為基本發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加80 g/L乳糖醇,以及在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)分別添加0、20、40、60、80、100、120 g/L乳糖醇,按照1.3的方法進(jìn)行培養(yǎng),總MK質(zhì)量濃度、胞外MK質(zhì)量濃度、胞外MK占比與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系和開(kāi)環(huán)MK占比與乳糖醇添加量的關(guān)系如圖3所示。

a-總MK、胞外MK、胞外MK占比;b-開(kāi)環(huán)MK占比圖3 紫色紅曲菌TY02發(fā)酵過(guò)程中總MK產(chǎn)量、胞外MK產(chǎn)量以及胞外MK比例的變化及乳糖醇添加量對(duì)開(kāi)環(huán)MK比例的影響Fig.3 Changes of yields of total MK and extracellular MK,as well as the ratio of extracellular MK during fermentation,and effects of lactitol additives on the ratio of open-loop MK in the broth of Monascus purpureus TY02

由圖3-a可知,紫色紅曲菌TY02在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加0 g/L乳糖醇,其代謝的總MK、胞外MK、胞外MK占比的走勢(shì)基本上一致,表現(xiàn)為隨著發(fā)酵時(shí)間的增加而遞增,發(fā)酵至22 d,上述三者均達(dá)最大值,此時(shí)總MK、胞外MK、胞外MK占比分別為87、37 mg/L和42.53%。在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加80 g/L乳糖醇,產(chǎn)總MK的走勢(shì)與前者相似,但胞外MK、胞外MK占比與對(duì)照組明顯不同。其中胞外MK方面:在8～16 d即發(fā)酵前、中期時(shí)的MK產(chǎn)率增長(zhǎng)顯著,至16 d開(kāi)始放緩,產(chǎn)率達(dá)極大值,發(fā)酵后期MK產(chǎn)率漸趨平穩(wěn)并逐步下降,至發(fā)酵20 d,胞外MK達(dá)極值780 mg/L。胞外MK占比方面:在發(fā)酵的前、中期時(shí)其走勢(shì)為隨發(fā)酵時(shí)間的增加而遞增,至16 d達(dá)極大值,此時(shí)胞外MK占比為86.71%,為對(duì)照組同期(35%)的2.48倍,此后隨發(fā)酵時(shí)間的增加而呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵至22 d,總MK達(dá)極值,其總MK、胞外MK、胞外MK占比分別為1 031、754 mg/L和73.13%,分別為對(duì)照組的11.85倍、20.38倍和1.72倍?？梢?jiàn)發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加80 g/L乳糖醇能大幅提高紫色紅曲菌TY02的MK產(chǎn)量與胞外MK占比,這與文獻(xiàn)報(bào)道的紅曲霉產(chǎn)黃色素的發(fā)酵相類(lèi)似[19]。胞外MK占比的大幅提高,乳糖醇可能類(lèi)似于甘油通過(guò)影響脂肪酸的組成從而增加細(xì)胞膜的通透性,進(jìn)而有利于代謝產(chǎn)物外排[20-21]。

MK分為內(nèi)酯型和酸型兩種結(jié)構(gòu),在一定的條件下兩者可以轉(zhuǎn)換[22]。由圖3-b可知,發(fā)酵液中開(kāi)環(huán)MK占比隨著乳糖醇濃度的增加,呈現(xiàn)快速遞增趨勢(shì),至乳糖醇添加量為80 g/L時(shí)開(kāi)始放緩,此時(shí)開(kāi)環(huán)MK占比為98.56%,為對(duì)照實(shí)驗(yàn)開(kāi)環(huán)MK占比25.33%的3.89倍,此后隨著乳糖醇濃度的進(jìn)一步提高,開(kāi)環(huán)MK占比漸趨平穩(wěn),維持在98%～99%。這說(shuō)明,乳糖醇能大幅提高紫色紅曲菌TY02的開(kāi)環(huán)MK的合成比例,從而使生產(chǎn)水溶性的高開(kāi)環(huán)功能紅曲MK成為可能[23]。

2.4 乳糖醇添加量對(duì)乳糖醇?xì)埩艏敖矍嗝顾卮x的影響

以1.2培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)基為基本發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)分別添加0、20、40、60、80、100、120 g/L乳糖醇,按照1.3的方法進(jìn)行培養(yǎng),乳糖醇?xì)埩袅?、桔青霉素的質(zhì)量濃度與乳糖醇添加量的關(guān)系如圖4所示。

由圖4-a可知,發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中乳糖醇的殘留量隨著培養(yǎng)基中添加的乳糖醇濃度的增加而增加,殘留量變化范圍為0.17～5.83 g/L,符合GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》。紫色紅曲菌TY02對(duì)乳糖醇的利用率會(huì)隨著培養(yǎng)基中乳糖醇濃度的增加而逐漸降低,利用率變化趨勢(shì)為99.13%～95.14%。當(dāng)添加乳糖醇質(zhì)量濃度至80 g/L時(shí),乳糖醇利用率明顯下降,此時(shí)乳糖醇?xì)埩袅繛?.84 g/L,利用率為97.70%。實(shí)驗(yàn)表明,紫色紅曲菌TY02能夠適應(yīng)高滲透壓的培養(yǎng)基環(huán)境,在生長(zhǎng)與MK代謝過(guò)程中能較充分地利用乳糖醇。此外因過(guò)高的乳糖醇濃度利于長(zhǎng)菌而不利于產(chǎn)MK,同時(shí)會(huì)增加在發(fā)酵液中的殘留量,給后處理及產(chǎn)品質(zhì)量帶來(lái)隱患,故選擇乳糖醇的添加量為80 g/L較為合適,這與前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。

a-乳糖醇?xì)埩袅?b-桔青霉素質(zhì)量濃度圖4 乳糖醇添加量對(duì)乳糖醇?xì)埩袅考敖矍嗝顾睾康挠绊慒ig.4 Effects of amount of lactitol additive on content of residual lactitol and citrinin after fermentation

由圖4-b可知,發(fā)酵液中桔青霉素隨著乳糖醇濃度的增加,其質(zhì)量濃度由對(duì)照組的112 μg/kg呈快速遞減趨勢(shì),兩者呈負(fù)相關(guān)。當(dāng)乳糖醇添加量增至80 g/L時(shí),其含量?jī)H為6 μg/kg,此后隨著乳糖醇濃度的進(jìn)一步提高,桔青霉素含量無(wú)法檢出。實(shí)驗(yàn)表明,乳糖醇能抑制紫色紅曲菌TY02合成桔青霉素的酶系。

2.5 添加乳糖醇條件下紫色紅曲菌TY02發(fā)酵MK的收獲時(shí)間

以1.2培養(yǎng)基中的發(fā)酵培養(yǎng)基為基本發(fā)酵培養(yǎng)基,在發(fā)酵開(kāi)始時(shí)(0 d)添加80 g/L乳糖醇,按照1.3的方法進(jìn)行培養(yǎng),MK質(zhì)量濃度、pH值、菌體DCW與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖5所示。

由圖5-a可知,在發(fā)酵前期,pH不斷上升,至12 d時(shí)至最高,此時(shí)pH值為6.95,此后略有下降,并漸趨平穩(wěn),維持在6.7左右至發(fā)酵結(jié)束。當(dāng)pH<6.0時(shí)為菌體的生長(zhǎng)期,pH>6.0時(shí)為MK的合成期,8～16 d為菌體合成MK的高峰期,16 d時(shí)MK合成開(kāi)始放緩,此后MK合成漸趨平穩(wěn),至22 d時(shí)MK達(dá)極值1 031 mg/L。

a-pH值與MK質(zhì)量濃度;b-生物量DCW和MK質(zhì)量濃度圖5 發(fā)酵過(guò)程中MK質(zhì)量濃度、pH值、菌體生物量DCW的變化Fig.5 Changes of MK yields,pH values and mycelial biomass DCW during the fermentation

由圖5-b可知,在發(fā)酵前期,菌體快速增殖,至6 d時(shí),DCW由初始的11.86 g/L快速增長(zhǎng)至75.62 g/L,此后緩慢降低,至發(fā)酵結(jié)束降至59.87 g/L。當(dāng)DCW從72.41 g/L降至65.33 g/L(8～16 d)期間為MK合成的高峰期,在DCW降至65.33 g/L時(shí)(16 d)MK合成開(kāi)始放緩,此后MK合成漸趨平穩(wěn),至22 d時(shí)MK達(dá)最大值1 031 mg/L。從DCW與MK合成的關(guān)系圖可知功能紅曲液態(tài)發(fā)酵為典型的次級(jí)代謝,并且為高密度發(fā)酵。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明,乳糖醇對(duì)紫色紅曲菌TY02的生長(zhǎng)及MK代謝具有重大的影響。

研究發(fā)現(xiàn)該菌株在以黏米粉為碳源,在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加80 g/L乳糖醇的高滲透壓培養(yǎng)基中能夠進(jìn)行高密度發(fā)酵,菌體DCW可達(dá)75.62 g/L,能夠高效合成高開(kāi)環(huán)、高含量的MK,其中發(fā)酵液開(kāi)環(huán)MK占比可達(dá)98%,總MK可達(dá)1 031 mg/L,從而突破了以不含甘油成分的淀粉質(zhì)作為碳源、且符合QB/T 2847— 2007《國(guó)家輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 功能性紅曲米(粉)》與GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》的原料進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵低產(chǎn)MK的技術(shù)瓶頸,使生產(chǎn)水溶性的功能紅曲制品成為可能。研究還發(fā)現(xiàn),該菌株能高效利用乳糖醇作為碳源,在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加80 g/L乳糖醇,發(fā)酵22 d,經(jīng)檢測(cè)發(fā)酵液中乳糖醇的殘留量為1.84 g/L,符合GB 2760 —2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》,從而解決了乳糖醇?xì)埩袅窟^(guò)高會(huì)引起腹瀉的隱患;同時(shí)發(fā)現(xiàn),乳糖醇不僅可作為碳源,還可調(diào)節(jié)紫色紅曲菌TY02的MK代謝途徑。乳糖醇能夠抑制紫色紅曲菌TY02合成桔青霉素的酶系,在發(fā)酵初始時(shí)(0 d)添加80 g/L乳糖醇,發(fā)酵22 d,經(jīng)檢測(cè)發(fā)酵液中桔青霉素的質(zhì)量濃度由對(duì)照組的112 μg/kg降至6 μg/kg,符合QB/T 2847—2007《國(guó)家輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 功能性紅曲米(粉)》,從而保證了以后量產(chǎn)的產(chǎn)品質(zhì)量安全。本研究成果對(duì)突破當(dāng)前液態(tài)發(fā)酵功能紅曲的技術(shù)瓶頸,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)量產(chǎn),提供了理論參考和技術(shù)支持。受條件的限制,本研究未能采用實(shí)時(shí)熒光定量qPCR測(cè)定MK合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量,對(duì)乳糖醇影響紫色紅曲菌TY02產(chǎn)MK的機(jī)理未能進(jìn)行充分的解析。因此,研究糖醇促進(jìn)紅曲菌產(chǎn)MK的機(jī)理將是今后工作的重點(diǎn)。