基于實時熒光環介導等溫擴增技術同時檢測副溶血弧菌與金黃色葡萄球菌

劉丹,謝加玲,張孟雨,陳松,李孜,鐘青萍

(廣東省食品質量安全重點實驗室,華南農業大學 食品學院,廣東 廣州,510642)

近年來,食源性致病菌引發的食品安全問題在全球范圍內造成了相當大的公共衛生負擔,根據世界衛生組織2020年數據顯示,全球每年有5.5億人因食源性疾病引起腹瀉、嘔吐等,其中約23萬人導致死亡[1-2]。據統計,超過70%的食源性疾病都是由食源性致病菌引起的,而其中又以細菌引起的食源性疾病居多[3-4]。副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是其中2種重要的食源性致病菌,對于這2種致病菌的檢測,傳統培養方法仍是公認且可靠的方法,但需要經過細菌分離培養、形態學觀察、生化鑒定等多個步驟,通常需要4～7 d,導致檢測周期長且繁瑣[5-6];常規PCR檢測方法檢測時間較長,不能滿足現場檢測的要求[7];基于免疫學技術的檢測不能對死活細胞進行區分[8];而基于生物傳感器的檢測方法成本高,需要專業人士操作。

環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是由NOTOMI等[9]于2000年提出的一種核酸擴增技術,其具有靈敏度高、特異性強、快速、成本低、不依賴精密儀器的特點。目前,LAMP已經在動植物病原菌[10]、食源性致病菌[11-12]、轉基因食品[13]及臨床檢測[14]等領域得到廣泛應用。與常規聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)相比,LAMP具有特異性好、靈敏度高、反應時間短的顯著優勢,其不足主要在于多重LAMP檢測存在一定的挑戰,由于多重LAMP是在一個反應體系中同時檢測多個目的基因,要求反應期間不能出現引物自聯、錯配的情況,這就提高了引物設計難度,需要精確設計多個復合引物,但由于其具有較高的特異性和敏感性,仍是研究最廣泛的等溫擴增技術之一[15]。

副溶血弧菌編碼β-內酰胺酶的基因blaCARB-17與其對青霉素的固有耐藥性有關,且研究發現blaCARB-17在副溶血弧菌檢測中具有較好的特異性[16]。金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc是最常用的特異性靶基因,在金黃色葡萄球菌的臨床分離株中高度保守,廣泛用于金黃色葡萄球菌核酸鑒定的特異性靶點[17-18]。為此,本研究針對副溶血弧菌與金黃色葡萄球菌的這2種特異性基因設計引物,建立一種實時熒光LAMP同時檢測副溶血弧菌與金黃色葡萄球菌的方法,能夠實現在一次LAMP反應中同時快速、準確地檢測2種食源性致病菌,為多重LAMP檢測食源性致病菌的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

目標及非目標菌株詳情見表1。

表1 實驗所用菌株Table 1 The bacterial strains used in this study

細菌基因組DNA快速抽提試劑盒(B518255)、溶菌酶、BstDNA聚合酶、10×ThermoPol緩沖液、MgCl2溶液、dNTP Mixture、滅菌雙蒸水,上海生工(生物工程)股份有限公司;EveGreen(20×水溶液),翌圣生物科技(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1B超凈工作臺,蘇州凈化設備有限公司;Forma Class Ⅱ A2生物安全柜、Nano Drop 2000c超微量分光光度計,美國Thermo公司;高速冷凍離心機,德國Eppendorf股份有限公司;TP600梯度PCR儀,日本TaKaRa儀器有限公司;DYY-6C電泳儀,北京六一儀器廠;CFX 96 TouchTM熒光定量PCR儀、GelDoc XR凝膠成像儀,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌株的培養

金黃色葡萄球菌在無菌條件下劃線于Baird-Par- ker瓊脂平板中,37 ℃下培養12 h,形成清晰的單菌落。挑取Baird-Parker瓊脂平板上呈黑色或灰色且外圍有透明圈的單菌落培養于TSB培養基中,37 ℃、150 r/min培養16 h;副溶血弧菌在無菌條件劃線于TCBS瓊脂培養基上,37 ℃培養12 h,挑取藍綠色單菌落于含3%(質量分數)NaCl的TSB液體培養基中37 ℃、150 r/min培養16 h;其余菌株于TSB培養基中37 ℃,150 r/min活化16 h。

1.3.2 DNA模板的制備

根據細菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取模板DNA,具體步驟按照試劑盒說明書進行,將提取后的DNA模板用超微量分光光度計測定其濃度,并于-20 ℃保存。

1.3.3 LAMP引物設計與合成

從GeneBank數據庫公布的金黃色葡萄球菌(GenBank:V01281.1)和副溶血弧菌(GenBank: JX262976.1)的基因序列中,分別以nuc和blaCARB-17作為特異性靶基因,根據目的基因的保守區,利用Primer Premier 5.0軟件(http://primerexplorer.jp/e/,Eiken Chemical Co.Ltd.)進行引物設計,采用NCBI Primer-blast工具(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi,NCBI)確定引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表2。

表2 LAMP引物序列Table 2 Primer sequences of the LAMP

1.3.4 雙重實時熒光LAMP方法的建立及條件優化

優化前雙重實時熒光LAMPP反應體系(25 μL)包括:blaCARB-17-F3與blaCARB-17-B3各0.1 μmol/L,blaCARB-17-FIP與blaCARB-17-BIP各0.8 μmol/L,nuc-F3與nuc-B3各0.1 μmol/L,nuc-FIP與nuc-BIP各0.8 μmol/L,dNTPs 2.4 mmol/L,Mg2+6 mmol/L,BstDNA聚合酶12 U,10×Reation Buffer 2.5 μL,20×EvaGreen水溶液1 μL,副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌DNA模板各1 μL,空白對照以等量ddH2O代替,補充無菌ddH2O至25 μL。

參考反應條件設置為:65 ℃ 1 min,共60個循環,每個循環結束時采集熒光信號;反應結束后80 ℃滅酶2 min;并對擴增產物進行熔解曲線分析,熔解曲線程序設置為:以0.1 ℃/5s速率由75 ℃升溫至95 ℃,每升溫0.1 ℃采集1次熒光信號,生成熔解曲線[19]。

分別對反應體系中的引物濃度比、dNTPs濃度、Mg2+濃度以及反應溫度進行優化,其他條件保持不變,根據優化前的反應體系及反應條件進行實時熒光LAMP反應,通過Ct值及擴增產物熒光值確定適宜的反應條件[20-21]。具體參數設置見表3。

表3 雙重實時熒光LAMP的反應條件優化Table 3 Optimization of the reaction conditions of the dual real-time LAMP

1.3.5 雙重實時熒光LAMP特異性

分別以副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌、非目標菌株DNA為模板,按照優化后的反應條件進行實時熒光LAMP。熒光擴增曲線為“ S”型或類“ S”型則判定為陽性,擴增曲線為平的直線則判定為陰性。若呈現為陽性的擴增曲線,且擴增產物出現特征熔解峰的溫度區間及特征熔解峰Tm值落在同一范圍即可判定所建立的實時熒光LAMP方法特異性良好[22]。反應設置3個復孔,實驗重復2次。

1.3.6 雙重實時熒光LAMP靈敏度的評價

以超微量分光光度計測定DNA模板濃度,分別以10倍梯度稀釋的副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌及其混合DNA為模板,金黃色葡萄球菌DNA模板濃度為1.45×102～1.45×108copies/mL,副溶血弧菌DNA模板濃度為3.62×101～3.62×107copies/mL,以ddH2O作為空白對照,根據優化后的反應體系及條件進行實時熒光LAMP,同時進行雙重PCR反應,通過比較評價雙重實時熒光LAMP方法的靈敏度。雙重PCR反應體系(25 μL)為:blaCARB-17-F3 0.4 μmol/L,blaCARB-17-B3 0.4 μmol/L,nuc-F3 0.4 μmol/L,nuc-B3 0.4 μmol/L,TaqPCR Master Mix 12.5 μL,副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌DNA模板各1 μL,補充無菌ddH2O至25 μL。反應程序為:預變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃ 30 s,退火60 ℃ 30 s,延伸72 ℃ 30 s,共35個循環;終延伸72 ℃ 5 min,反應結束后取3 μL擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.7 雙重實時熒光LAMP方法在人工模擬樣品檢測中的靈敏度

稱取10 g經GB 4789.7 —2013及GB 4789.10—2016檢測無副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌污染的豬肉樣品共7份,分別加入1 mL 10倍梯度稀釋的副溶血弧菌與金黃色葡萄球菌菌懸液制備成不同濃度的人工污染樣品,將人工污染樣品加入至90 mL生理鹽水后均質,除去大顆粒固體后吸取1 mL勻液按照1.3.2中的方法制備DNA模板,按照優化后的反應體系及條件進行檢測。

1.3.8 數據處理

實驗平行進行3次及以上,熒光定量PCR儀中導出LAMP反應擴增曲線和熔解曲線,利用Graph- Pad Prism8進行圖像處理分析。

2 結果與分析

2.1 雙重實時熒光LAMP方法的建立及條件優化

2.1.1 引物濃度的優化

我們研究發現當體系中blaCARB-17與nuc引物濃度比相同時,blaCARB-17擴增產物的熒光值遠高于nuc擴增產物的熒光值,說明雙重實時熒光LAMP反應中,相比于nuc基因,blaCARB-17基因具有擴增優勢,因此需要進一步對blaCARB-17與nuc引物濃度比進行優化。由圖1可知,隨著nuc引物濃度增大,雙重實時熒光LAMP反應的nuc擴增產物的熒光值增高,當blaCARB-17與nuc引物濃度比為1∶4時,兩者的擴增產物的熒光值相當,分別為8×103、7×103RFU,因此確定blaCARB-17與nuc適宜的引物濃度比為1∶4。此外,無論兩者引物濃度比為多少,blaCARB-17與nuc的特異性熔解峰出現的溫度范圍及Tm值均保持相對穩定,說明以blaCARB-17與nuc為靶基因的雙重實時熒光LAMP方法可以有效地對副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌同時進行檢測。多重實時熒光LAMP反應體系中引物間的濃度配比十分重要,這是因為多重反應體系中存在著“優勢擴增”現象,如果各組引物間濃度配比不合適可能導致體系中某一基因擴增量低,甚至不擴增[23]。

2.1.2 反應溫度的優化

由圖2可知,當反應溫度為65 ℃時,雙重實時熒光LAMP反應的Ct值最小,為28.37,此溫度下的擴增產物熒光值約為3.0×104RFU;擴增產物熒光值最高對應的是61 ℃,為3.8×104RFU,略高于65 ℃下的熒光值,但其Ct值為33.20,高于65 ℃下反應的Ct值,因此選擇65 ℃為適宜的反應溫度,同時我們發現,反應溫度對雙重實時熒光LAMP的影響不大。

1-金黃色葡萄球菌nuc 擴增產物的特征熔解峰;2-副溶血弧菌blaCARB-17擴增產物的特征熔解峰;NTC-空白對照a-引物濃度比為1∶2的熔解曲線;b-引物濃度比為1∶3的熔解曲線;c-引物濃度比為1∶4的熔解曲線;d-引物濃度比為1∶5的熔解曲線圖1 雙重實時熒光LAMP引物濃度比的優化Fig.1 Optimization of concentration ratio of primers for dual real-time LAMP

a-61 ℃時的反應擴增曲線;b-63 ℃時的反應擴增曲線;c-65 ℃時的反應擴增曲線;d-67 ℃時的反應擴增曲線圖2 雙重實時熒光LAMP反應溫度優化Fig.2 Optimization of temperature for dual real-time LAMP

2.1.3 dNTPs濃度的優化

將dNTPs濃度分別設置為1.6、1.8、2.0、2.2、2.4 mmol/L,反應體系中其他成分濃度保持不變。如圖3所示,當體系中dNTPs濃度為1.8 mmol/L時,擴增的Ct值最小,為29.69,擴增產物熒光值約為 2.0×104RFU,而其他dNTPs濃度擴增下Ct值均遠大于該組,因此確定雙重實時熒光LAMP的適宜dNTPs濃度為1.8 mmol/L。

2.1.4 Mg2+濃度的優化

由圖4可知,當 Mg2+濃度為2 mmol/L時雙重實時熒光LAMP反應不能正常進行,隨著 Mg2+濃度的增加,反應的Ct值減小,當 Mg2+濃度為6 mmol/L時,擴增的Ct值最小,為26.43,擴增產物熒光值約為2.5×104RFU;而當 Mg2+濃度繼續增加到8 mmol/L時,反應Ct值增加,為30.49,此時擴增產物熒光值約為2.1×104RFU。可見 Mg2+對LAMP反應是必需的,當 Mg2+濃度達到4 mmol/L時反應才能正常進行,而過高的 Mg2+濃度又會一定程度上抑制LAMP反應,雙重實時熒光LAMP的適宜 Mg2+濃度為6 mmol/L。

1～5分別為dNTPs濃度為1.8、2.2、2.0、1.6、2.4 mmol/L時雙重實時熒光LAMP的擴增曲線圖3 雙重實時熒光LAMP反應dNTPs濃度的優化Fig.3 Optimization of dNTPs concentration for dual real-time LAMP

2.2 雙重實時熒光LAMP的特異性評價

以副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、兩者混合DNA為模板進行雙重實時熒光LAMP擴增,如圖5所示,副溶血弧菌DNA的特征熔解峰溫度區間為85～89 ℃,特征熔解峰的Tm值為88.0 ℃左右;金黃色葡萄球菌DNA的特征熔解峰溫度區間出現在80～85 ℃,特征熔解峰的Tm值為83.2 ℃左右;兩者混合DNA模板在雙重實時熒光LAMP中,副溶血弧菌的特征熔解峰溫度區間為86～90 ℃,特征熔解峰的Tm值為87～88 ℃左右,金黃色葡萄球菌的特征熔解峰溫度區間出現在80～83 ℃,特征熔解峰的Tm值為81.8 ℃左右,與單重實時熒光LAMP相比,特征熔解峰溫度區間及Tm值雖然稍有小幅度偏移,但仍能準確分辨副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌,且其他非目標菌株均無擴增,說明雙重實時熒光LAMP具有良好的特異性。

1～4分別為Mg2+濃度為6、8、4、2 mmol/L時雙重實時熒光LAMP的擴增曲線圖4 雙重實時熒光LAMP反應Mg2+濃度的優化Fig.4 Optimization of Mg2+ concentration for dual real-time LAMP

a-副溶血弧菌DNA的熔解曲線;b-金黃色葡萄球菌DNA的熔解曲線;c-2種菌混合DNA的熔解曲線圖5 雙重實時熒光LAMP反應的特異性Fig.5 The specificity of dual real-time LAMP

2.3 雙重實時熒光LAMP的靈敏度分析

圖6顯示,在雙重實時熒光LAMP反應中,有6個濃度的DNA混合模板呈“S”型擴增,而從圖6-b中可以看到最低濃度混合DNA模板在80～84 ℃沒有特征熔解峰,在86～90 ℃有特征熔解峰,即濃度為1.45×103copies/mL的金黃色葡萄球菌無法檢出。因此,雙重實時熒光LAMP對副溶血弧菌的檢測限為3.62×102copies/mL,對金黃色葡萄球菌的檢測限為1.45×104copies/mL。由圖6-c可知,在雙重PCR方法中,blaCARB-17的靈敏度為3.62×103copies/mL,而nuc的靈敏度為1.45×105copies/mL。相比于雙重PCR方法,雙重實時熒光LAMP對副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌的檢測限分別提高了10倍。

2.4 雙重實時熒光LAMP方法在人工模擬樣品檢測中的靈敏度

對10倍梯度稀釋的副溶血弧菌(1.2×101～1.2×107CFU/mL)及金黃色葡萄球菌(2.8×101～ 2.8×107CFU/mL)樣品提取DNA模板后進行雙重實時熒光LAMP反應,結果如圖7所示,濃度為103CFU/mL的模板均呈“ S”型曲線擴增,濃度為1.2×102及1.2×101CFU/mL的模板無擴增(圖7-a)。濃度為103CFU/mL的模板在80～83 ℃無熔解峰,而86～90 ℃有熔解峰(圖7-b)。因此,雙重實時熒光LAMP在人工模擬樣品中對副溶血弧菌的最低檢測限為1.2×103CFU/mL,對金黃色葡萄球菌的最低檢測限為2.8×104CFU/mL。

1～7依次對應混合DNA模板濃度,即金黃色葡萄球菌(1.45×102～1.45×108 copies/mL)及副溶血弧菌(3.62×101～3.62×107 copies/mL);M-DNA Marker(100～2 000 bp);N-空白對照;293 bp大小的擴增片段為nuc擴增片段,189 bp大小的擴增片段為blaCARB-17的擴增片段;a-梯度稀釋的兩菌混合DNA的反應擴增曲線;b-梯度稀釋的兩菌混合DNA的反應熔解曲線;c-雙重PCR產物凝膠電泳圖圖6 雙重實時熒光LAMP及雙重PCR的靈敏度Fig.6 The sensitivities of dual real-time LAMP and dual PCR

a-擴增曲線;b-熔解曲線圖7 雙重實時熒光LAMP在人工模擬樣品檢測中的靈敏度Fig.7 The sensitivity of dual real-time LAMP for the detection of the spiked samples

3 討論與結論

副溶血弧菌與金黃色葡萄球是2種重要的食源性致病菌,近年來,不少學者分別研究了檢測副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌的LAMP方法,WANG等[24]建立了以nuc及mecA為靶基因的金黃色葡萄球菌及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的LAMP檢測方法,并與PCR方法進行了比較,LAMP方法對nuc及mecA的檢測靈敏度分別為1.47、14.7 pg/μL,而PCR方法的靈敏度分別為14.7、147 pg/μL,LAMP方法的檢測限均比PCR方法高10倍。ZHONG等[25]建立了一種將疊氮溴化丙錠與實時LAMP相結合的方法,以定量檢測副溶血性弧菌,該方法不僅特異性好、靈敏度高,而且可以快速地區分副溶血弧菌的活細胞和死細胞。

為了進一步縮短檢測時間,提高檢測效率,國內外許多學者開始思考如何在一個反應中檢測多個靶基因,目前研究較多的是多重PCR和多重qPCR。例如WARD等[26]建立了副溶血性弧菌特異性基因tlh以及3個毒力基因tdh、trh和orf8的多重PCR方法,以區分致病性和非致病性副溶血性弧菌。PCR形成的是單一大小的擴增產物,但LAMP反應的最終擴增產物是不同大小的莖環DNA組成的混合物,因此如何將LAMP運用到多目的基因檢測中一直是亟需解決的一個重大問題。姜侃等[27]探究了三重LAMP檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特氏菌的可行性,通過以目標菌、非目標菌及混合DNA為模板進行擴增,利用電泳的方法進行結果判定,該方法雖然顯示出良好的特異性,但無法判定擴增條帶屬于何種食源性致病菌,僅適用于某種或幾種食源性致病菌的初篩。WANG等[28]針對副溶血弧菌toxR基因和創傷弧菌rpoS基因建立了多重實時熒光定量LAMP,但該方法需要利用限制性核酸內切酶進行酶切,使得操作更加繁瑣。

本研究建立了一種能夠同時檢測金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌的雙重實時熒光LAMP方法,對影響LAMP反應的主要條件進行了優化,確定了副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌最佳引物濃度比為1∶4,Mg2+的最適濃度為6 mmol/L,dNTPs的最佳反應濃度為2.4 mmol/L,最適宜的反應溫度為65 ℃。該方法通過熔解曲線特征熔解峰的溫度區間及其Tm值來區分副溶血性弧菌和金黃色葡萄球菌,實現了能夠在一個反應管中同時檢測2種致病菌,既縮短檢測時間,也提高了檢測效率,結果表明該方法特異性強,對副溶血弧菌及金黃色葡萄球菌的檢測限分別為3.62×102、1.45×104copies/mL,靈敏度較好。

我們在研究中發現,引物濃度比和 Mg2+的影響較大,這可能是因為在多重反應體系中加入8條引物,導致一方存在優勢擴增現象,通過優化引物濃度比可以明顯改善。 Mg2+濃度通過影響BstDNA聚合酶的活性而作用于催化反應,在研究中低濃度的Mg2+導致不擴增,Mg2+濃度過高導致反應效率變低,也會導致體系的不穩定[29]。LAMP方法簡單方便,可特異性識別非特異性擴增產物,但由于LAMP反應體系存在多套引物,不可避免地產生引物間互相干擾等問題,而且Tm值差異的區分能力有限,不太適合兩重以上的擴增。未來我們可以將這種反應體系與微流控技術、芯片實驗室、毛細管實驗室等微型實驗室技術結合,實現多重LAMP微型化和自動化,使LAMP技術具有更高的可靠性和更好的應用前景。