異葒草素調控糖尿病的作用機制研究進展

閆科潤,沈玥,李寧,黃現青,喬明武,宋蓮軍

(河南農業大學 食品科學技術學院, 河南省食品加工與流通安全控制工程技術研究中心, 河南 鄭州,450000)

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是臨床常見病、多發病,現已逐步成為世界范圍內最主要的慢性非傳染性疾病之一,發病率逐年上升。據國際糖尿病聯盟統計[1],2019年在全球4.63億患者中,中國糖尿病患者數排名第一,總人數約為1.164億人,占比全球25%,糖尿病是中國第一大慢性病。糖尿病以高血糖和碳水化合物、蛋白質、脂肪代謝紊亂為特征[2]。持續性高血糖常導致并發癥,影響患者的視覺、神經、腎臟等系統[3]。糖尿病心腦血管病變、糖尿病神經病變、糖尿病足、糖尿病腎病、糖尿病眼病,是糖尿病五大并發癥,對生活質量有極大影響。

現在臨床應用上具有抗糖尿病作用的降糖藥有多種,但由于商品化藥物成本高,且觀察到大量的藥物相互作用和不良反應[4],而傳統草藥可能對糖尿病有多種療效[5],耐受性更強,副作用更少,因此越來越需要從天然植物中尋找更天然的治療劑,所以治療糖尿病及其并發癥的藥用植物的研究倍受關注。

異葒草素屬于黃酮類化合物,廣泛存在于多種植物中,具有多種生理功能。現有研究表明,異葒草素可以通過調節血糖的生理水平,緩解胰島素抵抗,保護機體免受氧化應激的作用,減少脂質積累,促進線粒體生物發生,進而改善一型和二型糖尿病,而且可以改善一部分糖尿病并發癥。本文系統地綜述異葒草素調控糖尿病的作用及分子機制,并談及異葒草素調控糖尿病并發癥的相關結果,以期為異葒草素治療糖尿病及其并發癥的進一步研究及應用提供一定的參考。

1 異葒草素的介紹

異葒草素(isoorientin, ISO),3′,4′,5,7-四羥基- 6-吡喃葡萄糖基黃酮,又稱木犀草素-6-C-葡萄糖苷,分子式為C21H20O11,分子質量為448.38,分子結構見圖1。異葒草素廣泛存在于藜麥[6]、小麥[7]、蕎麥芽[8]、蓮子[9]、西番蓮[10]、玉米絲[11]、荊條葉[12]、葫蘆巴籽[13]、葛根[14]等多種植物的藥用或食用部位。

圖1 異葒草素Fig.1 Isoorientin

異葒草素是一種天然的黃酮類物質,屬于木犀草素C-糖苷類化合物[15]。研究表明,黃酮類C-糖苷比黃酮類O-糖苷更穩定,且具有更高的抗炎、抗氧化和抗糖尿病能力[16-17],異葒草素作為其典型C-糖苷類黃酮化合物,根據其化學結構預測異葒草素具有較好的抗炎、抗氧化及抗糖尿病活性。

近年來的研究成果表明,異葒草素具有抗腫瘤[18-19]、抑制炎性疾病[20]、抗病毒[21]、改善糖尿病[22]和神經保護潛力[23]等藥理效果。從分子機制的研究可以看出,異葒草素的抗炎功能為其通過抗氧化、降低炎癥因子表達而改善糖尿病提供理論依據,并且異葒草素改善糖尿病及保護神經的作用為其調控糖尿病神經病變這一并發癥提供理論依據。

2 異葒草素調控糖尿病的作用機制

2.1 異葒草素通過調控血糖紊亂改善糖尿病

現有研究結果從血糖及相關生理指標的調控、糖耐量及急性降糖效果等方面驗證了以異葒草素為主要成分的提取物具有降血糖的效果。XU等[24]研究發現木棉葉標準乙醇提取物(主要成分為異葒草素)能顯著降低二型糖尿病(diabetes mellitus type 2,T2DM)模型大鼠的空腹血糖、糖化血紅蛋白、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、血清胰島素和丙二醛(malondialdehyde,MDA)濃度,提高口服葡萄糖耐量、高密度脂蛋白膽固醇和超氧化物歧化酶水平。ANDRADE-CETTO等[25]對Cecropia pachystachya提取物(主要成分為異葒草素)的降糖作用進行了不同時長的研究,發現其對四氧嘧啶誘導的一型糖尿病大鼠有明顯的降糖作用,12 h后血糖下降68%。在糖尿病大鼠中,給予該提取物也能顯著降低血糖水平,急性降糖效果為90 min時更為明顯(降幅為60%)。120 min后,該提取物與標準藥物(二甲雙胍和格列本脲)組大鼠的血藥濃度無明顯差異。

這些實驗大部分都是以混合提取物為研究對象,只有少部分研究異葒草素單體。SEZIK等[26]從龍膽中提取分離純化出異葒草素,發現其降糖、降脂作用似乎不呈劑量依賴性,15 mg/kg劑量時作用最強,較高劑量時作用減弱。第15天末次給藥后,停止給藥,并在動物舍內繼續以普通大鼠飼料和自由飲水維持10 d,第25天進行血糖、膽固醇和甘油三酯濃度的最終測定,發現顯著效果持續存在。LUAN等[13]發現異葒草素可以通過促進蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和腺苷酸激活蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK]磷酸化,促進代謝,恢復胰島素抵抗的脂肪細胞對葡萄糖的攝取。ALONSO-CASTRO等[27]發現在胰島素敏感細胞中,異葒草素誘導免疫應答(immune response, IR)、胰島素受體底物1(insulin receptor substrate1,IRS1)、胰島素受體底物2(insulin receptor substrate2,IRS2)和磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)基因的表達高于胰島素,且促進了IR、PI3K和AKT的磷酸化。并通過胰島素信號通路抑制劑作用于異葒草素誘導的3T3-F442A細胞和人脂肪細胞,發現4種胰島素信號通路抑制劑HNMPA-(AM)3(用于IR),Wortmannin(用于PI3 K),AKT抑制劑VIII(用于AKT1/2),Indinavir(用于GLUT4)都抑制了細胞的葡萄糖轉運,證明異葒草素可以通過調控胰島素信號通路調控糖尿病。

雖然已有少數實驗證明異葒草素單體對高血糖有調控效果,但研究結果僅限于特征生理指標的變化,相對于混合物在糖化血紅蛋白、血清胰島素和MDA濃度等生理指標的測定及急性降糖方面研究較少,在生理指標測定及急性降糖方面仍需進行進一步的探究。此外,通過體內動物實驗,證明異葒草素可調控血糖紊亂來改善糖尿病,但它主要把生理指標作為測定指標,仍缺少分子機制層面的探究。體外細胞實驗證明異葒草素通過激活AKT和AMPK的磷酸化,進而恢復機體對葡萄糖的攝取和轉運。但是異葒草素調控葡萄糖的機理攝取和轉運的機理仍待研究,比如異葒草素調控轉運過程是否是通過調控蛋白激酶(protein kinase Cλ/ξ, PKCλ/ξ)的級聯反應、分解代謝基因活化蛋白(catabolite gene activator protein,CAP)等來實現的。

2.2 異葒草素通過抑制糖異生作用改善糖尿病

有少量研究關于異葒草素調控糖異生。葡萄糖- 6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase, G6 Pase)是一種水解葡萄糖-6-磷酸的酶,它會產生磷酸基團和游離葡萄糖。然后葡萄糖通過膜葡萄糖轉運蛋白從細胞中輸出。這種催化作用完成了糖異生和糖原分解的最后步驟,因此在血糖水平的動態平衡調節中起著關鍵作用,在禁食狀態下尤其如此[28]。這種肝臟葡萄糖的輸出是二型糖尿病患者空腹血糖濃度升高的主要決定因素。ANDRADE-CETTO等[29]以二型糖尿病大鼠為體內模型,以完整的大鼠肝微粒體為體外模型,從兩方面探究Cecropia提取物(主要成分為異葒草素)對G6 Pase活性的影響,實驗證明其對G6 Pase活性有明顯的抑制作用,可以通過阻斷肝臟的葡萄糖輸出來改善血糖控制。KASANGANA等[30]發現異葒草素能促進AMPK磷酸化,進而降低G6 Pase活性,同時AMPK活化引起糖原合成酶激酶-3(glycogen syn- thase kinase-3,GSK-3)磷酸化,刺激糖原合成酶(gly- cogen synthase,GS)活性,抑制肝臟糖異生進而降低血糖。

糖異生是個復雜的過程,葡萄糖-6-磷酸酶只是調節糖異生的激素中的一種,除此之外糖異生的主要限速酶還有丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPCK)、果糖二磷酸酶(fructose 1,6-bisphosphatase)。另外,在糖異生過程中,代謝物的調節對其也很重要,比如血漿中甘油、乳酸和氨基酸濃度。同時,乙酰輔酶A的濃度對糖異生也有影響,其決定了丙酮酸的代謝方向。

2.3 異葒草素通過調控氧化損傷改善糖尿病

異葒草素的抗氧化性使其可緩解胰島素抵抗、減少脂質積累、影響某些酶的活力,進而改善糖尿病。LUAN等[13]研究發現異葒草素顯著抑制脂肪細胞特異性基因過氧化物酶體增殖物激活型受體γ(peroxi- some proliferators-activated receptors-γ,PPARγ)、CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteins alpha, C/EBPα)、脂肪細胞脂結合蛋白(adi- pocyte lipid binding protein, AP2)、膽固醇調節元件結合蛋白-1c(sterol-regulatory element binding proteins,SREBP1c)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, Fas)的轉錄,緩解胰島素抵抗。過氧化物酶體增殖物激活型受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)在炎癥反應、細胞凋亡、胰島素抵抗、糖脂代謝、腫瘤中起到重要的調節作用[31]。異葒草素通過下調脂肪因子和脂質代謝相關基因,如PPARγ、C/EBP 和Fas等,上調胰島素誘導基因1和2(insulin induced gene,INSIG 1、2),減少脂肪細胞中脂滴的積聚[32]。其中PPARα/PPARγ/UCP1(UCP1為棕色脂肪產熱蛋白1，uncoupling protein 1)的調控與AMPK磷酸化類似,PPARγ在激活后,可以通過表達UCP1來調節脂肪褐變。而異葒草素可以促進脂肪細胞對葡萄糖的攝取,這與增加UCP1的表達和氧耗率有關[33]。

四氧嘧啶誘導的一型糖尿病通過降低血清中還原型谷胱甘肽(glutathione, GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)和谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)等抗氧化劑水平而引起氧化應激。MALIK等[34]研究發現在異葒草素治療后,糖尿病大鼠的SOD活性得到了改善,CAT、GSH和GPX也得到了改善。并采用計算機模擬技術,將目標蛋白G蛋白偶聯受體40(G Protein-Coupled Receptor 40, GPR40)、G6 Pase、棕色脂肪產熱蛋白2(uncoupling protein 2, UCP2)、糖原磷酸化酶(glycogen phosphorylase, GP)、醛糖還原酶(aldose reductase, AR)和葡萄糖轉運蛋白-4(glu- cose transporter 4, GLUT4)與異葒草素對接。對接結果表明,其與所有6種靶蛋白都有很強的活性,證明可以有效地抑制糖尿病蛋白的活性。

目前,已發現異葒草素可以提高抗氧化劑的水平,并借助生物信息的技術給予證明。但并沒有探究異葒草素是如何調控各種抗氧化劑,接下來可以以此為切入點,探究異葒草素調控抗氧化劑的作用通路。另外,調節脂肪酸和膽固醇的合成除了與PPARs、SREBP、Fas 等有重要聯系,還與上游刺激因子1(upstream stimulatoty factor1, USF1)和細胞核受體(liver X receptor, LXR)有著密不可分的關系,胰島素信號轉導可以通過激活USF1 和LXR 促進脂肪酸的合成。

2.4 異葒草素通過調控線粒體功能改善糖尿病

線粒體是一種雙膜結合的細胞器,通常被認為是細胞的“動力單元”[35]。研究表明,線粒體在脂肪細胞的脂肪生成和脂解過程中都起著重要作用。在脂肪細胞中,線粒體產生超過95%的細胞ATP,是細胞代謝和其他一般細胞過程所必需的,而基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase, MMP)是產生ATP的一個重要因素[36]。氧化磷酸化是細胞內活性氧(reactive oxygen species, ROS)的主要來源,在氧化磷酸化過程中,形成MMP。LUAN等[13]研究發現異葒草素可降低細胞內ROS水平,同時升高細胞內ATP水平和MMP水平。同時,耗氧速率與線粒體有著密切關系,AMPK的激活與線粒體能量學過程有關系。ZIQUBU等[37]證明異葒草素可以通過刺激ATP的產生和耗氧速率來增強線粒體的呼吸,這是與有效線粒體功能相關的一個重要過程。因此,異葒草素可以通過促進線粒體生物發生而影響糖脂代謝,但對于異葒草素在線粒體功能和調節機制中的作用研究偏少。

2.5 異葒草素通過抑制α-葡萄糖苷酶改善糖尿病

α-葡萄糖苷酶是治療二型糖尿病的重要酶靶點。這種酶存在于小腸的刷狀緣膜中,催化α-D-葡萄糖(游離單糖)中雙糖的α-(1→ 4)-糖苷鍵的水解[38]。釋放的單糖被腸道吸收,導致血液中的血糖和胰島素水平增加[39]。因此,抑制α-葡萄糖苷酶可以降低碳水化合物的消化率,從而降低血液中的血糖水平,抑制餐后高血糖[40]。SHIBANO等[41]發現從鴨趾草中分離提取出的異葒草素等成分對大鼠腸道α-葡萄糖苷酶有抑制作用,證明異葒草素具有降糖的功效。BORGES[42]通過體外抑制酵母菌α-葡萄糖苷酶活性實驗證明異葒草素對α-葡萄糖苷酶有抑制作用,并對所測試的黃酮類化合物進行了分子對接,以研究其與α-葡萄糖苷酶口袋的可能相互作用,對接研究表明,糖基和A或B環的相互作用主要是通過氫鍵實現的。

2.6 異葒草素通過抑制鈉-葡萄糖共轉運蛋白-2(sodium-dependent glucose transporters 2,SGLT2)改善糖尿病

長期使用多種藥物控制糖尿病,會導致副作用,如體重增加和低血糖。治療糖尿病患者需要新的、無風險的藥物來治療高血糖,其中新的靶點通過抑制小腸中的葡萄糖轉運和減少腎臟對葡萄糖的重吸收來解決這些問題。SGLT2抑制劑能競爭性抑制腸道和腎臟的葡萄糖攝取[43],已成為一種有效的治療T2DM的策略,那么篩選SGLT2抑制劑成為該項治療方法的重點。ANNAPURNA等[44]通過電子對接的方法,探究異葒草素與SGLT2相互作用,其與SGLT2的Gln 295和Asp 294殘基的相互作用已被證明與III期藥物Dapagliflzin的相互作用相當,證明異葒草素可以作為潛在的SGLT2抑制劑治療糖尿病。

綜上所述,異葒草素能夠在血糖紊亂后使其恢復至正常水平,同時能促進細胞對葡萄糖的攝取,并改善氧化損傷及炎癥反應,以及通過促進線粒體生物發生而促進糖脂代謝。由此可見,異葒草素調節糖尿病的作用機制主要涉及攝入葡萄糖后的反應,異葒草素調節葡萄糖進入血液后的反應主要通過抑制炎癥反應及其抗氧化作用,以胰島素信號通路AKT和能量代謝通路AMPK為主,通過AKT、AMPK的磷酸化促進代謝,并引起血糖調節、抗氧化活性、線粒體功能等下游作用通路,圖2匯總了上述分子機制。雖然明確異葒草素可以調節血糖,但AKT和AMPK信號通路還有很多的分支是異葒草素相關研究所沒有探究到的,其中關鍵位點的轉錄因子(forkhead box, FoxO)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)對糖尿病的調控也很重要,FoxO通過調控轉錄過程進而調節代謝,AKT可磷酸化并直接抑制FoxO,AMPK可直接調控FoxO3并激活轉錄活性。mTOR及其下游成分進行蛋白質合成,胰島素信號轉導通過破壞CREB/CBP/mTOR的結合抑制肝臟中的糖異生。

圖2 異葒草素調節糖尿病的作用通路Fig.2 Pathway of isoorientin regulating diabetes mellitus

3 異葒草素調控糖尿病并發癥的研究

3.1 異葒草素改善糖尿病引起的血小板聚集

一些研究表明,血小板聚集增加可能與ROS產生的改變有關,ROS的產生可能直接影響血小板聚集、活化以及血栓形成和血管損傷[45]。SALLES等[46]研究發現西番蓮葉提取物對二型糖尿病動物的治療降低了血小板聚集,并抑制了血小板中這些氧化性物質的產生。另外,考慮到之前證明西番蓮提取物抗氧化性能的研究[47],西番蓮提取物對血小板聚集的影響也可能與該提取物的抗氧化作用有關,從而清除ROS。證明西番蓮葉提取物對糖尿病患者的健康有益,可防止其并發癥的出現。其作用可能與類黃酮有關,其中包括黃酮類C糖苷——異葒草素,但并未進行單體驗證,接下來應分離純化出單體探究其對血小板聚集的作用。

3.2 異葒草素改善糖尿病引起的肝損傷

YUAN等[48]發現異葒草素可以通過調節脂質代謝、抗氧化能力和炎性細胞因子的釋放來預防高果糖誘導的肝損傷發生。肝臟組織病理學觀察發現,飼喂高果糖的小鼠出現嚴重的脂滴沉積、壞死、細胞質空泡化、細胞膜和細胞核碎裂,而異葒草素可保護肝組織免受高果糖誘導的脂肪肝和肝損傷。生化分析與肝組織病理學改變的結果一致,高果糖飲食顯著提高了谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)水平,異葒草素治療顯著減輕了這種改變。MDA是肝組織氧化損傷的特征性指標。高果糖喂養的小鼠肝臟MDA水平升高,給予異葒草素有效地降低了肝組織中的MDA水平。另外,給予異葒草素抑制炎性細胞因子(TNF-α、IL-1、IL-6)的釋放,消除肝臟的炎癥反應。雖然已證明異葒草素可以改善肝損傷,但目前實驗結果僅局限于體內實驗,并且缺少在糖尿病動物模型中的驗證,后續可以在糖尿病動物模型中進行進一步驗證,并補充體外實驗,如以肝臟細胞為模型進行探究。

4 展望

與合成藥物相比,草藥通常被認為具有較少的副作用。上述研究已經證實含有異葒草素的植物提取物和草藥制劑具有抗高血糖作用,它們有可能用作抗糖尿病滋補品,但是其多數以植物提取物,也就是以含異葒草素的混合物作為研究對象,單體只有少量研究。混合物之間可能存在拮抗或促進作用,而研究單體可以清晰地確定其作用效果。通過體內動物實驗,證明異葒草素可調控糖脂代謝及抗氧化劑來改善糖尿病,但它主要把生理指標作為測定指標,仍缺少分子機制層面的探究,而體外實驗補充了異葒草素調控糖尿病的分子機制,發現異葒草素通過調控胰島素信號通路及能量代謝通路進而改善糖尿病,為后續異葒草素的研究與應用提供理論支持。

目前中西醫[49-50]治療糖尿病的機制主要涉及促進胰島素分泌,增強胰島素作用,修復受損的胰島β細胞,增強葡萄糖的利用,提高對糖類物質的代謝,抑制消化道對糖類的吸收。目前,許多體外研究以及動物實驗都證明了異葒草素具有調控糖尿病及其并發癥的作用,但大部分分子機制的研究仍以細胞層面為主,缺少動物體內實驗的驗證,并且異葒草素在糖尿病并發癥方面的研究過少。為了拓展異葒草素在糖尿病領域的應用,明確異葒草素在糖尿病方面的調控作用,以下幾項工作的開展將很有意義:

(1)探究異葒草素能否調控葡萄糖的運輸過程,驗證異葒草素能否調控AMPK、AKT其他下游通路,進而完善異葒草素調控糖尿病的作用機制;

(2)在動物模型中進一步探究驗證異葒草素調控糖尿病的分子機制,與體外實驗相輔相成,為臨床應用提供更有效的理論支持;

(3)探究異葒草素對糖尿病各種其他并發癥,如糖尿病神經病變、糖尿病足、糖尿病眼病的調控作用及其機理。