人體內耳冰凍切片免疫組織化學染色技術探討

李 穎 陳 彪 王乃利 郝欣平 *

[1.首都醫科大學附屬北京同仁醫院耳鼻咽喉頭頸外科，北京 100730；2.北京市耳鼻咽喉科研究所，耳鼻咽喉頭頸科學教育部重點實驗室(首都醫科大學)，鼻病研究北京市重點實驗室，北京 100005；3.中國醫學科學院基礎醫學研究所教學中心形態實驗室，北京 100005]

在對人內耳免疫機制的研究中，為盡可能保留組織抗原的完整性，需采用冰凍切片技術。但由于內耳為骨性結構，因此必須經過固定和脫鈣處理后，才能進行后續的切片步驟。由于甲醛固定液中的醛基與蛋白質中的氨基發生廣泛的交聯，而使抗原決定簇受到不同程度的掩蓋，影響抗體與相應抗原決定簇的特異性結合，采用適當的抗原修復方法，可有效地破壞醛基交聯，充分暴露抗原決定簇，提高抗原抗體結合的敏感性。又由于內耳的特殊骨性結構特點，且經過抗原修復等一系列免疫組織化學步驟，使得其冰凍切片較其他組織切片更容易出現脫片現象。為此，有效的防脫片處理和適當的抗原修復方法成為獲得最佳內耳冰凍切片免疫組織化學染色結果的關鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

1)研究對象：2019年4月至2019年9月期間，收集6例因病去世患者捐獻的尸檢顳骨標本，除了與年齡相關的變化外，沒有已知的耳科疾病，患者年齡57～90歲，平均年齡76.2歲。

2)主要試劑及儀器：兔多克隆抗WARP抗體(Abcam公司，美國)；鼠單克隆抗Neurofilament 200(NF200)抗體(Sigma公司，美國)；兔多克隆抗IBA1抗體(Invitrogen公司，美國)；鼠單克隆抗CD68抗體(Origene公司，美國)；FITC標記羊抗鼠IgG、羅丹明標記羊抗兔IgG(Abcam公司，美國)；含DAPI熒光封片劑(Abcam公司，美國)。IX81激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)；CM1850冰凍切片機(Leica公司，德國)。

1.2 實驗方法

1)組織處理及冰凍切片：在患者死亡6～23 h后對尸體進行顳骨標本取材，并用中性甲醛溶液進行灌注固定，灌注后繼續在甲醛溶液中浸泡3 d，固定結束后取出，自來水流水沖洗24 h。標本入10%(質量分數)乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，約1周后，電鉆磨小至只剩耳蝸及半規管，繼續脫鈣，并隔天換液，約40 d左右，針刺無阻力感，即脫鈣完成。標本入蔗糖液梯度脫水，最后入OCT膠4 ℃浸膠16～24 h。耳蝸用OCT膠平行于蝸軸方向包埋，液氮速凍，待OCT膠完全凝固取出，冰凍切片機切片，片厚8 μm，-20 ℃冷凍保存。

2)防脫片處理：取出切片，恢復室溫后，分為3組。Ⅰ組(后固定組)：入預冷的冷丙酮液中10 min，再入冷甲醇液中10 min進行后固定，取出風干15 min。Ⅱ組(烤片組)：放46 ℃烤片箱中，烤片1～2 h。Ⅲ組(后固定+烤片組)：入預冷的冷丙酮液中10 min后，取出風干15 min，再放46 ℃烤片箱中，烤片1～2 h。

3)抗原修復：將進行了防脫片處理的3組切片，每一組再分為A、B、C 3組(ⅠA、ⅠB、ⅠC、ⅡA、ⅡB、ⅡC、ⅢA、ⅢB、ⅢC共計9組)進行抗原修復。A組(熱修復組)：將切片放入已預熱的PH 8.0 EDTA抗原修復液中，58 ℃ 5 min。B組(酶消化組)：滴加0.1%(質量分數)胰蛋白酶，37 ℃20 min。C組(Triton組)：滴加0.2%(體積分數)Triton X-100，室溫10 min。

4)間接熒光免疫組織化學染色：將上述9組切片，每一組再分別用4種不同的抗體進行染色。切片入PBS浸洗3遍，入3%(體積分數)H2O2，室溫10 min，PBS洗3遍，用0.2%(質量分數)BSA[內含0.02%(體積分數)Triton X-100]封閉30 min，分別滴加一抗WARP 1∶30、NF200 1∶400、CD68 工作液、IBA1 1∶500，4 ℃孵育過夜，PBS洗3遍，分別滴加FITC標記羊抗鼠IgG 1∶100，或羅丹明標記羊抗兔IgG 1∶100相應熒光二抗，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗3遍，含DAPI封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、照相。

1.3 間接熒光免疫組織化學染色結果判定

激光共聚焦顯微鏡下觀察4種標記蛋白中，所有未脫落切片在3種抗原修復方法下的表達情況。同一標記蛋白在掃描參數相同的情況下，將圖像調至相對最清晰時進行40倍掃描獲取圖像。結合圖像的熒光強度及抗體結合的特異程度，對結果進行判定。

1.4 統計學方法

采用SPSS 16.0統計軟件對脫片程度進行統計分析，行χ2檢驗比較組間差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 脫片情況比較

防脫片處理的3組間比較，脫片數差異有統計學意義(P<0.01)。Ⅰ組(后固定組)和Ⅱ組(烤片組)比較，差異無統計學意義(P>0.05)。Ⅰ組和Ⅱ組分別與Ⅲ組(后固定聯合烤片組)比較，差異均有統計學意義(P均<0.01)。Ⅲ組的防脫片效果最佳，詳見表1、圖1。

抗原修復的3組間比較， 脫片數差異無統計學意義(P=0.05)。B組(酶消化組)除在Ⅲ組防脫片處理方法時只有少數切片出現局部脫片，在其余兩組防脫片處理方法時則大部分切片出現脫片現象。詳見表2、圖1。

表1 不同防脫片處理方法脫片數的比較Tab.1 Comparison of the number of slices falling off with different anti-slice escaping treatments

圖1 不同防脫片處理及抗原修復方法脫片數的比較Fig.1 Comparison of the number of slices falling off with different anti-slice escaping treatments and antigen retrieval methods

表2 不同抗原修復方法脫片數的比較Tab.2 Comparison of the number of slices falling off with different antigen retrieval methods

2.2 不同抗原修復方法的染色結果比較

1)WARP染色結果：A組(熱修復組)和C組(Triton組)在耳蝸血管及微血管上皮呈特異陽性表達，且A組較C組表達更特異、更清晰。B組(酶消化組)無陽性表達，且細胞核已變形(圖2)。

2)NF200染色結果：A組(熱修復組)和C組(Triton組)在耳蝸螺旋神經節細胞體及突起均呈陽性表達，且特異、清晰。B組(酶消化組)無陽性表達，且細胞核已變形(圖3)。

3)CD68染色結果：A組(熱修復組)和C組(Triton組)在耳蝸呈現細胞體和細胞突起中溶酶體成分的點狀染色，這些細胞的形態和位置與抗 IBA1 抗體的相似，陽性表達特異、清晰，但由于陽性細胞數較少，且不能完全染色細胞質，故較難判讀。B組(酶消化組)呈極少數陽性表達，且細胞核已變形(圖4)。

4)IBA1染色結果：A組(熱修復組)和C組(Triton組)在耳蝸呈現大量分枝或變形蟲(球體)樣陽性表達，且特異、清晰。B組(酶消化組)無陽性表達，且細胞核已變形(圖5)。

圖2 免疫熒光染色3種不同抗原修復方法的WARP染色結果Fig.2 Immunofluorescence staining images of WARP with three different antigen retrieval methods(40×)A： group A (heat repair group) ；B：group B (enzymatic digestion group)；C：group C (Triton group).

圖3 免疫熒光染色3種不同抗原修復方法的NF200染色結果Fig.3 Immunofluorescence staining images of NF200 with three different antigen retrieval methods(40×)A： group A (heat repair group) ；B：group B (enzymatic digestion group)；C：group C (Triton group).

圖4 免疫熒光染色3種不同抗原修復方法的CD68染色結果Fig.4 Immunofluorescence staining images of CD68 with three different antigen retrieval methods(40×)A： group A (heat repair group) ；B：group B (enzymatic digestion group)；C：group C (Triton group).

圖5 免疫熒光染色3種不同抗原修復方法的IBA1染色結果Fig.5 Immunofluorescence staining images of IBA1 with three different antigen retrieval methods(40×)A： group A (heat repair group) ；B：group B (enzymatic digestion group)；C：group C (Triton group).

3 討論

冰凍切片不經過乙醇脫水和二甲苯透明等過程，可使許多組織成分不受或少受影響。因此，冰凍切片不但省時簡便，而且特別適合于組織化學觀察。同時由于冰凍切片術可以獲取較大的組織切片，所以很適用于對整個顳骨的內耳形態學研究[1]。由于人顳骨標本較難獲得，所以之前的大部分相關研究都是基于動物顳骨標本。筆者結合既往的相關實驗經驗，并結合人顳骨標本的具體特點，對從標本的取材、固定、脫鈣到切片、染色等過程進行了試驗性研究，并對免疫熒光染色過程中，防脫片處理和抗原修復方法兩個關鍵步驟進行了探討。

在免疫熒光染色中，遇到的首要問題就是組織脫片問題。雖然切片時已應用黏附載玻片，但染色過程中還是會有較多切片出現脫片現象。怎樣才能減少已切好冰凍切片的脫片現象？筆者分別采取了應用冷丙酮及甲醇進行后固定和加熱烤片兩種防脫片處理方法，雖然脫片現象有所改善，但還是不太理想。于是，將兩種方法有機地結合起來，采用后固定聯合烤片法，取得了良好的效果，脫片現象明顯減少，并對不同防脫片處理和抗原修復方法的脫片數進行統計分析。不同防脫片處理方法間差異有統計學意義，Ⅲ組防脫片效果明顯優于Ⅰ組和Ⅱ組。不同抗原修復方法間差異無統計學意義，說明不同抗原修復方法對脫片情況無明顯影響。

丙酮和甲醇作為有機固定劑，其作用是沉淀蛋白質和糖，對組織穿透性很強，保存抗原的免疫活性較好。同時，丙酮和甲醇具有強大的脫水力,常用于冰凍切片及細胞印片和細胞涂片的后固定[2]，可將細胞固定在一定形態并保持細胞的活性，甲醇還可以增加細胞結構的表面積,提高細胞對染料的吸收，同時由于甲醇吸附染色液中的水,使染色液升溫,加速染色反應，所以常用在細胞染色前處理。加熱烤片的作用主要是迅速烤干切片上的水分，防止組織皺縮，以及在染色過程中不易掉片。在石蠟切片中如此，在冰凍切片中亦起到相同作用，只是需要將溫度適當調低，以減少對抗原的破壞。同時，切片質量的好壞也對脫片有至關重要的影響，切片要平整無皺褶，厚薄均勻才能減少脫片現象的產生。

由于標本已經過固定和脫鈣，為更好地暴露抗原決定簇，提高抗原抗體結合的敏感性，適當的抗原修復必不可少?？乖迯图夹g的發明主要歸功于生物化學家對蛋白質與甲醛化學反應的深入研究[3]。因為蛋白質分子與甲醛反應的復雜性，故難以找到一種適合所有組織抗原修復的方法 ，而抗原修復的主要機制是打開甲醛與蛋白質分子形成的交聯物。Yam-ashita 等[4]將抗原修復技術應用于甲醛固定的新鮮組織的冰凍切片，獲得了良好的免疫組織化學染色效果；Hasui等[5]用熱修復抗原法對成人外周血單核細胞的p53蛋白進行免疫組織化學染色 ，染色效果亦較好。筆者將免疫組化實驗中常用的3種抗原修復方法應用到本實驗中，并根據冰凍切片的特點，將熱修復的修復溫度調整為58 ℃，修復時間為5 min。觀察3種抗原修復方法的修復效果。

血管性血友病A結構域相關蛋白(von willebrand a domain-related protein, WARP)是一種細胞外基質分子，在軟骨中表達受限，是周圍神經、肌肉和中樞神經系統脈管系統中基底膜的一個子集；在人和小鼠的內耳中，WARP免疫反應描繪了位于血管紋、螺旋韌帶、基底下區、間質組織以及螺旋和前庭神經節的血管；此外，WARP 能夠描繪內耳中的微血管，從而可應用于研究耳科疾病發展中的血管病理學[6]。在生理情況下，耳蝸的螺旋韌帶、螺旋板、螺旋神經節和血管紋周圍血管存在免疫細胞[7-9]。Shi[10]發現內耳存在血管周圍常駐巨噬細胞，它具有免疫防御、組織修復及免疫監視功能，產生超氧化物陰離子和炎性因子，并清除入侵的病原體和衰老壞死的細胞。內耳的巨噬細胞包括駐留巨噬細胞和浸潤巨噬細胞(標記CD163+、IBA1+和CD68+)，其主要分布于耳蝸外側壁、骨螺旋板、螺旋神經元和感覺上皮等部位[9,11-13]。目前認為這些細胞屬于先天性免疫系統和適應性免疫系統[14]。CD68 是溶酶體標志物和小鼠大唾液酸蛋白的人類同源物，是小鼠巨噬細胞和小膠質細胞中的氧化低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotoin-cholosterol, LDL-C)結合蛋白。 大唾液酸和CD68包含在(溶酶體相關膜蛋白)糖蛋白家族中， CD68作為膜蛋白是氧化 LDL-C的清道夫或作為抗原呈遞系統的組成部分[12]。IBA1被稱為離子化鈣結合銜接分子1，據報道[12]是一種專門針對小膠質細胞的特異性鈣結合蛋白，它是與巨噬細胞和小膠質細胞吞噬作用相關的膜褶皺的關鍵參與者。具有不同形狀的巨噬細胞密集存在于成人耳蝸、聽覺神經和所有其他耳蝸組織中，在人類耳蝸的所有部分都有大量 IBA1表達細胞[15]。神經絲蛋白200(Neurofilament 200, NF200)是相對分子質量為200 000的神經纖維絲蛋白，在神經軸突中高表達，可用以標記神經元。NF200主要在神經細胞內合成、儲存，參與神經細胞胞體及軸突的構成，在維持神經細胞形態特征、軸漿運輸、神經再生等方面起著重要作用[16-18]。將上述分別標記血管、巨噬細胞和神經的4種抗原標志物應用到本研究中，A組(熱修復組)和C組(Triton組)均取得較好的抗原修復效果，陽性結果特異、清晰。而B組(酶消化組)均修復效果不佳，且細胞核形態異常，組織結構受損，易脫片。筆者嘗試將消化時間縮短，結果亦如此，推斷可能與脫鈣時間較長有關，據此，酶消化法不適用于此類實驗中。

綜上所述，本研究在人體內耳冰凍切片間接熒光免疫組化染色中，應用后固定聯合烤片法防止染色過程中脫片現象的產生，聯合應用熱修復法或Triton打孔法進行抗原修復，取得了良好的染色結果。但此兩種抗原修復方法只適用于本研究中的4種抗原標志物，對于一些較難染色的抗原標志物還可應用熱修復聯合Triton打孔法進行抗原修復，或對修復條件進行適當調整。應用適當的防脫片處理和抗原修復方法對提高內耳冰凍切片免疫組化染色的敏感性和制片質量起著至關重要的作用，可為內耳研究奠定實驗基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明李穎：提出研究思路，設計研究方案，實驗過程操作，撰寫論文；陳彪：標本取材；王乃利：標本提供；郝欣平：標本取材，冰凍切片，審定論文。