基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測黃甲軟肝顆粒抗肝纖維化作用及驗證研究

蔡 強 張 苗 黃朝情 張 榮 楊 蕾 王宗權(quán)

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)(廣州 510000)

2 北京盈科瑞藥物研究院有限公司(北京 100000)

3 盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司，國家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心新型遞藥系統(tǒng)分中心，廣東省霧化吸入制劑工程技術(shù)研究中心(珠海 519000)

肝纖維化是一種嚴重的健康問題，在全球范圍內(nèi)普遍存在且預(yù)后較差，可響應(yīng)幾乎所有引起慢性肝損傷的原因，包括酒精中毒、非酒精性肝脂肪性肝炎、慢性病毒性肝炎和自身免疫性疾病[1]。肝纖維化的特征是由于細胞外基質(zhì)產(chǎn)生和降解之間的不平衡，導(dǎo)致肝內(nèi)的沉積過多[2]。肝星狀細胞的激活已被確認為肝纖維化發(fā)展中的關(guān)鍵事件，它調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的大量生產(chǎn)和分泌[3]。肝纖維化被認為是可逆的病理生理過程，其晚期會導(dǎo)致肝硬化[4]、肝衰竭和門脈高壓，可能需要進行肝移植。肝纖維化的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)是預(yù)防和治療慢性肝病的關(guān)鍵步驟。當前，仍然沒有批準用于人類的有效抗纖維化藥物。因此，開發(fā)有效且安全的抗纖維化藥物并揭示其潛在機制至關(guān)重要。中藥由于其療效好，不良反應(yīng)少而在中國的臨床實踐中一直使用了數(shù)千年，已成為當前醫(yī)療體系中不可或缺的一部分[5]。臨床證明中醫(yī)在預(yù)防和治療肝纖維化和肝硬化方面具有獨特的功效和優(yōu)勢。

黃甲軟肝顆粒是純中藥復(fù)方制劑，來源于北京模式口中醫(yī)院劉源院長祖?zhèn)鞫嗄甑拿胤剑蠼?jīng)劉源院長幾十年臨床實踐總結(jié)而得。由黃芪、鱉甲、靈芝等10 味中藥組成。具有益氣舒肝，活血軟堅的功效。用于肝纖維化和早期肝硬化，脾虛肝郁，氣血瘀阻證。癥見脅肋刺痛或脹痛，食欲不振，脘腹脹滿，大便溏爛，神疲乏力，面色晦暗，舌暗，苔薄，脈弦。但目前尚未揭示黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的作用機制。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)和網(wǎng)絡(luò)分析的原理，由于各種生物信息學(xué)資源的迅速發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法已成功應(yīng)用于中藥有效成分及其分子機理的發(fā)現(xiàn)。因此，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的中藥研究值得探索。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化中的活性成分和作用機制，為黃甲軟肝顆粒減輕肝臟纖維化和恢復(fù)肝功能的功效機制研究提供一定的的方向。

1 材料與方法

1.1 黃甲軟肝顆粒活性成分的獲取及靶點刷選

查找相關(guān)中藥活性成分依托中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP數(shù)據(jù)庫：http://tcmspw.com/tcmsp.php)[6]收集黃甲軟肝顆粒全方中 10味中藥黃芪、鱉甲、葛根、柴胡、靈芝、赤芍、丹參、三七、雞骨草、葉下珠的化學(xué)成分，根據(jù)口服生物利用度和類藥性篩選，篩選閾值分別為口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18[7]。通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫尋找與活性成分相關(guān)的靶標蛋白，通過Unitprot數(shù)據(jù)庫(http://www.Unitprot.org/)查詢靶標蛋白所對應(yīng)的基因名稱，選擇人類的靶點蛋白，最終確定黃甲軟肝顆粒的活性成分及其對應(yīng)靶點。

1.2 肝纖維化靶點刷選

在OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、Disgenet數(shù)據(jù)庫[8]中輸入“Liver Fibrosis”，收集肝纖維化的相關(guān)靶點，將所得靶點取并集，并將重復(fù)項刪除，以得到肝纖維化的相關(guān)靶標信息。

1.3 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將所得活性成分對應(yīng)靶標蛋白與肝纖維化的相關(guān)靶點進行映射，即兩者取交集，得到黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的預(yù)測靶點，利用Cytoscape軟件構(gòu)建構(gòu)建“C(成分)-T(靶點)”作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 GO富集與KEGG通路富集分析

為了分析黃甲軟肝顆粒作用于肝纖維化的生物學(xué)過程和信號通路傳導(dǎo)過程，繼而進一步預(yù)測藥物機制，采用 DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)[9]對網(wǎng)絡(luò)中的靶點進行 GO 富集與KEGG通路富集。通過Omicshare(http://www.omicshare.com/tools/index.php/)對富集分析結(jié)果進行可視化處理。

1.5 SD大鼠體內(nèi)實驗驗證

1.5.1 實驗動物 雄性SD大鼠36只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供(實驗動物使用許可證號：SYXK(粵)2018- 0085；實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2018- 0034。

1.5.2 藥物與試劑 黃甲軟肝顆粒：盈科瑞(橫琴)藥物研究院有限公司；陽性對照藥為水飛薊素(純度>80%)；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(批號C0105)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒(批號C010- 2- 1)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)檢測試劑盒(批號C009- 2- 1)：南京建成生物工程研究所。

1.5.3 主要儀器 分析天平：梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；高速低溫離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；多功能酶標儀：PerkinElmer Cellular Technologies Germany GmbH；顯微鏡:日本Olympus公司。

1.5.4 動物實驗 實驗大鼠在標準環(huán)境溫度及濕度均適宜的SPF級動物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間每天日照12 h。適宜1周后，將大鼠隨機分成6組：對照組、模型組、水飛薊素組、黃甲軟肝顆粒低、中、高劑量組。每組6只。除正常組外，其余各組采用灌胃給予 20% CCl4橄欖油溶液(3 mL/kg)，正常組給予相應(yīng)橄欖油，每周2次，連續(xù)10周，誘導(dǎo)肝纖維化大鼠模型。于造模第2天起，給藥組分別灌胃給予相應(yīng)的受試藥物，水飛薊素組按照每日25 mg/kg的劑量灌胃給予水飛薊素，黃甲軟肝顆粒低劑量組按照每日1.16 g/kg的劑量灌胃給予黃甲軟肝顆粒，黃甲軟肝顆粒中劑量組按照每日2.32 g/kg的劑量灌胃給予黃甲軟肝顆粒，黃甲軟肝顆粒高劑量組按照每日4.64 g/kg的劑量灌胃給予黃甲軟肝顆粒，正常組和模型組分別灌胃給予相應(yīng)飲用水，每天1次，連續(xù)10周。末次給藥后，過夜禁食不禁水，大鼠麻醉后，腹主動脈取血，離心分離血清，-80 ℃保存。各組大鼠處死后取肝臟，稱取肝臟重量，切取肝臟大葉邊緣相同部位與4%多聚甲醛中固定，用于病理學(xué)觀察，其余部分分裝于凍存管，置-80 ℃保存。

1.5.5 肝臟指數(shù)的測定 肝臟指數(shù)：肝指數(shù)(%)=肝濕重/末次體質(zhì)量×100(%)。

1.5.6 血清AST和ALT的測定 血清直接取樣進行測定，按照AST和ALT試劑盒說明，采用微板法檢測血清中AST和ALT含量，評價各組大鼠肝功能。

1.5.7 大鼠肝臟組織病理學(xué)觀察 用4%多聚甲醛固定肝臟后，依次經(jīng)乙醇常規(guī)脫水、二甲苯透明，石蠟包埋，制備4 μm厚度病理組織切片，進行HE染色，觀察組織病理學(xué)。

1.5.8 數(shù)據(jù)分析 采用GraphPad Prism軟件進行Dunnett多重比較檢驗，統(tǒng)計分析結(jié)果以SEM均值表示，統(tǒng)計分析采用方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分與靶點獲取

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫收集黃甲軟肝顆粒的活性成分基本信息，以利用度≥30%和藥物相似度≥0.18%篩選，剔除掉未找到靶點的化學(xué)成分，得到活性化合物208個，其中黃芪 20個、鱉甲0個、葛根 4 個、柴胡17個、靈芝61個、赤芍29個、丹參65個、三七8個、雞骨草4個、葉下珠0個；相關(guān)靶標共2 398個，見表1。將活性成分和相關(guān)靶標綜合篩選保留唯一值，共搜集到117個活性成分，266個對應(yīng)靶點，利用Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-對應(yīng)靶點“網(wǎng)絡(luò)，見圖1。

圖1 “活性成分-對應(yīng)靶點“網(wǎng)絡(luò)

表1 黃甲軟肝顆粒“中藥-活性成分-相關(guān)靶標”信息

2.2 疾病靶點篩選結(jié)果

在OMIM數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫、GeneCards數(shù)據(jù)庫、Disgenet數(shù)據(jù)庫中檢索肝纖維化所得結(jié)果進行并集，刪除重復(fù)項，得到肝纖維化相關(guān)靶點6 398個。

2.3 “成分-靶點”構(gòu)建與結(jié)果分析

將所得到的黃甲軟肝顆粒的藥物靶點與肝纖維化相關(guān)靶點進行映射，得到161個共有靶點，對應(yīng)黃甲軟肝顆粒活性成分117個，利用Cytoscape軟件構(gòu)建的C(成分)-T(靶點)網(wǎng)絡(luò)見圖2。 靶點數(shù)排前10位的成分為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、木犀草素(luteolin)、7-O-methylisomucronulatol、甾醇(beta-sitosterol)、二氫丹參內(nèi)酯(dihydrotanshinlactone)、丹參酮IIA(tanshinone iia)、刺芒柄花素(formononetin)、糖甙(isorhamnetin)、4-亞甲丹參新酮(4-methylenemiltirone)，見表2，這些可能為黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的有效成分。靶點對應(yīng)基因排前10位的為PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AB1、ADRB2、NCOA1、SCN5A、HTR、CHRM1、RXRA，見表3，將映射所得的161個靶點利用String作PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3，上面所得到的前10個靶點均包含在主要靶點內(nèi)，表明這些基因可能為黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的關(guān)鍵基因。

圖2 “黃甲軟肝顆粒C(成分)-T(靶點)”網(wǎng)絡(luò)

圖3 “成分-靶點 PPI”網(wǎng)絡(luò)

表2 黃甲軟肝顆粒靶點數(shù)排名前10位成分信息

表3 靶點對應(yīng)基因的前10位

2.4 GO功能富集分析

采用 DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對網(wǎng)絡(luò)中的蛋白進行 GO 富集分析。GO 是為了統(tǒng)一表征所有物種的基因及基因產(chǎn)物的性質(zhì)而發(fā)起的生物信息學(xué)計劃，旨在建立一套適用于所用物種的、對基因和蛋白質(zhì)功能進行限定和描述并能隨著研究不斷深入而更新的語義詞匯標準。GO 有 3 個分類：(1)分子功能，描述基因產(chǎn)物在分子生物學(xué)上的活性；(2)生物學(xué)過程，指由分子功能有序組成的，具有多個步驟的過程；(3)細胞組分，指基因產(chǎn)物位于何種細胞器或基因產(chǎn)物組中，表明基因產(chǎn)物在什么地方起作用。通過根據(jù)顯著性程度P<0.05(P值由小到大)，GO 分析共包含 960條富集結(jié)果，其中生物過程相關(guān)的條目最多，有845個，主要涉及細胞凋亡的調(diào)控、抗凋亡、抗炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生、NF-κB通路調(diào)控、MAPK通路調(diào)控、激活蛋白激酶活性、調(diào)節(jié)白介素12的產(chǎn)生、誘導(dǎo)細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫球蛋白的分泌、調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)化生長因子β受體信號通路、過氧化物酶活性等。通過文獻查詢，選出與之相關(guān)性較多的，通過Omicshare對分析結(jié)果進行可視化處理，見圖4。

圖4 GO功能富集分析圖

2.5 KEGG分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行通路富集分析。在 DAVID 的基因列表通用管理面板中復(fù)制粘貼基因列表，選擇基因名稱對應(yīng)的基因標示符“ OFFICIAL_GENE_SYMBOL”，提交基因列表；為所提交的基因列表選擇對應(yīng)的物種“Homo Sapiens”，背景也選擇“Homo Sapiens”，即以人類全基因組為背景基因和參照集合，獲得通路富集結(jié)果。對篩選出的核心靶點蛋白進行 KEGG 通路富集分析，共獲得 87條富集結(jié)果。根據(jù)顯著性程度P<0.05(P值由小到大)，篩選出69條通路在肝纖維化方面具有作用。其中前20條通路為乙型肝炎、膀胱癌、胰腺癌、TNF信號通路、前列腺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、恰加斯病(美國錐蟲病)、破骨細胞分化、慢性粒細胞白血病、Toll樣受體信號通路、弓形蟲病、T細胞受體信號通路、甲型流感、丙型肝炎、百日咳、膠質(zhì)瘤、HTLV-Ⅰ感染、NOD樣受體信號通路、結(jié)核。其結(jié)果見圖5。其中，Y 軸代表通路名稱，X 軸代表基因數(shù)(count，即目標基因中屬于這個通路的基因的數(shù)量)，氣泡顏色代表富集顯著性，即P值的大小。在69條通路中近期研究新型熱點通路包括ErbB信號通路、胞質(zhì)DNA傳感途徑、Rap1信號通路等。

圖5 KEGG通路富集分析

2.6 動物實驗初步驗證

2.6.1 大鼠體重與肝臟指數(shù) 實驗結(jié)束末，與正常對照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量增長明顯較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，給藥組中水飛薊素組和黃甲軟肝中、高劑量組體重增加，且高劑量組具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。與正常對照組相比，模型組大鼠肝臟指數(shù)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，水飛薊素組、黃甲軟肝顆粒各劑量組的肝臟指數(shù)顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，表明黃甲軟肝顆粒具有很好的改善肝臟指數(shù)作用(見圖6)。

圖6 黃甲軟肝顆粒對肝纖維化大鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)的影響(n=6)

2.6.2 黃甲軟肝顆粒對大鼠肝功能的影響 與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT和AST活性顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，水飛薊素組和黃甲軟肝顆粒各劑量組大鼠血清中ALT和AST的水平顯著降低(P<0.05)，提示黃甲軟肝顆粒具有改善大鼠肝功能的作用，見圖7。

圖7 黃甲軟肝顆粒對肝纖維化大鼠血清中ALT和AST的影響 (n=6)

2.6.3 大鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)結(jié)果 正常大鼠肝臟組織切片顯示肝中央靜脈及周圍肝細胞結(jié)構(gòu)正常。在CCl4處理的大鼠中，觀察到氣泡性變異增多、炎癥細胞浸潤、纖維狀等變化，證明肝纖維化建立成功。而黃甲軟肝組和水飛薊素組可有效緩解病變，氣泡性變異明顯減輕，炎癥細胞浸潤減少，提示給藥組肝纖維化呈現(xiàn)很好的好轉(zhuǎn)，見圖8。

圖8 黃甲軟肝顆粒對肝纖維化大鼠肝組織病理的影響

3 討 論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，探討了黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的作用網(wǎng)絡(luò)與潛在機制，研究顯示，黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的可能關(guān)鍵成分10個，為槲皮素、山柰酚、木犀草素、7-O-methylisomucronulatol、甾醇、二氫丹參內(nèi)酯、丹參酮IIA、刺芒柄花素、糖甙、4-亞甲丹參新酮，關(guān)鍵靶點10個，為PTGS2、PTGS1、NCOA2、HSP90AB1、ADRB2、NCOA1、SCN5A、HTR、CHRM1、RXRA，GO與KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，主要通路為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、MAPK活性、誘導(dǎo)細胞凋亡、ErbB信號通路、VEGF信號通路、胞質(zhì)DNA傳感途徑、Rap1信號通路等。

肝纖維化是肝組織抗損傷的修復(fù)過程，早期對肝組織的損傷修復(fù)有重要的防御作用。因此，在肝纖維化發(fā)生的早期階段，此時以病因治療及抗炎保肝治療為主，進展期和顯著肝纖維化期以及肝硬化期時需要進行抗肝纖維化治療。慢性炎癥反應(yīng)是纖維化形成的前提及進展的驅(qū)動力，抑制肝臟炎癥、肝細胞保護和抗氧化是抗肝纖維化的重要措施[10- 11]。 從圖1中可以發(fā)現(xiàn)黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化中包括IL- 1β、IL- 6、IL- 2、 TNF、IL- 4、IL- 10、PTGS1、PTGS2等因子，這些都是在炎癥中起到主要作用的炎癥細胞因子，說明炎癥與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。

目前，肝活檢組織病理學(xué)檢查是肝纖維化診斷的“金標準”[12]，血清中 AST和ALT可以反映肝細胞的損傷情況，兩者比值與肝纖維化程度、肝功能損傷之間密切相關(guān)[13]，而肝臟指數(shù)可作為大體確定肝臟病變程度的參考[14]。本次體內(nèi)動物實驗，通過肝臟指數(shù)、血清中ALT和AST指標、肝組織病理學(xué)比較，水飛薊素組和黃甲軟肝顆粒各劑量組對肝纖維化均有一定的改善作用。

在本階段，我們通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化進行了系統(tǒng)分析，初步揭示了黃甲軟肝顆粒治療肝纖維化的潛在活性成分、作用靶點和潛在作用機制；通過動物實驗初步驗證，黃甲軟肝顆粒可改善CCl4致肝纖維化大鼠的體重、肝臟指數(shù)和血清生化指標，減輕大鼠肝病理損傷，說明黃甲軟肝顆粒對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化具有很好的保護作用。我們后續(xù)將系統(tǒng)地進行動物實驗進一步證實其功效，并對其機制進行驗證。